Testis Hücre Cezalı Hazırlanması için basit ve Verimli Tekniği

Bu videoda, kemirgenlerden test materyalinin sadece 15 dakika içinde hücresel süspansiyonunu elde etmek için çok basit ve verimli bir protokol sunulacaktır. Yöntem, fare, sıçan Gine domuzlarından testi test etmek için uygulanmıştır ve kapsüllenmiş dokuyu ayırmak için bir meta makine cihazı kullanır. Bir filtrasyon ve boyama işleminden sonra hücre inion'u akışa hazırdır.

Sito analizi veya sıralama Hücre popülasyonlarının homojenliği, erkek GA farklılaşması sırasında biyokimyasal ve moleküler olayların analizi için bir ön koşuldur. Bu nedenle, 30'dan fazla farklı hücre tipine sahip testis heterojenliği, memeli spermatogenezinin moleküler temelinin incelenmesiyle ilgili en önemli sorunlardan birini temsil eder. Bu nedenle, zenginleştirilmiş ve saflaştırılmış testis hücresi popülasyonlarını elde etmek için PU ve santrifüjlü illüstrasyon dahil olmak üzere çeşitli yöntemler kullanılmıştır.

Herhangi bir hücre ayırma yöntemi için ilk adım, bir hücresel süspansiyonun hazırlanmasıdır. Bununla birlikte, mevcut protokoller genellikle zaman alıcıdır ve RNA'lar gibi kısa ömürlü moleküllerin kaybı anlamına gelebilir, bu da gizli ekspresyon analizi için istenmeyen bir durumdur. Burada sunulan protokolün ana avantajı, hayvan kurban etme ve sperma aşamasına özgü moleküler çalışmalar arasındaki adımları ortadan kaldırması, ancak aynı zamanda hücresel süspansiyonlarda iyi kalite ve mükemmel hücre tipi temsili sağlamasıdır.

Prosedürü göstermek, yöntemi geliştiren AL Laboratuvarı'nda araştırmacı olan Dr.Ana Rodriguez ve sitometrik analizden sorumlu olan Federico San Lopez akış sitometrisi olacak. Prosedür, medicon ve fcon aksesuarlarıyla birlikte küçük bir ekipman parçası olan meach sistemini gerektirir. Bununla birlikte, fcon aksesuarları, aynı gözenek boyutuna sahip naylon membranlarla mükemmel bir şekilde değiştirilebilir.

Gerekli olan diğer tek malzeme ve reaktif, yayılmış cam, iki tabak, makas ve forseps, üç ila beş mililitrelik bir şırınga bağırsak odasını rahatsız eder, %10 fetal öksürük serumu ve NDA ile desteklenmiş DMM kültür ortamıdır. RNA manipülasyonlarını içeren aşağı akış uygulamaları planlanıyorsa, protokolü gerçekleştirmek için tüm materyaller ve çözeltiler buna göre ele alınmalıdır. Diseke testisi, gösterilen verilere göre 96 milimetrelik bir bardağa yerleştirin, dm adı verilen 10 mililitre takviye buz içeren buz.

TAL Virginia'yı çıkarın, dekap testisini her iki tarafta iki ila üç milimetrelik kare parçalar halinde kesin. Bu parçalardan dört ila beşini, D ile takviye edilmiş ve 50 saniye boyunca meta makine sisteminde işlenmiş bir mililitre kod ile birlikte tek kullanımlık ayrıştırılmış bir medicon'a yerleştirin. Her tıbbi ünite, altı mikro bıçakla çevrili yaklaşık yüz altıgen deliğe sahip sabit bir paslanmaz çelik ekran içerir.

Doku, medicon odasının içindeki metal bir rotor ile her bir deliğe getirilir ve keskinleştirilmiş deliklerin üzerinden ve metal elekten geçirilerek ayrıştırılırken, elek altındaki bir mikro pompa sıvı sağlar ve gövdeleri dışarı atar. İğnesiz üç ila beş milimetrelik bir şırınga kullanarak medicon'dan hücre süspansiyonu sonucunu geri kazanın. Daha sonra, 50 mikrometrelik bir şahini veya aynı dört boyutlu naylon ağı yarım mililitrelik bir ortamla ıslatın ve süspansiyonu içinden süzün.

Adımı tekrarlayın, ancak 25 mikrometrelik bir naylon ağ veya eşdeğer bir şahin ünitesi kullanarak ve buzun üzerine yerleştirin, bir noyer odasında saymak için hücre süspansiyonunun bir ALI teklifini alın ve hücresel konsantrasyonu bir ila iki kez 10 ila yedi hücreye ayarlayın. Son olarak, hücre pompalanmasını önlemek ve ayrıca sonraki akış çalışmaları sırasında kas tıkanmasını önlemek için% 0.2'lik bir nihai konsantrasyona NDA ekleyin. Hücre canlılığının değerlendirilmesi amaçlanıyorsa, bu, akış sitometrik analizinden önce üreticinin talimatlarına uyularak hayvan hücreleri için canlı ölü canlılık kiti vasıtasıyla gerçekleştirilebilir, bir floresan boya ekleyin.

Florokrom seçimi mevcut lazerlere bağlı olacaktır. Bu gösterimde, belgeyi DNA'ya bağlayan farklı boyaların kullanımı gösterilecektir. Probidium yo diyeti, düşük konsantrasyonlarda sabit veya ölü hücreler için olağan boya olmasına rağmen, yüksek konsantrasyonlarda kullanıldığında, ROM'un burada sunulan yöntemle hazırlanan süspansiyonlarda çözülmemiş testis hücrelerine girdiğini bulduk.

Bu muhtemelen, semial epitelin duyusal doğası ile birleştiğinde, minimum manipülasyon ile hücreden hücreye bağlantı köprülerinin kırılmasına yol açabilen ima edilen mekanik stresten kaynaklanmaktadır Probidyum iyodür boyama için, hücre süspansiyonuna mililitre başına 50 mikrogramlık bir nihai konsantrasyonda çözeltide numune analizinden 10 dakika önce ve karanlıkta sıfır santigrat derece inkübe edin Probidyum mu leke hücrelerini analiz etmek için. Daha fazla sıralama için, 488 nanometrede yaymak üzere ayarlanmış tutarlı bir targon iyon lazeri ile donatılmış bir faks vantage akış sitometresi kullanıyoruz. Lazer gücü yüz miliwatt'a ayarlanmıştır ve yaydığım propidyum floresan, 5 7 5 eğik çizgi 26 bant geçiren filtre kullanılarak bir FL iki dedektör toplanır.

Akış sitometrisi ölçümleri için 70 mikrometrelik bir nozul ve aşağıdaki parametreleri analiz etmek için squa yazılımı kullanın. İleri saçılma tarafı saçılması, toplam yayılan floresan veya darbe alanı ve floresan emisyonlarının süresi veya darbe genişliği. Sonuçlar, her bir floresan seviyesindeki olayların sayısını temsil eden gram cinsinden ve yan saçılmaya karşı floresan darbe alanını ve genişliğine karşı floresan darbe alanını gösteren D grafiklerinde sunulur.

Çiftler, normal R veya normal C'de faks avantajı ayarlı sıralama modu ile SM monosit popülasyonlarını sıralamak için genişliğine karşı floresan darbe alanının DO grafikleri kullanılarak analizden çıkarılır ve zarf olarak üç sıralanmış damla kullanılır. Hücreleri saniyede 500 ila 1500 hızında analiz etmek için örnek farkını ayarlayın. Bir soğutma ünitesi kullanarak numune ve toplama tüplerini üç ila dört santigrat derece tutun.

Alternatif olarak, süspansiyondaki hücreler diğer florokromlarla boyanabilir. Örneğin, hayati boya. HER 3, 3, 3, 4, 2, mililitre başına beş mikrogramlık bir nihai konsantrasyona kadar kullanılabilir ve Hirsch için ışıktan korunarak 37 derecede en az 10 dakika inkübe edilebilir.

3, 3, 3, 4, 2 leke örnekleri. Hücre analizi, 25 miliwatt'ta çalışan bir UV uyarma dalga boyu lazeri ve 70 mikrometrelik bir nozul ile donatılmış bir MO akış sitometresi vasıtasıyla gerçekleştirilmiştir. Hücre süspansiyonları yüz kontrast optikleri altında analiz edildiğinde daha önce belirtilen aynı parametreleri analiz etmek için Summit 4.3 yazılımını veya benzerini kullanın, kesim kalitesi süspansiyonları gözlenir.

Bu protokolün başlıca avantajları, ilk etapta testis hücre süspansiyonlarının birçok makine kullanılarak hazırlanması ve test sezaryeni, doku kesme, ach, makine işleme ve filtrasyon dahil olmak üzere sadece 15 dakika elde edilmesidir, bu süre genellikle diğer protokoller tarafından alınan sürenin yaklaşık sekizde biri kadardır. Bu protokolün kısalığı, minimal bir teslimle birlikte, kısa ömürlü makromoleküllerin iyi bir şekilde korunmasını açıklayacaktır, bu da orijinal hücre popülasyonunda bulunan bileşiklerin temsili bir örneği gerektiğinde kritik öneme sahiptir. Metan minimum işlem gerektirdiğinden, bu tabloda kolayca tekrarlanabilir.

Yetişkin sıçanlarla gerçekleştirilen ve akış sitometrisi ile analiz edilen yedi bağımsız deney için farklı testis hücresi popülasyonlarının nispi yüzdeleri, yöntemin tekrarlanabilirliğini göstermek için bir örnek olarak sunulmuştur. Testis hücresi süspansiyonlarının hazırlanması için şu anda kullanılan partiküllerin çoğundan farklı olarak, burada sunulan yöntem enzimatik etki içermez. Genel olarak dahil edilen enzimler olan RNA'larda kollajenaz damlası, dokunun ayrışmasında yetersiz katkıda bulunsa da, ilgilenilen makromoleküllerin korunmasını etkileyebilir.

Enzimatik tedavilerin eksikliği sadece RNA ve protein korumasını desteklemekle kalmaz, aynı zamanda bir protokolü daha ucuz hale getirir. Mekanik olarak hazırlanmış hücre süspansiyonlarının, trips ile inize edilmiş olanlardan daha kolay topaklandığı daha önce bildirilmiş olsa da, bu protokolün, enzimatik etki ben'in yokluğunda iyi ayrılmış hücre süspansiyonlarına yol açtığını bulduk. NDA'nın dahil edilmesinin hücre topaklanmasını önlemede çok yardımcı olduğu kanıtlanmıştır.

Süspansiyonların iyi kalitesi, numuneler, gözlemlenen minimum hücre kalıntısı tarafından değerlendirildiği gibi sitometrik analize tabi tutulduğunda da kanıtlanır. Yayınlanan bilgilere göre, yuvarlak spermlerin yaklaşık% 13'ü, hücre süspansiyonları yalnızca mekanik bir yöntemle hazırlandığında veya tripsin varlığında çok çekirdekli olarak bulunur. Bununla birlikte, makine tarafından hazırlanan birçok süspansiyon, çok çekirdeklilerin esas olarak doku manipülasyonunun bir sonucu olarak üretildiği belirtildiğinden, büyük olasılıkla dolaşmayı azaltmak nedeniyle çok çekirdekli çok çekirdekli hale getirir.

Bu resimde, sıçan testisinden makine tarafından hazırlanan birçok hücre süspansiyonunun bir örneği görülmektedir. Görüldüğü gibi. Sitoplazmalar iyi korunmuştur, farklı kemirgenler için makine tarafından hazırlanan birçok testis süspansiyonunda C, iki C ve dört C hücre popülasyonunun nispi yüzdeleri, sağlam PE'lerinkileri yeniden birleştirmiştir.

Bu, burada açıklanan yöntemin herhangi bir spesifik hücre tipine seçici olarak zarar vermediği varsayımını desteklemektedir. Şaşırtıcı bir şekilde, makinede hazırlanan birçok süspansiyonda hücre tipi gösterimi, klasik damlama pimi hazırlama yöntemlerine göre çok daha iyi korunur. Görülebileceği gibi, meine işlenmiş testis hücresi süspansiyonları için elde edilen sito grafikleri, daha önce bildirilenlerden önemli ölçüde sapmamaktadır.

Aslında, elde edilen histogramlar ve nokta grafikleri, DNA içeriğine dayalı olarak üç karakteristik dört C ila C ve C testis hücresi popülasyonunun yanı sıra, yüksek oranda yoğunlaştırılmış haploid spermatozoayı temsil eden görünüşte subha popülasyonunu sergiler. Bu profiller sırasıyla sürekli veya propidyum iyodür leke süspansiyonları için gözlendi ve bu, yetişkin ve genç örnekler için de geçerlidir. Sper mitojenik hücrelerin sınıflandırılması, DNA içeriğine dayalı seçilmiş testis popülasyonları için veya hatta aynı DNA içeriğine sahip, ancak uyku tine ve çatal miyositleri gibi farklı kromatin yoğunlaşma seviyelerine sahip alt popülasyonlar için% 98'in üzerinde saflıkla başarılı bir şekilde gerçekleştirilmiştir.

Gine domuzu test süspansiyonlarında gözlemleyebileceğimiz gibi, protokol RNA tedavisini içermediğinden, sıralanmış popülasyonlar iyi RNA kalitesi sağlar ve propidyum iyodür lekeli popülasyonlar için bile diferansiyel gen ekspresyonu çalışmalarına izin verir. Bu anlamda, diğer boyalardan farklı olarak, propidyum iyodür boyalarının, DNA'nın yanı sıra çift sarmallı RNA'nın da bulunduğunu hatırlatmakta fayda var, ancak bu grafikte bir kobay testis süspansiyon analizinde, canlı hale getirilmiş döngü turuncu ile paralel olarak propidyum iyodür kullanılarak elde edilen benzer profiller elde edilmektedir. Bu, hayati bir DNA spesifik boyadır, RNA boyamanın sitometrik histogram modellerini önemli ölçüde etkilemediğini gösterir.

Bu liste, yüzdelik protokolün temel avantajlarını özetlemektedir. Burada açıklanan optimize edilmiş yöntem, testis diseksiyonu, doku kesme ve ME makine sistemi aracılığıyla işleme dahil olmak üzere sadece 15 dakika içinde kemirgenlerden farklı sperm aşamalarının sitometrik analizi için uygun testis hücresi süspansiyonlarının hazırlanmasını hızlandırmaya izin verir. Hücre süspansiyonlarındaki kısalık, daha yüksek tekrarlanabilirlik kalitesi ve hücre tipi oranları, onu şu anda kullanımda olan diğer, daha sıkıcı ve zaman alıcı kendi kendine hazırlama teknikleri için iyi bir alternatif haline getirmektedir.

Ayrıca, bu yöntem çok az manipülasyon içerdiğinden ve enzimlerden ve deterjanlardan kaçındığından, gen ekspresyonu çalışmaları gibi hassas alt uygulama için ideal bir seçimdir.