Bir Zebra balığı Otokton Tümör Modeli kullanılarak Melanom Değiştiricileri için Tarama

Aşağıdaki deneyin genel amacı, bir zebra balığı otojen tümör modeli kullanarak melanom değiştiricileri taramaktır. Bu, melanositlerin ilgilenilen bir geni ifade ettiği ve balıkların melanoma yatkın olduğu transgenik hayvanlar yaratarak elde edilir. Bir sonraki melanom başlangıcı, ilgilenilen genin tümör başlangıcını değiştirip değiştirmediğini değerlendirmek için puanlanır.

Daha sonra, ilgilenilen genin melanomlar ve pre-malign melanositler üzerindeki herhangi bir ek etkisini belirlemek için tümör invazyonu ve hücre spesifik testler yapılır. Son olarak, ilgilenilen genin yerleşik tümörlerde melanom başlatan hücrelerin sıklığını nasıl etkilediğini ölçmek için melanom hücreleri nakledilir. Sonuçlar, bir aday genin, başlangıç invazyonu ve nakil yeteneği dahil olmak üzere melanositlerin ve melanomların çeşitli özelliklerini nasıl etkilediğini göstermektedir.

Bu tekniğin, aday kanser genlerini araştırmak için germ hattı transgenezi gibi mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, zamandan, emekten ve masraftan tasarruf edilmesi ve tahlil ile verimin arttırılmasıdır. Çan transgenik hayvanlarda tümörojenezin çeşitli yönleri Bu prosedürü göstermek, laboratuvarımda bir yüksek lisans öğrencisi olan sherania agar olacak Enjekte etmek için yapılar oluşturmak. PCR ile ağ geçidi orta giriş klonları oluşturarak, ilgilenilen genlerin tam uzunlukta açık okuma çerçevesini yükselterek ve P don R 2 21'de yeniden birleştirerek başlayın.

Daha sonra, ilgilenilen genleri mifa promotörün kontrolü altına yerleştirmek için melanosit spesifik mifa promotör genini ve poliadenilasyon sinyalini mini Cooper vektörüne yeniden birleştirmek için çok bölgeli ağ geçidi teknolojisini kullanın, her klonun 25 pikogramını enjekte edin, 25 pikogram TOL ile birlikte iki mRNA'yı bir hücreli transgenik üçlü homozigot zebra balığı embriyolarına aktarır. Mifa BRAF FP 53. Mutant hayvanlar melanosit eksikliğine sahiptir ve dönüşüme ve melanom oluşumuna eğilimlidir.

İlgilenilen gen ile birlikte. Mini Cooper vektörü, kurtarıcı bir MVA mini geni içerir. Bu yüzden başarılı bir şekilde enjekte edilen hayvanlar, ilgilenilen geni ifade eden kurtarılmış melanositler geliştirecektir.

Enjekte edilen embriyoları döllenme veya HPF'den 24 saat sonra 28.5 santigrat derecede inkübe edin. Döllenmeden 72 saat sonra, beyaz bir arka plana karşı gelen ışık altında bir diseksiyon mikroskobu kullanarak ölü embriyoları çıkarın. Kurtarılan melanositleri olan transgenik hayvanları seçin.

Hayvanlar döllenmeden dört gün sonrasına ulaştığında, onları zebra balığı tesisinin fidanlığındaki üç litrelik tanklara aktarın. İki aylıkken, en az bir melanosit kurtarma alanı dört milimetre kareden daha büyük olan hayvanları seçin. Seçilen hayvanları tümörlerin varlığı açısından haftalık olarak tarayın.

Çalışma için tümör taşıyan hayvanları izole edin. Absada haftalar içinde yaşla birlikte melanomsuz sağkalım eğrileri ve ordinatta melanomsuz sağkalım yüzdesi çizin. EGFP ve melanosit eksprese eden hayvanları kontrol etmek için ilgilenilen bir geni ifade eden melanositli hayvanları karşılaştırın.

İki eğrinin istatistiksel olarak farklı olup olmadığını belirlemek için bir günlük sıralama testi kullanın. Tümör invazyon testi yapmak için. Arka beynin arka sınırı ile sırt yüzgecinin ön sınırı arasındaki bir bölgede dorsal olarak tümör geliştiren izole zebra balıklarını seçerek başlayın.

Melanom başlangıcından iki hafta sonra, balığı parafine sabitleyip gömdükten sonra balığı ötenazi yapmak için trica kullanın. Lezyonlardan beş mikrometre enine kesit yapın. Bir. Her 50 mikrometrede bir lezyon tüm lezyonu keser, böylece en derin istila noktası tanımlanabilir.

Bölümleri boyamak için hematin ve eoin kullanın. Tümör hücrelerinin kollajen stratumun dışında kalıp kalmadığını, dorsal kas sistemine kompaktif, istila edip etmediğini veya omurgaya daha fazla invaze edip etmediğini ölçerek tümör invazyonunu değerlendirin. İmmüno boyama yapmak için iki numune seti arasındaki istatistiksel farkı belirleyin.

Balıkları, diseksiyon mikroskobu altında gelen ışıkla mililitre trica başına 0.17 miligram olarak uyuşturun. Sırt pullarını koparmak için keskin ince uçlu forseps kullanın. Ölçeğin yarısını içeren melanositlere zarar vermemeye özen gösterin.

Ölçekleri doğrudan forsepsten bir mililitre fiksatife yerleştirin ve iki saate eşit veya daha uzun süre çevirirken oda sıcaklığında inkübe edin. Balıkları balık suyuna aktarın ve pigmentli melanositleri ağartmak için başarılı bir şekilde geri kazanımı doğrulamak için balığı izleyin. İlk olarak, PBST'de sabit terazileri oda sıcaklığında beş dakika boyunca iki kez yıkayın.

Daha sonra, bir mililitre taze yapılmış çamaşır suyu çözeltisi ekleyin ve gazın tüpleri patlatmasını önlemek için parfüm veya kapak kilitleriyle örtün. Pigment gidene kadar ağartmaya devam edin. Daha sonra oda sıcaklığında beş dakikada dört kez PBST'de yıkayın.

Blok çözelti içinde en az 30 dakika inkübe edin, daha sonra yaklaşık 400 mikrolitre birincil antikor ve gece boyunca blok çözelti ile inkübe edin Ertesi gün oda sıcaklığında, pulları oda sıcaklığında PBS'de 30 dakika boyunca üç kez yıkayın, ikincil antikor ile iki saat ila gece boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. DPI ile ayakta durduktan sonra, bir cam slayta bir damla vektör kalkanı uygulayın ve ölçekleri, ölçeklerin içbükey tarafı slayta bakacak şekilde monte edin. Numunelerin üzerine bir cam kapak kılıfı yerleştirin.

Kenarları kapatmak için şeffaf oje kullanın ve slaytları floresan mikroskop altında gözlemleyin. Yayılan bir alıcıdan sonra, transplantasyondan bir gün önce 25 gri gama ışınlaması ile iki ila üç aylık Casper balığı. Balığın balık suyunda iyileşmesine izin verin.

Tümör taşıyan bir balığı ötenazi yapmak için trica kullanın, tümörü kesin ve yaklaşık beş mililitre filtreyle sterilize edilmiş bir Petri kabına koyun, sterilize edilmiş 0.9 XPBS% 5 FBS ile çözelti içindeyken tümörü bir jiletle zar atın, oda sıcaklığında çalışırken ve tek hücreler üretmek için bir P 1000 pipet yinelemesi ile. Hacmi 25 mililitreye getirin. Çözeltiyi 40 mikrometrelik bir ağ filtresinden süzün ve 10 dakika boyunca 453 RCF'de bir masa üstü santrifüjde döndürün.

Peletleri %0,9 PBS, %5 FBS'de istenen konsantrasyona yeniden askıya alın. Bir hemo sitometre kullanarak, tam hücre sayısını hesaplayın ve hücre süspansiyonunu, son enjeksiyon hacmi yaklaşık beş mikrolitre olacak şekilde seyreltin. Örneğin, 50.000 hücre enjekte edilecekse, hücre süspansiyonu mikrolitre başına 10.000 hücrelik bir nihai konsantrasyona seyreltilmelidir.

Hücrelerin %100 etanol ve 0.9 XPBS ile topaklanmasını önlemek için hücre süspansiyonunu içeren tüpü birkaç dakikada bir hafifçe vurun. Şırıngayı beş mikrolitre hücre süspansiyonu ile doldurmadan önce 26 s gauge konik uçlu 7 0 1 ve 10 mikrolitre Hamilton şırıngayı iki ila üç kez yıkayın. Işınlanmış alıcı balığı trica'da uyuşturduktan sonra, nemli bir Kim mendili üzerine yan yatırın.

Balığı bir elinizle sabitleyin ve iğneyi, eğim yukarı bakacak şekilde 45 derecelik bir açıyla balığın periton boşluğunun üzerindeki yan tarafına sokun. Arka beynin arka sınırı ile sırt yüzgecinin ön sınırı arasında yaklaşık yarısı. Pistona hafifçe bastırın.

Balığın taze balık suyunda iyileşmesine izin verin ve balıkları tümör aşılaması için günlük olarak gözlemleyin. Aşılama meydana gelmişse, devam eden büyüme ve hastalık gelişimi de gözlemlenebilir. Tek hücreli BRAF FP 53 MIFA zebra balığı embriyolarına, burada gösterildiği gibi, MFA promotörünün, her biri bir veya EGFP olan melanom onkogen seti DB'yi veya EGFP'yi içeren mini Cooper vektörü enjekte edildi.

Yetişkinler için tümör insidans eğrileri, burada görüldüğü gibi, SET DB one'ın EGFP kontrolüne kıyasla melanom başlangıcını önemli ölçüde hızlandırdığını ortaya koydu, hematin ve EOSIN boyama, SET DB one'ı eksprese eden melanomların EGFP kontrol melanomlarından daha lokal olarak daha invaziv olduğunu göstermektedir. Bu şekil, tümörün nakil yeteneğini değerlendirmek için nükleer lokalize mifa transkripsiyon faktörünü tanıyan bir antikorla boyanmış ağartılmış veya ağartılmamış zebra balığı sırt pullarını göstermektedir. Melanom hücreleri, mini kap R-E-G-F-P 50, 000 hücre enjekte edilen bir BRAF FP 53 mifa balığından izole edildi, burada iki haftalıkken görülebileceği gibi, bir gün önce 25 gri ile ışınlanmış bir alıcı Casper mutantına deri altından enjekte edildi.

Pigmente donör kaynaklı hücreler kolayca tanındı. Bu nedenle, geliştirilmesinden sonra, bu teknik, kanser biyolojisi alanındaki araştırmacıların, zebra balığı kullanarak melanomla ilişkili genetik değişikliklerin işlevsel sonuçlarını incelemelerinin yolunu açtı. Bu videoyu izledikten sonra, bir zebra balığı oto tümör modeli kullanarak melanom değiştiricilerinin tahlil ile nasıl taranacağını, tümör başlangıç invazyonundaki farklılıkları, gen ekspresyonunu ve nakil yeteneğini iyi anlamış olmalısınız.