Alkole bağlı C57BL Hamilelik sırasında Apoptoz / 6 Fare Karşı, Nörotrofik Peptit, ADNF-9 Etkilerinin Test için Deneysel Yöntemler

Bu prosedürün amacı, fetal alkol maruziyet modelinde trofik peptitlerin nöroprotektif etkilerini değerlendirmektir. Bu, önce deney hayvanlarının çiftleştirilmesi ve daha sonra hamile dişilerin trofik peptitlerle tedavi edilmesiyle elde edilir, ikinci adım olarak, fetüsler deneysel kullanımlar için fetal beyinleri izole etmek için diseke edilir. Daha sonra, fetal beyinler kesit almak için jelatin içine gömülür, ardından hücre ölümü sonuçlarını belirlemek için tünel boyama yapılır.

Bu, doğum öncesi alkol maruziyetinin ganglionik üstünlükteki tünel pozitif hücrelerin sayısını artırdığını gösterir. Trofik peptidin kontrol grubu uygulamasıyla karşılaştırıldığında, bir D ve F dokuz, kontrol alkolü ile tedavi edilen hayvanlara kıyasla tünel pozitif hücrelerde alkolün neden olduğu artışı önemli ölçüde azalttı. Bu nedenle, bu metalin görsel gösterimi kritik öneme sahiptir, çünkü fetal beyin diseksiyonu ve gömülü adımların öğrenilmesi zordur, çünkü fetal beyinlerin parçalara ayrılması ve bölümlere ayrılması için işlem yapılması çok küçüktür Birinci cins C 57 siyah altı fareyi, yaklaşık 20 gramlık altı haftalık dişi fareleri, çıkarıldıktan hemen sonra iki saat boyunca erkek ev kafeslerine yerleştirerek.

Çiftleşmenin gerçekleştiğini doğrulamak için her dişide bir sperm tıkacı olup olmadığını kontrol edin. Bir sperm tıkacı varsa, o zaman bu embriyonik günü E yedi ağırlık maçında sıfır hamile kadınları dört gruba ayırın. Bir alkol sıvı diyet grubu, tek besin kaynağı olarak ücretsiz erişim sağladı.

Alkol maruziyetinin yanı sıra bir DNF dokuz peptidin intraperitoneal enjeksiyonunu alması gereken iki Perfed kontrol grubu üç peptit tedavi grubu. Sıvı diyet. Hayvanlar tarafından 24 saat içinde tüketilen sıvı diyet hacmini, tek besin kaynağı olarak serbest fazlalık yoluyla sağlanabilecek günlük alkol, sıvı diyet veya eşleştirilmiş sıvı diyet miktarını belirlemek için 30 mililitre dereceli vidalı kapaklı tüplerden kaydedin.

Hamile Myer E 13'ü karbondioksit ötenazi ve ardından servikal çıkık ile feda ettikten sonra taze hazırlanmış sıvı diyetin günlük olarak E yediden E 13'e kadar sağlandığından emin olun. Karkası diseksiyon tahtasına sırtüstü pozisyonda yerleştirin ve karnı% 70 etanol ile temizleyin. Karın kesisi yapmak için steril makas ve forseps kullanın.

Karın açıldıktan sonra, uterusu forseps ile tutun ve embriyoları delmeden endometriyumu uterustan yavaşça ve nazikçe koparmak için ikinci bir forseps kullanın. Embriyoları uterustan dikkatlice çıkarın ve bunları Hank'in denge sıralama çözeltisine aktarın Islak buz üzerinde 60 milimetreye 15 mililitrelik bir hücre kültürü kabında, tabağı ve buz kabını, mikrodiseksiyon için ultra ince forseps kullanarak bir stereo mikroskop sahnesine yerleştirin. Kafatasını ortaya çıkarmak için başın üst kısmındaki embriyoların derisini çekin.

Kafatası açığa çıktıktan ve stereo mikroskop altında net bir şekilde görüntülendikten sonra, kafatasının tabanını forseps ile omurilik ve beyin sapı seviyesinde kavrayın ve kafatasını soymaya başlayın. Kafatasını başın arka kısımlarından ön kısımlarına doğru parça parça soymaya devam edin. Beyin tamamen açığa çıktığında, onu çıkarmak için forseps kullanın.

Daha sonra fetal beyni, ilkel veya fabrika ampulünün tabanından Met Postfix'in tabanına kadar inceleyin, tüm disseke edilmiş fetal beyinleri iki ila üç gün boyunca% 4 paraldehitte inceleyin. Fetal beyinler, western blot veya enzimatik tahliller için test edilirse de dondurulabilir. Damıtılmış suda hazırlanan% 10'luk bir A sınıfı jelatin çözeltisi hazırladıktan sonra, bir soyulmuş gömme kalıbını yarıya kadar doldurun ve jelatin katılaşana kadar bekleyin.

Kontrolü ve doğum öncesi tedavi edilmiş fetal beyinleri katılaşmış jelatinin üzerine yan yana yerleştirin. Bu, hem kontrol hem de deney grupları arasında tutarlı koşulları korumak içindir. Jelatinin çok sıcak olmadığından emin olun ve tam bir kalıp oluşturmak için fetal beyinlerin üzerine sıvı jelatin ekleyin.

Son kalıp bu görüntüye benzemeli, fetal beyinleri 15 dakika tutan hazırlanmış jelatin kalıbı soğutun. Ardından, gömme kalıp plastiğini soyun. Son kalıp bu şekilde görünmeli ve daha sonra jelatin içeren fetal beyinleri iki gün boyunca% 4 paraldehit içine aktarmalıdır.

Üçüncü gün, sabit fetal beyinleri içeren jelatin bloğu viome aşamasına takın. Daha sonra koronal kesit için 25 ila 50 mikron kalınlığında ayarlanmış bir viome kullanarak beyinleri bölümlere ayırın. Fetal beyin bölümlerini PBS'de toplayın, ardından fetal beyin bölümlerini süper donlara ve sudaki slaytlara monte edin ve 15 dakika kurumaya bırakın.

15 dakika geçtikten sonra. Tünel reaksiyonunun ertesi gün test edilmesi için slaytları PBS'ye yerleştirin. İlk olarak, slaytları 37 santigrat derecede beş dakika boyunca mililitre proteinaz K ve PBS başına 20 mikrogramlık bir çözeltiye batırın.

Daha sonra PBS'de her biri bir orbital çalkalayıcıda beş dakika boyunca üç kez durulayın. Bölümleri metanol içinde% 3 hidrojen peroksit ile oda sıcaklığında çalkalamadan 10 dakika inkübe edin. Ardından slaytları daha önce olduğu gibi yıkayın.

Daha sonra, bölümleri geçirgen çözelti içinde buz üzerinde iki dakika inkübe edin. Kuluçka sonrası PBS'de iki kez yıkandı. Daha önce olduğu gibi, bölümlerin etrafındaki slayt alanını kurutmak için bir laboratuvar dokusu kullanın.

Ardından, slayttaki bölümlerin etrafını çizmek için bir pat kalemi kullanın. Bu, boyama solüsyonunun sızmasını önler, böylece küçük bir hacmin kullanılmasına izin verir. Üreticinin talimatlarına göre hazırlanan tünel reaksiyon karışımı ile her çiftte bir bölümü inkübe edin.

Negatif kontrol bölümüne tünel reaktifi olmayan bir taşıyıcı solüsyon ekleyin. Daha sonra slaytları 37 santigrat derecede bir saat inkübe edin. Kuluçka süresi geçtikten sonra, slaytları daha önce olduğu gibi bir orbital çalkalayıcı üzerinde PBS'de üç kez yıkayın.

Daha sonra dokunun etrafındaki alanı bir laboratuvar bezi ile kurulayın. Daha sonra, bölümleri dönüştürücü POD çözeltisi ile sallamadan 37 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin. Daha sonra bölümleri her biri tris HCL ile beş dakika boyunca üç kez durulayın.

Slaytları bir tutucuya aktarın ve %0,05 DAB ve %0,003 Hidrojen peroksit içeren bir coplin kavanozuna yerleştirin. Kavanozu alüminyum folyo ile örtün ve inkübasyondan sonra yedi dakika boyunca buz üzerinde bir orbital çalkalayıcı üzerine yerleştirin, istenirse PBS'yi daha önce olduğu gibi yıkayın. Slaytlar, protokolün metin bölümünde ayrıntılı olarak açıklandığı gibi füze sayacı boyamaya geçmeden önce PBS'de saklanabilir.

Aşağıdaki görüntüler, nörotrofik peptitin, A DNF dokuzunun, E 13 evre prenatal alkol maruziyetinin PF grubuna kıyasla ok uçları ile gösterildiği gibi hücre ölümünde hücre ölümünde E 13 aşaması prenatal alkol maruziyetinde tünel testi kullanılarak alkolün neden olduğu apoptoza karşı etkilerini göstermektedir. Prenatal alkol maruziyetinin yanı sıra bir D NF dokuz uygulaması, tünel pozitif hücrelerde bir azalmaya neden oldu. İstatistiksel analiz, AD ve F dokuz uygulamasının tünel pozitif hücrelerde alkole bağlı artışları önlediğini gösterdi.

Değerler, ortalama artı ortalamanın eksi standart hatası olarak gösterilir. Tek bir yıldız işareti, 0,052'den küçük bir P değerini gösterir. Yıldız işareti, Newman Coles post hoc testi ile 0,01'den düşük bir P değerini gösterir.

Her grup dördün N'sini içeriyordu. Bu nedenle, geliştirilmesinden sonra, bu teknik, araştırmacılar ve beyin gelişimi alanı için farelerde ilaçların veya bileşik ve beyin gelişiminin etkilerini keşfetmek için bir yoldur.