Adım büyüme PEG-peptid Hidrojeller kaynaktan β-hücre sferoidlerin Üretimi ve Kurtarma

Bu prosedürün genel amacı, foto polimerize hidrojellerde hücrelerin kapsüllenmesi için tekniklerin yanı sıra, biyolojik karakterizasyondan enzime duyarlı hidrojellerden doğal olarak oluşan beta hücrelerinin pH'ının daha sonra geri kazanılmasını göstermektir. Bu, önce mins altı beta hücresinin bir önkol mandalı, norbertine macer ve bir enzime duyarlı peptit çapraz bağlayıcı ile karıştırılmasıyla gerçekleştirilir. Hücreler daha sonra bir hidrojel oluşturmak için serbest radikal aracılı ve ardından foto polimerizasyonlar kullanılarak kapsüllenir.

İkinci adım, 37 santigrat derecede bir karbondioksit inkübatöründe hidrojeller içindeki kapsüllenmiş hücreleri kültürlemektir. Hücreler agregalar oluşturmak üzere çoğaldıktan sonra, hücre yüklü hidrojeller tampon çözeltisi ile durulanır ve daha sonra chia tripsin çözeltisi içinde inkübe edilir. Jel erozyonu için hafifçe çalkalama altında, daha sonra geri kazanılan agregalar, enzim çözeltisini ve aşınmış polimeri çıkarmak için dikkatlice yıkanır.

Sonuç olarak, bu hücre agregaları yapısal ve fonksiyonel analiz için kullanılabilir. Bu nedenle, basamak büyümesinin ve ardından fotokimyanın ana avantajı, reaksiyon koşullarının geleneksel zincir büyümesi PEG dde'den daha hafif olmasıdır. Bu nedenle, thine hidrojeller, pankreas beta hücreleri de dahil olmak üzere birçok hücre tipi için mükemmel bir mikro ortam sağlar.

Bu tekniğin anlamı, çeşitli hücre bazlı tedavilere kadar uzanır, çünkü bu DIN sistemi, in vitro deneyler için mükemmel bir mikro ortam ve hücre iletimi için harika bir platform sağlar. Bu deneylerde kullanılan peptitleri laboratuvarımızda sentezlerken, tarif ettiğimiz peptit çapraz bağlayıcıların elde edilebileceği birçok firma bulunmaktadır. Bu işleme başlamak için, rimer tamamen çözülene kadar karışımı girdapta girdapta %20'lik bir PEG dört NB çözeltisi hazırlayın.

Daha sonra Kermer solüsyonunu sterilize etmek için bir şırınga filtresinden geçirin ve Eloqua'yı ihtiyaç duyulana kadar eksi 20 santigrat derecede saklayın. Daha sonra, PBS'de foto başlatıcı lityum arol fosfonatın% 2'lik bir çözeltisini hazırlayın. Foto başlatıcı solüsyonu bir şırınga filtresinden geçirin ve sterilize edilmiş solüsyonu ışıktan korunarak oda sıcaklığında saklayın.

Diğer bir hazırlık adımı, krizine duyarlı peptit çapraz bağlayıcının PBS'de çözülmesi ve şırınganın sterilizasyon için çözeltiyi filtrelemesidir. Ekstra alikotlar eksi 20 santigrat derecede saklanır. Üreticinin protokolüne göre elman reaktifini kullanarak hazırlanan peptit çözeltisindeki Sulf hidro grup konsantrasyonunu belirleyin.

Daha sonra, steril bir mililitre tek kullanımlık şırıngaların üst bir santimetrelik kısmını keserek asyon kalıplarını hazırlayın. Bir tıraş bıçağı kullanarak şırınga kalıpları yeniden sterilize edildi. Bir otoklav kullanarak, polimer peptit, çapraz bağlayıcı, foto başlatıcı ve bir tampon çözelti dahil olmak üzere stok malzemelerinin hacmi ve konsantrasyonu dahil olmak üzere istenen jel formülasyonunun hesaplamalarını içeren bir elektronik tablo hazırlayın.

İlk ön ısıtma hücre kültürü, orta hank'ın dengeli tuz çözeltisi ve EDTA'da 37 santigrat dereceye kadar iki x gezi. Daha sonra, inkübatörden en az altı beta hücresinin şişelerini çıkarın ve bunları laminer akış başlığına yerleştirin. Hücre kültürü ortamını şişelerden aspire ettikten sonra, hücreleri ön ısıtma tankları ile durulayın, tuz çözeltisini dengeleyin.

Daha sonra deneyin hücreleri üç mililitre ön ısıtma, EDTA'da iki x açma kullanarak buzlayın ve şişeleri dört dakika inkübe edin. İnkübasyondan sonra, hücreleri tamamen ayırmak için davlumbazın yüzeyindeki şişeleri hafifçe vurun. Mikroskop altında hücrelerin ayrılmasını ve ayrışmasını onaylayın.

Ardından, eşit hacimde hücre kültürü ortamı ekleyin. Tripsini nötralize etmek için, çözeltiyi hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyerek iyice karıştırın. Daha sonra karışımı steril bir konik tüpe aktarın, santrifüjlemeyi takiben 200 RCF'de hücre süspansiyonunu beş dakika santrifüjleyin, süpernatanı aspire edin ve hücreleri dört ila beş mililitre ön ısıtma kültüründe nazikçe yeniden süspanse edin. Medya.

Son olarak, hücre süspansiyonunun bir kısmını %50 trian mavisi ile karıştırarak ve hücreleri bir hemo sitometre ile sayarak hücre yoğunluğunu belirleyin. Hücreler hazır olduğunda, gerekli hacimlerde PEG dört ve B peptit çapraz bağlayıcı foto başlatıcıyı, bire bir TH - EEN oranına dayalı bir mikro santrifüj tüpünde bir milimolar hücre ve HBSS'nin son konsantrasyonunda karıştırın ve pipetleme ile nazikçe karıştırın. Bu gösteride A, %4, PEG dört ve B kullanılmıştır.

Daha sonra, elde edilen çözeltiden 25 mikrolitreyi her bir şırınga kalıbına pipetleyin. Şırınga kalıplarını iki dakika boyunca santimetre kare başına beş miliwatt gücünde 365 nanometre UV ışığına maruz bırakın. Foto polimerizasyonu takiben jeli polimerize etmek için, jelleri bir mililitre hücre kültürü ortamı içeren steril 24 oyuklu bir plakaya daldırın ve hidrojelleri 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte 30 dakika boyunca inkübe edin.

30 dakika sonra, plakayı inkübatörden çıkarın ve jelleri bir mililitre taze ortama aktarın. Medyayı her iki ila üç günde bir yenileyin. Tripsin içermeyen alfa chimi tripsin'e Hanks dengeli tuz çözeltisi ekleyerek mililitre enzim çözeltisi başına bir miligram hazırlayın.

Ardından karışımı bir şırınga filtresi ile sterilize edin. Daha sonra, kültür plakasını inkübatörden çıkarın ve jelleri Hank'in denge tuzu çözeltisiyle durulayın. Daha sonra, her bir kuyucuğa 500 mikrolitre zil tripsin çözeltisi ekleyin, sonraki oda sıcaklığında, tam jel erozyonunun elde edilmesi için yaklaşık beş ila 10 dakika boyunca bir çalkalayıcı üzerinde hafifçe çalkalayın.

Jel tamamen ayrıştıktan sonra, CH tripsinin aktivitesini azaltmak için plakayı birkaç dakika buzun üzerine yerleştirin. Bir sonraki adım, hücre süspansiyonunu bir mililitrelik bir tüpe aktarmak ve iki dakika boyunca 45 RCF ve dört santigrat derecede yavaşça santrifüjlemektir. Santrifüjlemeyi takiben, bir PEI pipeti kullanarak süpernatanı dikkatlice çıkarın ve steroidi Hank'in denge tuzu çözeltisinde nazikçe süspanse edin.

Daha sonra geri kazanılan steroid çözeltisini yeni bir 24 oyuklu plakaya aktarın ve steroidin çökelmesine ve boyut analizi için yüzeye yapışmasına izin vermek için plakayı beş ila 10 dakika boyunca buz üzerine yerleştirin. Bir ışık mikroskobu kullanarak yerleşmiş sferoidlerin faz kontrast görüntülerini elde edin, Nikon eleman yazılımı veya görüntü J gibi bir yazılım kullanarak geri kazanılan sferoid çaplarını ölçün. Bu kapsülleme yöntemi, canlı ölü boyama ile ölçüldüğü gibi yüksek başlangıç hücre canlılığı sağlar. Hücre kültüründe zamanla, alamar ile ölçülen hücre metabolizması, mavi reaktifler, incelenen tüm konsantrasyonlarda 10 günlük bir süre boyunca artmıştır.

Hücre kültüründe 10 gün sonra, steroidlerin boyutu arttı ve hala yüksek hücre canlılığını korudu. Hidrojellerde, PEG peptit hidrojeli, kültürde 10 gün sonra burada gösterilen kapsüllenmiş beta hücrelerinin hayatta kalmasını ve çoğalmasını destekledi, alfa şim tripsin ile somatik iyileşmede, steroidleri hidrojel matrisinden serbest bırakır ve matris konsantrasyonundan bağımsız steroid boyutlarının dar bir dağılımını üretir. Bu steroidler daha sonra bu prosedürü denerken ek karakterizasyonlar ve uygulamalar için kullanılabilir.

Hücrelerin iyi dağılmasını sağlamak için kapsülleme sırasında ön polimer çözeltisinde homojenliği korumak önemlidir. Bu prosedürü takiben, geri kazanılan hücreler, hidrojel matris durumunun hücre protein ekspresyonu ve fenotipi üzerindeki etkisini incelemek için tüm mount immün boyama ve western blot gibi diğer teknikler kullanılarak karakterize edilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, hücrelerin hidrojellerde nasıl kapsülleneceği ve ek biyolojik karakterizasyonlar için hücrelerin jellerden nasıl geri kazanılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.