Name: Alkole bağlı C57BL Hamilelik sırasında Apoptoz / 6 Fare Karşı, Nörotrofik Peptit, ADNF-9 Etkilerinin Test için Deneysel Yöntemler (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-24T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 50 s
Description: Öğrenin, C57BL/6 farelerinde gebelik sırasında alkol kaynaklı apoptozu değerlendirmek için deneysel yöntemleri. Bu teknik, nörotrofik peptitlerin nöroprotektif etkilerini incelemek için kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu araştırma projesi Alkol İstismarı ve Alkolizm Ulusal Enstitüsü Ödülü sayısı R21AA017735 (YS) tarafından desteklenmiştir. Içeriği sadece yazarların sorumluluğundadır ve mutlaka Alkol İstismarı ve Alkolizm veya Ulusal Sağlık Enstitüleri Ulusal Enstitüsü resmi görüşlerini temsil etmemektedir. Yazar ayrıca, bu yazının düzenleme için Charisse Montgomery teşekkür etmek istiyorum.

1. Hayvanlar Yetiştirme ve Trofik Peptit Tedavi <ol><li> 2 saat için erkek ev kafesleri içine dişi farelerde (~ 6 hafta eski, ortalama ağırlığı 20 g) koyarak cins C57BL/mice. </li><li> Hemen ardından bir sperm fiş ve / veya vajinal smear olup olmadığını kontrol edin. </li><li> Pozitif ise, embriyonik gün 0 (E0) bu zaman noktası belirleyin. </li><li> Son zamanlarda açıklandığı gibi E7, kontrol ve tedavi gruplarına hamile kadın ağırlık-maç (3 grup) atanır 4: 1) Alkol (etanol) sıvı diyet grubu (ALC), 2) çift-beslenen kontrol grubu (PF), 3) alkol maruz kalma sıvı diyet (ALC/ADNF-9) yanında ADNF-9 peptid intraperitoneal (ip) enjeksiyon alacaksınız peptid tedavi grubunda,. ALC ve PF diyetler hazırlanmasının ayrıntıları ve ip enjeksiyonları prosedürü son çalışmaları 4 bulunabilir. </li><li> Besinlerin tek kaynak olarak ücretsiz olarak temin edilebilir günlük alkol sıvı diyet ölçün. PF sıvı diyet tek tek t yokedo bir ALC baraj hem günlük ölçülebilir. </li><li> Bir önceki 24 saat boyunca tüketilen sıvı diyet hacmi kaydedilebilir 30-mL vida kapaklı tüpler mezun oldu ve taze hazırlanmış diyet E7 gelen E13 her gün sağlanmalıdır. </li></ol> 2. Fetusların ve Fetal Brain Mikrodisseksiyon diseksiyonu <ol><li> Derin bir servikal dislokasyon ardından CO 2 prosedüre fareler ötenazi tarafından E13 hamile fareler kurban. </li><li> % 70 etanol ile kesi karın sitesi temizleyin. </li><li> Steril makas ve forseps kullanarak karın kesi yapmak. </li><li> Karın açıldığında, bir forseps ile tutarak ve uzak rahim mesometrium gözyaşı diğer forseps kullanarak rahim teşrih. Embriyoların delinmesiyle önlemek için yavaş yavaş bu işlemi yapmak istediğinizden emin olun. </li><li> Rahim embriyo çıkarın ve Hanks &#39;Dengeli Tuz çözeltisi içeren (60 mm x 15 mm) bir hücre kültürü çanak içine aktarabilirsiniz<html> (HBSS) buz gibi soğuk suda. </li><li> Mikrodiseksiyon için stereomikroskop altında tüm embriyolardan fetal beyin parçalara ayır. </li><li> Mikrodiseksiyon için ultra-ince forseps kullanarak, kafatası ortaya çıkarmak için başın üst kısmında embriyo cilt çekin. </li><li> Bir kez kafatası maruz ve net bir şekilde daha sonra omurilik ve beyin sapı alanlarda beynin arka kısmından başlayarak kafatasının soyulabilir, mikrodiseksiyon stereomicroscope altında görüntülendi. </li><li> Başın ön kısımlarına posterior gelen parça kafatası parçası kalkmasına emin olun. </li><li> Fetal beyin görsel maruz sonra, onları ayıklamak devam. </li><li> Primordium koku ampul tabanından metencephalon en tabanına fetal beyin parçalara ayır. </li><li> Tüm sonek 2-3 gün süreyle% 4&#39;lük paraformaldehit içerisinde fetal beyinleri. Eğer Western Blot veya enzimatik deneyleri için onları test ise Ayrıca her baraj diğer fetal beyin dondurabilirsiniz. </li></ol>nt &quot;&gt; Not: Hayvan kullanımlar için prosedürler Kurumsal Hayvan Bakım tarafından onaylanmış ve Kurumsal Hayvan Bakım kurallarına uygun olarak ve Ulusal Sağlık Enstitüleri Kullanım Kurulu Toledo Üniversitesi Komitesi ve için Kılavuzu kullanın edildi Bakım ve Laboratuvar Hayvanları kullanın. 3. Kesit için Jelatin Fetal Brain katıştırma <ol><li> Jelatin sınıf A% 10 hazırlayın </li><li> Yarım bir peel-away gömme kalıp doldurun ve jelatin katılaşır kadar bekleyin. </li><li> Katılaşmış jelatin üstüne yerleştirin kontrolü ve prenatal tedavi fetal beyin yan yana. Bu deney ve kontrol gruplar arasındaki hücre ölümü İmmuno tutarlı koşulları tutmaktır. </li><li> (Jelatin çok sıcak olmadığından emin olun) tam bir kalıp yapmak için fetal beyin üstüne jelatin sıvı ekleyin. </li><li> 15 dakika fetal beyin tutan hazırlanan jelatin kalıp buzdolabında. </li><li> Soyulmakdaha sonra gömme kalıp plastik ve iki gün süreyle% 4&#39;lük paraformaldehit içine önceden hazırlanmış jelatin içeren fetal beyinleri aktarın. </li><li> Yerleştirin ve bölüm fetal beyin sabit jelatin koronal kesit için 50 mikron kalınlığında vibratome kesit makinesi (Leica VT 1000S) kullanarak. Daha iyi anatomik özellikleri sağlar, çünkü bu kalınlık bizim çalışmalarda test edilir. Buna ek olarak, 25 um kalınlıkta ve aynı zamanda daha yüksek bir% 10 jelatin fötal beyin gömülü içeren bu tekniği ile test edilebilir. Ön beyin üzerinde bazal ganglion tepe düzeyde vibratome kullanarak koronal bölümleri kesilmiş unutmayın </li><li> Fosfat tamponlu tuz (PBS) çözeltisi içinde fetal beyin bölümleri toplayın. </li><li> Suda SuperFrost Plus slaytlar fetal beyin bölümleri monte edin. </li><li> 15 dakika için monte edilmiş bölümleri kurutun. </li><li> TUNEL reaksiyon ertesi gün test için PBS slaytlar (fetal beyin bölümleri ile monte) yerleştirin. </li></ol> 4. De için TUNEL reaksiyonHücre Ölümü veya Apoptoz koruması (TUNEL: TdT-aracılı dUTP Nick Son Etiketleme; TdT: terminal deoksinükleotidil transferaz). Bu testte hücre ölümü belirlenmesi amaçlanmıştır. <ol><li> 37 ° C (20 ml PBS içerisinde karışık proteinaz K, 300 ul), 5 dakika boyunca proteinaz K (20 ug / ml) ile Superfrost Plus, slaytlar monte edilmiş fötal beyin kesitlerinin Treat. Slaytlar) 5-Plend açık maile monte edilir. </li><li> Orbital çalkalayıcı altında 5 dakika boyunca PBS ile üç kez fetal beyin kesitlerinin (slaytlar monte) yıkayın. </li><li> % 3 oda sıcaklığında, 10 dakika (3 ml% 30 27 H 2 O 2 mL% 100 metanol) (slaytlar bir karıştırıcı içinde olmamalıdır) boyunca metanol H 2 O 2 bölümleri inkübe edin. </li><li> Yörüngesel bir çalkalayıcı içinde 5 dakika boyunca PBS ile üç kez bölümleri durulayın. </li><li> Buz üzerinde 2 dakika (4 ° C) (100 ul TritonX + 0.1 gr sodyum sitrat + 99.9 ml damıtılmış için geçirgenliği çözelti içinde bölümler (% 0.1% 0.1 sodyum sitratta TritonX-100) inkübed su). </li><li> Yörüngesel bir çalkalayıcı içinde 5 dakika boyunca PBS içinde bölümler iki kez çalkalayın. </li><li> Slaytlar bölümleri civarında kuru bir alanda. </li><li> PAP Kalem kullanarak SuperFrost Plus slaytlar üzerinde bariyer çizin. Bu, herhangi bir TÜNEL-pozitif hücrelerin saptanması için bölümlere tedavi etmek için kullanılan çözeltinin sızmasını önlemek için amaçlanmıştır. </li><li> 37 ° C&#39;de 1 saat boyunca TÜNEL Reaksiyon karışımı, (şişe, 1 ila 50 ul ve şişe 2 450 ul) ° C bölümleri inkübe, kontrol şişe 2 çözeltisi içinde inkübe edilerek, kullanılacaktır. </li><li> Orbit çalkalama altında PBS üç kez 5 dakika ile durulayın. </li><li> Doku etrafında kuru bir alanda. </li><li> 37, 30 dakika için dönüştürücü-POD ile bölümler inkübe ° C. </li><li> Tris HCI (pH 7.5, 0.05 M) ile 5 dakika boyunca bölümlere üç kez yıkayın. </li><li> % 0.05 3&#39;-3&#39;-diaminobenzidin tetrahidroklorür (DAB) ve% 0.003 &#39;H 2 O 2 (25 ml Tris HCI, pH 7.5, 0.05 M + 25 ul% 3 H 2 + 2 0 500 içinde 7 dakika boyunca bölümleri inkübe ul DAB) 4 de Oribtal çalkalayıcı altında ° C (buz) ve karanlıkta () yeni 5-Plend açık mailler bu işlemi yapmak istediğinizden emin olun. </li><li> Orbital çalkalayıcı altında PBS üç kez 5 dakika ile bölümleri durulayın. </li><li> Bir sonraki bölümde protokol ayrıntılı olarak Nissl boyama için onları işlemek daha sonra, PBS içinde en fazla 24 saat için PBS içinde slaytlar bölümleri tutun. </li></ol> Not: DAB kanserojen. Eldiven kullanın ve bir kez tüm deneyler ile bitmiş çamaşır suyu ile kullanılan tüm yemekleri temizleyin. 5. Mikroskobik Gözlem için Fetal Beyin Bölüm hazırlanması için Nissl boyama <ol><li> Nissl boyama işlemi biyolojik güvenlik kabini içinde yapılmalıdır. </li><li> 2 dakika süreyle deiyonize su ile birlikte kayar bölümler durulayın. </li><li> 2 dakika süreyle% 70 etanol içinde bölümler inkübe edin. </li><li> 6 dakika boyunca% 95 etanol içinde bölümler inkübe edin. </li><li> 2 dakika süreyle% 70 etanol içinde bölümler inkübe edin. </li><li> Deiyonize wat en bölümleri durulayın2 dakika süreyle er. </li><li> Kresil Violet bölümleri 3 dakika Leke inkübe edin. </li><li> 2 dakika boyunca iyonu giderilmiş su içinde bölümleri durulayın. </li><li> 2 dakika süreyle% 70 etanol içinde bölümler inkübe edin. </li><li> 3 dakika boyunca% 95 etanol + 3 ml buzlu asetik asit içinde bölümler inkübe edin. </li><li> 2 dakika süreyle% 95 etanol içinde bölümler inkübe edin. </li><li> 2 dakika için üç kez% 100 etanol içinde bölümler inkübe edin. </li><li> 10 dakika için üç kez Ksilen bölümleri inkübe edin. </li><li> Fetal beyin bölümleri tutarak Slaytlar Permount ve kapak kayma cam slaytlar kullanılarak monte edilebilir. </li><li> Monte gecede mikroskobik gözlem ve analizler öncesinde slaytlar bırakın. </li><li> Mikroskobik gözlem ve Mikroskobik Leica dik mikroskop altında yapılabilir. </li></ol>

<ol><li>Sari, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-dependent+neuroprotective+protein-derived+peptide%2C+NAP%2C+preventing+alcohol-induced+apoptosis+in+fetal+brain+of+C57BL%2F6+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Activity-dependent neuroprotective protein-derived peptide, NAP, preventing alcohol-induced apoptosis in fetal brain of C57BL/6 mouse.</a> Neuroscience. 158 (4), 1426-1435 (2009).</li>
<li>Sari, Y., Chiba, T., Yamada, M., Rebec, G. V., Aiso, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+peptide%2C+colivelin%2C+prevents+alcohol-induced+apoptosis+in+fetal+brain+of+C57BL%2F6+mice%3A+signaling+pathway+investigations%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A novel peptide, colivelin, prevents alcohol-induced apoptosis in fetal brain of C57BL/6 mice: signaling pathway investigations.</a> Neuroscience. 164 (4), 1653-1664 (2009).</li>
<li>Sari, Y., Hammad, L. A., Saleh, M. M., Rebec, G. V., Mechref, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alteration+of+selective+neurotransmitters+in+fetal+brains+of+prenatally+alcohol-treated+C57BL%2F6+mice%3A+quantitative+analysis+using+liquid+chromatography%2Ftandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Alteration of selective neurotransmitters in fetal brains of prenatally alcohol-treated C57BL/6 mice: quantitative analysis using liquid chromatography/tandem mass spectrometry.</a> Int. J. Dev. Neurosci. 28 (3), 263-269 (2010).</li>
<li>Sari, Y., Weedman, J. M., Ge, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-dependent+neurotrophic+factor-derived+peptide+prevents+alcohol-induced+apoptosis%2C+in+part%2C+through+Bcl2+and+c-Jun+N-terminal+kinase+signaling+pathways+in+fetal+brain+of+C57BL%2F6+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Activity-dependent neurotrophic factor-derived peptide prevents alcohol-induced apoptosis, in part, through Bcl2 and c-Jun N-terminal kinase signaling pathways in fetal brain of C57BL/6 mouse.</a> Neuroscience. 202, 465-473 (2012).</li>
<li>Sari, Y., Zhang, M., Mechref, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression+of+proteins+in+fetal+brains+of+alcohol-treated+prenatally+C57BL%2F6+mice%3A+a+proteomic+investigation%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Differential expression of proteins in fetal brains of alcohol-treated prenatally C57BL/6 mice: a proteomic investigation.</a> Electrophoresis. 31, 1-14 (2010).</li>
<li>Bassan, M., Zamostiano, R., Davidson, A., Pinhasov, A., Giladi, E., Perl, O., Bassan, H., Blat, C., Gibney, G., Glazner, G., Brenneman, D. E., Gozes, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+sequence+of+a+novel+protein+containing+a+femtomolar-activity-dependent+neuroprotective+peptide%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Complete sequence of a novel protein containing a femtomolar-activity-dependent neuroprotective peptide.</a> J. Neurochem. 72 (3), 1283-1293 (1999).</li>
<li>Brenneman, D. E., Hauser, J., Neale, E., Rubinraut, S., Fridkin, M., Davidson, A., Gozes, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-dependent+neurotrophic+factor%3A+structure-activity+relationships+of+femtomolar-acting+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Exp.+Ther%22%5BJournal%5D)">Activity-dependent neurotrophic factor: structure-activity relationships of femtomolar-acting peptides.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 285 (2), 619-627 (1998).</li>
<li>Spong, C. Y., Abebe, D. T., Gozes, I., Brenneman, D. E., Hill, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevention+of+fetal+demise+and+growth+restriction+in+a+mouse+model+of+fetal+alcohol+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Exp.+Ther%22%5BJournal%5D)">Prevention of fetal demise and growth restriction in a mouse model of fetal alcohol syndrome.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 297 (2), 774-779 (2001).</li>
<li>Sari, Y., Gozes, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+deficits+associated+with+fetal+alcohol+exposure+may+be+protected%2C+in+part%2C+by+peptides+derived+from+activity-dependent+neurotrophic+factor+and+activity-dependent+neuroprotective+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res.+Brain+Res.+Rev%22%5BJournal%5D)">Brain deficits associated with fetal alcohol exposure may be protected, in part, by peptides derived from activity-dependent neurotrophic factor and activity-dependent neuroprotective protein.</a> Brain Res. Brain Res. Rev. 52 (1), 107-118 (2006).</li>
<li>Brenneman, D. E., Gozes, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+femtomolar-acting+neuroprotective+peptide%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">A femtomolar-acting neuroprotective peptide.</a> J. Clin. Invest. 97 (10), 2299-2307 (1996).</li>
<li>Zamostiano, R., Pinhasov, A., Gelber, E., Steingart, R. A., Seroussi, E., Giladi, E., Bassan, M., Wollman, Y., Eyre, H. J., Mulley, J. C., Brenneman, D. E., Gozes, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+characterization+of+the+human+activity-dependent+neuroprotective+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Cloning and characterization of the human activity-dependent neuroprotective protein.</a> J. Biol. Chem. 276 (1), 708-714 (2001).</li>
<li>Offen, D., Sherki, Y., Melamed, E., Fridkin, M., Brenneman, D. E., Gozes, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vasoactive+intestinal+peptide+%28VIP%29+prevents+neurotoxicity+in+neuronal+cultures%3A+relevance+to+neuroprotection+in+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Vasoactive intestinal peptide (VIP) prevents neurotoxicity in neuronal cultures: relevance to neuroprotection in Parkinson's disease.</a> Brain Res. 854 (1-2), 257-262 (2000).</li>
<li>Steingart, R. A., Solomon, B., Brenneman, D. E., Fridkin, M., Gozes, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VIP+and+peptides+related+to+activity-dependent+neurotrophic+factor+protect+PC12+cells+against+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">VIP and peptides related to activity-dependent neurotrophic factor protect PC12 cells against oxidative stress.</a> J. Mol. Neurosci. 15 (3), 137-145 (2000).</li>
</ol>

Hiçbir açıklama yapılacak.

Bu çalışmada yer alan yöntemleri ve teknolojisi Prenatal beyinlerinde alkole maruz kalma ve bu etkilerin önlenmesi trofik peptidlerin rolü etkilerini göstermektedir. Bu farklı gebelik dönemlerinde istismar veya fetal beyinlerinde diğer zehirli kimyasal maddelerin diğer ilaçlar çalışma hakkında bilgi sağlayabilir. Üreme paradigması ile ilgili olarak, bazı durumlarda, sperm fişin tespit gözlemlenmeyen olabilir. Bu noktada, bu mümkün sperm olumlu algılama sağlayabilir, mikroskobik gözlem altınd...

Burada açıklanan deneysel yöntemlerin amacı, beslenme Microdissecting ve hücre ölümü tespit, ıslah içeren çeşitli teknikler kullanarak fetal alkol maruz modelinde trofik peptidlerin nöroprotektif etkilerini değerlendirmektir. Laboratuvarımızda çalışmak alkol miktarı vadede bir insan içme paradigma benzer olabilir ılımlı alkol içme, bir model olarak alkol ile karışık bir sıvı diyet yer vardır 1-5 tüketilen. Biz ve diğerleri fetal alkol maruz kalmanın zararlı etkilerine karşı nöroprotektif üç peptit türevleri belirledik. Hayvan modelleri kullanarak embriyonik aşamalarında alkol maruz araştıran çalışmalar nöro potansiyel mekanizmalarının belirlenmesi yol ve müdahale prosedürlerinin geliştirilmesi için izin verebilir. Bu hamilelik sırasında alkol maruz kalmanın zararlı etkileri nöroprotektif etkileri ve zayıflama hakkında geniş bilgi verebilir. Prenatal alkol maruz kalma etkileri mümkün önlenmesi in vitro ve in vivo 6,7 1,2,4,8,9 nöroproteksiyon dahil olmak gösterilmiştir peptitler ile gebe farelerin tedavisinde içerebilir. Bu peptidler arasında, ADNF-9 ya da SAL olarak bilinen SALLRSIPA, aktivite bağımlı nörotrofik faktör (ADNF) 7,10 türetilmiştir. Dizisi NAPVSIPQ peptid olarak adlandırılan NAP, başka bir peptit aktivite bağımlı nöroprotektif protein (ADNP) 6,11 elde edilen, alkol maruz kalma 12,13 ile ilişkili oksidatif strese karşı güçlü bir koruyucu etki göstermiştir. Buna ek olarak, son zamanlarda fetal alkol maruz modeli 2 önemli bir nöroprotektif rol oynadığı yeni bir sentez peptit, colivelin belirledik. Colivelin ADNF-9 ve AGA-(C8R) HNG17 (PAGASRLLLLTGEIDLP) oluşmaktadır. Bu peptidlerin kullanımının önemi onlar yeteneğine sahip olmasıdıralkole bağlı apoptoz ve beyin gelişimi açıklarının etkilerini önlemek için beyin-kan bariyeri çapraz. Deneysel yöntem alkol kaynaklı apoptoz karşı nöro-koruyucu etkisi test etmek için C57BL / 6 fareleri kullanılmıştır. Biz bir sperm fiş ve vajinal smear 1-5 tespiti ile ortaya gibi doğru, embriyonik gün 0 (E0) tahmin etmek için yerine bir gecede ıslah bir 2 saatlik pencere benimsemiştir. Bu hamile farelere stres neden olabilir gavaj yolu, ile yerine alkol teslimat ücretsiz kabul edilir gibi, besleme tüpleri ile bir sıvı diyet kullandık. Öte yandan, mikrodiseksiyon erken evrelerinde fetal beyinleri kesme karşılaşılan olabilir fetal beyin dokusunun, yumuşak olması nedeniyle zor olabilir. Burada, mikrodiseksiyon ile ilgili tüm zorlukları ile başa çıkmak için görsel teknikleri göstermektedir. Ayrıca, fetal beyin kesit de zor olabilir çünkü, benimsediğimizjelatin gömme peel-away kullanarak kalıplara fetal beyin gömme içeren bir tekniktir. Biz 50 mikron kalınlığında serbest dalgalı bölümlerde fetal beyin kesme başarılı olmuştur. Bu bizim hücre ölümü belirlenmesi de dahil olmak üzere, fetal beyin bölümlerini içeriği protein herhangi bir değişiklik araştırmak için izin verir.

<table><tbody><tr><td>Superfrost Plus Slaytlar</td><td>VWR</td><td>48311-703</td><td></td></tr><tr><td>PAP PEN</td><td>Araştırma Ürünleri Int. A.Ş.</td><td></td><td></td>195506</tr><tr><td>5-Rehin Açık Posta </td><td>Heathrow Scientific, LLC</td><td>HS 15983G</td><td></td></tr><tr><td>Gömme kalıpları soyun</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td>70182</td><td></td></tr><tr><td>Yerinde hücre ölümü tespit kiti, POD</td><td>Roche Diagnostics, Inc</td><td>11684817910</td><td></td></tr><tr><td>Hanks'in Dengeli Tuz Çözeltisi</td><td>Invitrogen</td><td>14170-120</td><td></td></tr><tr><td>Jelatin Tip A</td><td>FisherScientific</td><td>G8-500</td><td></td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>W. NUHSBAUM, Inc</td><td>Leica M60, KL 200 LED</td><td></td></tr><tr><td>Mikro Vibratom</td><td>Leica, Inc</td><td>Leica VT 1000S</td><td></td></tr><tr><td>Moria Ultra İnce Forseps </td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>11370-40</td><td>2 çift</td></tr><tr><td>Lisansüstü 30 ml besleme tüpleri</td><td>Dyets, Inc</td><td>900012</td><td></td></tr><tr><td>Vitamin Mix </td><td>Bio-Serv. Inc.</td><td>F8031</td><td></td></tr><tr><td>Mineral Karışım</td><td>Biyo-Serv.</td><td>F8598</td><td></td></tr><tr><td>Maltoz Dekstrin</td><td>Biyo-Servis A.Ş.</td><td>3650</td><td></td></tr><tr><td>Etil alkol 190 Proof, 5 galon</td><td>111000190-SS05</td><td>Pharmco-AAPER</td><td></td></tr><tr><td>Dik mikroskop</td><td>W. NUHSBAUM, Inc</td><td>LEICA DM 4000</td><td></td></tr></tbody></table>

alkole bağlı c57bl hamilelik sırasında apoptoz / 6 fare karşı, nörotrofik peptit, adnf-9 etkilerinin test için deneysel yöntemler

Experimental Methods for Testing the Effects of Neurotrophic Peptide, ADNF-9, Against Alcohol-induced Apoptosis during Pregnancy in C57BL/6 Mice

Fetal beyin gelişimi erken embriyonik aşamalarında doğum öncesi alkol maruz kalma etkilerini araştırmak için deneysel tasarımlar zorlu. Bu daha çok fetal beyin ve alkol prenatal maruz kalma sonucu apoptotik hücrelerin belirlenmesi için kendi kesit bir mikrodiseksiyon zorluğu kaynaklanmaktadır. Deneyler fetal beyin dokusunda hücre ölümü kimlik yetiştiriciliği farelerden alınan görsel teknikler sağlar tanımlanmıştır. Bu çalışma, C57BL / kullanılan alkolün indüklediği apoptoza karşı fetal alkol maruz kalma ve trofik peptid rolü üzerinde çalışılması için hayvan modeli olarak, 6 farenin. Üreme embriyonik yaş tam evresini belirlemek için bir 2 saatlik paspas pencereden oluşur. Kurulu bir fetal alkol maruz kalma modeli fetal beyinlerinde prenatal alkol maruz kalma etkilerini belirlemek için bu çalışmada kullanılmıştır. Bu hamile fareler için besin tek kaynağı olarak alkol ya da çift-beslenen sıvı diyetler ücretsiz erişim içerir. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; ikinci zor olabilir çünkü fetus ve fetal beyin Mikrodisseksiyon diseksiyonu içeren teknikleri, dikkatli bir şekilde açıklanmıştır. Mikrodisseksiyon bir stereomikroskopta ve ultra-ince forseps gerektirir. Fetal beyin diseksiyon için adım adım işlemleri görsel olarak verilmektedir. Fetal beyin primordium koku ampul tabanından metencephalon en tabanına disseke edilir. Apoptoz soruşturma için, fetal beyin ilk vibratome aparatı ile kesit kolaylaştırmak için bir peel-away kalıp kullanarak jelatin gömülür. Paraformaldehit gömülü ve sabit fetal beyinleri kolayca kesitli ve serbest yüzen bölümleri apoptosis ya da hücre ölümünün belirlenmesi için Superfrost Plus, slaytlar monte edilebilir. TÜNEL (TdT-aracılı dUTP Nick uç etiketleme; TdT: terminal deoksinükleotidil transferaz) tahlili hücre ölümü ya da apoptoz hücreleri tanımlamak için kullanılmıştır. Bu dikkat çekicidir ki apoptosis ve hücre-aracılı sitotoksisite, DNA parçalanması ile karakterize edilir. Bu nedenle, görsel TÜNEL-pozitif hücrelerde hücre ölümü veya apoptotik hücrelerin bir göstergesidir. Burada deneysel tasarımlar fetal beyinlerinde gebelik sırasında alkol etkilerini araştırmak için kurulmuş bir sıvı diyet kullanımı hakkında bilgi ve nörotrofik peptidlerin rolü sağlar. Bu üreme ve hamile fareler beslenme, fetal beyin Microdissecting ve apoptoz belirlenmesi içerir. Birlikte, bu görsel ve metinsel teknikleri fetal beyinlerinde zararlı ajanların prenatal maruz araştırmak için bir kaynak olabilir.

Deneysel yöntemler 2 saat yetiştirme pencere doğru gebelik aşamasında tahmin için gerekli olduğunu göstermektedir burada açıklanan. Biz E13 yaşına embriyoların diseksiyonu göstermiştir. Ayrıca E13 fetal beyin mikrodiseksiyon gösterdi. Bu prosedür, Şekil 1 &#39;de tarif çeşitli aşamalarda (AC), içerir. Fetal beyin primordium koku ampul tabanından metencephalon baz (Şekil 1) disseke edilir. Fetal beyin sonra immunokimyasal tespiti için% 4 paraformaldehid sabitlenir. Tespit edildikten sonr...

Deneysel tasarımlar fetal beyin gebelik sırasında apoptoz ve nörotrofik peptid uygulama alkol maruz kalmanın etkilerini araştırmak burada odaklanmak önerdi. Üreme fetal beyin koleksiyonuna ayrıntılı bir açıklama açıklanmıştır. Apoptozun belirlenmesi için teknikler de detaylı bir şekilde tarif edilmektedir.

Alkole bağlı C57BL Hamilelik sırasında Apoptoz / 6 Fare Karşı, Nörotrofik Peptit, ADNF-9 Etkilerinin Test için Deneysel Yöntemler

Experimental designs for investigating the effects of prenatal alcohol exposure during early embryonic stages in fetal brain growth are challenging. This ...

Bu prosedürün amacı, fetal alkol maruziyet modelinde trofik peptitlerin nöroprotektif etkilerini değerlendirmektir. Bu, önce deney hayvanlarının çiftleştirilmesi ve daha sonra hamile dişilerin trofik peptitlerle tedavi edilmesiyle elde edilir, ikinci adım olarak, fetüsler deneysel kullanımlar için fetal beyinleri izole etmek için diseke edilir. Daha sonra, fetal beyinler kesit almak için jelatin içine gömülür, ardından hücre ölümü sonuçlarını belirlemek için tünel boyama yapılır.Bu, doğum öncesi alkol maruziyetinin ganglionik üstünlükteki tünel pozitif hücrelerin sayısını artırdığını gösterir. Trofik peptidin kontrol grubu uygulamasıyla karşılaştırıldığında, bir D ve F dokuz, kontrol alkolü ile tedavi edilen hayvanlara kıyasla tünel pozitif hücrelerde alkolün neden olduğu artışı önemli ölçüde azalttı. Bu nedenle, bu metalin görsel gösterimi kritik öneme sahiptir, çünkü fetal beyin diseksiyonu ve gömülü adımların öğrenilmesi zordur, çünkü fetal beyinlerin parçalara ayrılması ve bölümlere ayrılması için işlem yapılması çok küçüktür Birinci cins C 57 siyah altı fareyi, yaklaşık 20 gramlık altı haftalık dişi fareleri, çıkarıldıktan hemen sonra iki saat boyunca erkek ev kafeslerine yerl

experimental-methods-for-testing-effects-neurotrophic-peptide-adnf-9

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Etanol bağlı gelişimsel hasar moleküler mekanizmalarını anlayabilmek için, biz etanol maruz kalma zebrabalıkları modeli geliştirdik ve etanol maruz kaldıktan sonra meydana gelen fiziksel, hücresel ve genetik değişimler...

Fetal Alkol Pozlama bir Zebra balığı Modelinde teratojenik değişiklikler değerlendirilmesi

Mutasyona uğramış alfa-sinükleini aşırı eksprese eden dopaminerjik nöronlar içeren sıçan embriyolarından elde edilen birincil orta beyin kültürü ile başlayın.Arıtma kuyucuklarındaki ortamı, test bileşiğini içeren taze ortamla ve kontrol kuyularındaki ortamı düz ortamla değiştirin. Sonra kuluçkaya yatırın.Kontrolde, alfa-sinüklein, dopaminerjik nöronlarda toksik agregatlar oluşturarak nörit retraksiyonuna neden olur ve nöronal ölüme yol açar.Tedavide, test bileşiği alfa-sinüklein ile etkileşime...

Bir Test Bileşiğinin Sıçan Embriyonik Nöronlarında Alfa-Sinüklein Toksisitesine Karşı Nöroprotektif Etkilerinin Değerlendirilmesi

Biz aynı anda 6 fare kafesleri ev hazır malzemeler kullanılarak alkol buhar odaları inşaatı göstermektedir. Biz ayrıca, insan gebelik 3 üç aylık denk fetal alkol maruz kalmanın bir fare modelinde bunların kullanımını tarif eder. Bu paradigma, gebelik ve doğum sonrası günlerde 1-12 sırasında hayvanlar ortaya koyar.

İnsani Gelişim her üç trimesterde Eşdeğeri sırasında Alkol Fare Expose Kullanılan Buhar Odaları İnşaatı

Burada sunulan protokolün amacı, doğum öncesi beyin gelişimi sırasında fareleri orta düzeyde alkole maruz bırakma prosedürlerini tanımlamak ve yetişkinlik döneminde sosyal davranışta ortaya çıkan değişiklikleri ölçmektir.

Orta Prenatal Alkol Pozlama ve Yetişkin Sıçanlarda Sosyal Davranış Kantitasyonu

Değerlendirmek için kullanılan izleme eyeblink Klasik koşullanma (ECC) bağımlı Hipokampal ilişkisel öğrenme edildi yetişkin Sıçanlarda yönetilen yüksek yoğunlukta (% 11,9 v/v) alkol erken neonatal beyin gelişimi sırasında. Genel olarak beyin işlev bozukluğu birçok psikolojik ve Biyomedikal ayarlarını algılamak için ses tanılama araçları ECC işlemlerdir.

Hipokampal disfonksiyon Fetal alkol spektrum bozuklukları, fare modeli değerlendirmek için izleme Eyeblink Klasik koşullanma kullanımı

Supraspinal bölgede geçici reseptör potansiyel vanilloid tip 1 (TRPV1) beyin fonksiyonubazı roller oynamak için önerilmiştir. Burada açıklanan farelerde supraspinal TRPV1 duyarsızlaştırma için resiniferatoxin intracerebroventriküler enjeksiyon için bir protokoldür. Bazı ağrı testleri için prosedürler de sunulmaktadır.

Farelerde Resiniferatoksin ve Ağrı Testleri ile İntracerebroventriküler Tedavi

Bu çalışma, uygun maruzkalma yöntemlerinden embriyo işleme ve etanol analizine kadar kafa uzayı gaz kromatografisi kullanarak zebra balığı embriyosundaki etanol düzeylerini ölçmek için bir protokol tanımlamaktadır.

Kafa Uzayı Gaz Kromatografisi Kullanan ZebraBalığı Embriyolarında Etanol Düzeylerinin Ölçülmesi

Bu protokolde, aynı fare embriyosundan fetal beyin dokusunun yanı sıra yüksek kaliteli, hemolize edilmemiş serumun aynı anda toplanması için bir yöntem tarif ediyoruz. Bu tekniği, maternal diyet maruziyetinin Nf1 (Nörofibromatozis Tip 1) için heterozigot farelerde makro besin profillerini ve fetal nörogelişimi nasıl etkilediğini sorgulamak için kullandık.

Nörofibromatozis Tip 1'de Maternal Diyetin Beslenme ve Nörogelişim Üzerindeki Etkilerini Değerlendirmek için Fetal Murin Beyin ve Serumunun Eş Zamanlı Toplanması

Yasal kısıtlamalar değiştikçe, kannabinoid ürünlerinin erişilebilirliğinin artmasına neden olarak, özellikle hamilelik sırasında bu maruziyetlerin etkisini incelemek için modeller geliştirmek kritik öneme sahiptir. Gönüllü yutma yoluyla orta derecede prenatal kanabinoid maruziyetinin klinik öncesi bir modeli geliştirilmiştir ve bu da daha derinlemesine araştırmalara olanak tanır.

Nörogelişimsel Sonuçlar Üzerindeki Etkisini Değerlendirmek için Prenatal Delta-9-Tetrahidrokanabinol Maruziyetinin Klinik Öncesi Modeli

Makale, erken gebeliksel iltihabın nörogelişim üzerindeki etkilerini incelemek için kapsamlı bir protokol sunar; bu model, güvenilirlik ve tekrarlanabilirliği sağlamak için temel metrikleri içerir.

Nörogelişim üzerindeki prenatal iltihabı değerlendirmek için erken gebeliksel anne immün aktivasyon fare modelinin oluşturulması

Öğrenin, C57BL/6 farelerinde gebelik sırasında alkol kaynaklı apoptozu değerlendirmek için deneysel yöntemleri. Bu teknik, nörotrofik peptitlerin nöroprotektif etkilerini incelemek için kullanılır.

Alkole bağlı C57BL Hamilelik sırasında Apoptoz / 6 Fare Karşı, Nörotrofik Peptit, ADNF-9 Etkilerinin Test için Deneysel Yöntemler (Video) | JoVE Journal

Alkole bağlı C57BL Hamilelik sırasında Apoptoz / 6 Fare Karşı, Nörotrofik Peptit, ADNF-9 Etkilerinin Test için Deneysel Yöntemler

Daha fazla video keşfet