Name: Testis Hücre Cezalı Hazırlanması için basit ve Verimli Tekniği (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 33 s
Description: Öğrenin, kemirgen testis dokusundan enzimatik işlem kullanmadan yüksek kaliteli hücre süspansiyonu hazırlama yöntemini. Bu hızlı protokol akış sitometrisi ve gen ekspresyonu çalışmaları için idealdir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma kısmen CSIC (I + D proje C022) ve PEDECIBA tarafından desteklenmiştir. Yazarlar yavaşça bu projede kullanılan tüm kobay örnekler sağlamak için MoFlo hücre sıralayıcı ve Merial-Montevideo ile ilgili cömert işbirliği için Hücre Biyolojisi Birimi (Institut Pasteur de Montevideo) den Mariela Bollati ve Valentina Porro teşekkür etmek istiyorum. Şekil 1 Şekil 2 ve 3, ve S. Karger AG, Basel izni ile Tablo 1,, BioMed Central izni ile yeniden ve Şekil 4 ve 5 John Wiley &amp; Sons, Inc (ait telif hakkı izni ile çoğaltılamaz veya uyarlandı Wiley- Blackwell, 2011).

1. Hücre süspansiyonlarının hazırlanması <ol><li> Bu IACUC veya eşdeğeri olarak özel komitelerin önerileri takip kullanılacak örnek Sacrifice (Uruguay, Ulusal Komisyonu Hayvan Deney için [CNEA]). Bizim durumumuzda, pentobarbital aşırı dozda uygulandı. </li><li> Onaylı Standart prosedürler takip testis ayır ve buz gibi soğuk 10 mi DMEM içeren, buz üzerinde bir 96 mm cam petri tabağına yerleştirin,% 10 fetal dana serumu ile desteklenmiştir. </li><li> Tunika albuginea çıkarın ve 2 kare parçalar halinde Decapsulated testis kesmek - Her iki tarafta 3 mm. </li><li> Bu parçalar daha sonra bir Medimachine, doku bir delikli paslanmaz çelik ekran ve bir metal rotor içeren bir tek birim içinde ayrıştırılmış bir otomatik mekanik taşlama işlenir. 50 mikron tek birim, disaggregator açın ve süreç içinde bu parçaları 5 - Bunu yapmak için, soğuk yerine 1 ml DMEM ve 4 takviye<html> üreticisinin basit yönergeleri izleyerek 50 sn. </li><li> Iğne olmadan 5 ml şırınga - 3 kullanarak ayrıştırma ünitesinden çıkan hücre süspansiyonu kurtarın. </li><li> 0.5 ml DMEM takviye ile daha önce ıslatılmış 50 mikron naylon örgü, süzülmeye. </li><li> Bir batırılmış 25 mikron naylon örgü, ve buz üzerinde yer kullanarak tekrar süspansiyon filtre. </li><li> Bir Neubauer odasında saymak ve 1 ile hücresel konsantrasyonu ayarlayın - 2 x 10 7 hücre / ml desteklenmiş DMEM ile. En az 4 x 10 7 hücre / testis malzemesinin gramı Ortalama elde edilir. </li><li> Son olarak, hücre topaklanma önlemek için% 0.2 &#39;lik nihai bir konsantrasyona kadar (2-naftol-6 ,8-disülfonik asit, dipotasyum tuzu) NDA ekleyin. </li><li> İsteğe bağlı: Üreticinin talimatları izleyerek, hayvan hücreleri için bir ticari canlılığı kiti ile testis hücre süspansiyonları hücre canlılığı kontrol edin. </li></ol> 2. Akış Sitometrik Analizi ve_content &quot;&gt; Biz propidyum iyodür yüksek konsantrasyonlarda (PI) ile lekeli hücrelerin analizi için 488 nm dalga boyunda yayan ayarlı bir Coherent argon iyon lazer ile donatılmış, bir Becton-Dickinson FACSVantage akış sitometresi kullandık. (sabitlenmemiş içine PI giriş sorunu stres altında hücreleri) başka bir yerde 9,10 ele alınmıştır. <ol><li> PI boyama için, 50 hücre süspansiyonu ug / ml &#39;lik bir son konsantrasyonda florokrom ekleyin ve 0 ° C&#39;da 10 dakika ° C&#39;de karanlıkta inkübe edin. </li><li> Lazer gücü 100 mW ve 575/26 bant geçiren filtre FL2 PI-yayılan floresan toplamak için kullanılır ayarlanır. </li><li> Biz bir 70 mikron nozul ile FC ölçümleri. Spermatosit nüfus sıralama için, zarf olarak 3 sıralama kriteri damla kullanarak, Normal-R veya Normal-C modunda sıralama ayarlayın. 3 de örnek ve toplama tüpleri tutun - 4 ° C soğutma ünitesi kullanarak. Saniyede 1.500 500 oranında hücreleri analiz etmek için örnek diferansiyel ayarlayın. </li><li> Analiz etmek CellQuest yazılım (BD) kullanınAşağıdaki parametreleri: forward scatter (FSC-H); tarafında dağılım (SSC-H), toplam yayılan floresan veya darbe alan (FL2-A) ve floresan emisyon veya darbe genişliği (FL2-W) süresi. </li></ol> Alternatif olarak, 5 mg / ml &#39;lik bir nihai konsantrasyona kadar önemli bir boya Hoechst 33342 kullanılan ve 37 dakika 10 ° C&#39;de karanlıkta inkübe var. Hücre analizi bir MoFlo Sitometreyi (DakoCytomation) aracılığıyla 25 mW bir UV dalgaboyu lazer çalışma ile donatılmış ve 70 mikron nozul kullanılarak yapılmıştır. Veri işleme Zirvesi v4.3 yazılımı (DakoCytomation) ile yapıldı.

<ol><li>Meistrich, M. L. Separation of spermatogenic cells and nuclei from rodent testes. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMeistrich%2C+ML+%22Methods+of+Cell+Biology%22">Methods of Cell Biology</a>. Prescott, D. M. 15, Academic Press. New York. 15-54 (1977).</li>
<li>Lam, D. M. K., Furrer, R., Bruce, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+separation%2C+physical+characterization%2C+and+differentiation+kinetics+of+spermatogonial+cells+of+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">The separation, physical characterization, and differentiation kinetics of spermatogonial cells of the mouse.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 65, 192-199 (1970).</li>
<li>Romrell, L. J., Bellve, A. R., Fawcet, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+mouse+spermatogenic+cells+by+sedimentation+velocity%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Separation of mouse spermatogenic cells by sedimentation velocity.</a> Dev. Biol. 19, 119-131 (1976).</li>
<li>Geisinger, A., Rodríguez-Casuriaga, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+for+gene+expression+studies+in+mammalian+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cytogenet.+Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry for gene expression studies in mammalian spermatogenesis.</a> Cytogenet. Genome Res. 128, 46-56 (2010).</li>
<li>Getun, I. V., Torres, B., Bois, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+purification+of+mouse+meiotic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry purification of mouse meiotic cells.</a> J. Vis. Exp. (50), e2602(2011).</li>
<li>Meistrich, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+mouse+spermatogenic+cells+by+velocity+sedimentation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Separation of mouse spermatogenic cells by velocity sedimentation.</a> J. Cell Physiol. 80, 299-312 (1972).</li>
<li>Meistrich, M. L., Bruce, W. R., Clermont, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+composition+of+fractions+of+mouse+testis+cells+following+velocity+sedimentation+separation%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Cellular composition of fractions of mouse testis cells following velocity sedimentation separation.</a> Exp. Cell Res. 79, 213-227 (1973).</li>
<li>Malkov, M., Fisher, Y., Don, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+schedule+of+the+postnatal+rat+testis+determined+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Rep%22%5BJournal%5D)">Developmental schedule of the postnatal rat testis determined by flow cytometry.</a> Biol. Rep. 59, 84-92 (1998).</li>
<li>Rodríguez-Casuriaga, R., Geisinger, A., Santiñaque, F., López, B., Folle, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-purity+flow+sorting+of+early+meiocytes+based+on+DNA+analysis+of+guinea+pig+spermatogenic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">High-purity flow sorting of early meiocytes based on DNA analysis of guinea pig spermatogenic cells.</a> Cytometry A. 79, 625-634 (2011).</li>
<li>Davey, H. M., Hexley, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Red+but+not+dead%3F+Membranes+of+stressed+Saccharomyces+cerevisiae+are+permeable+to+propidium+iodide%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Red but not dead? Membranes of stressed Saccharomyces cerevisiae are permeable to propidium iodide.</a> Environ. Microbiol. 13, 163-171 (2011).</li>
<li>Rodríguez-Casuriaga, R., Geisinger, A., López-Carro, B., Porro, V., Wettstein, R., Folle, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-fast+and+optimized+method+for+the+preparation+of+rodent+testicular+cells+for+flow+cytometric+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Proced.+Online%22%5BJournal%5D)">Ultra-fast and optimized method for the preparation of rodent testicular cells for flow cytometric analysis.</a> Biol. Proced. Online. 11, 184-195 (2009).</li>
<li>Spanò, M., Evenson, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+analysis+for+reproductive+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric analysis for reproductive biology.</a> Biol Cell. 78, 53-62 (1993).</li>
</ol>

Burada açıklanan optimize yöntemi enzim ve deterjan tedavi kaçınarak ve iyi hücre bütünlüğü ve tipi oranlarını koruyarak, çok hızlı ve tekrarlanabilir bir şekilde kemirgen testis dokusundan hücre süspansiyonları hazırlanması sağlar. Prosedürü (15 dakika süresi testis diseksiyonu, doku kesme ve işleme dahil), yer az işleme ve enzimatik tedavilerin yokluğu kısalık en önemli avantajlarından bazılarıdır. Tüm bu orijinal hücre popülasyonu bulunan bileşiklerin temsil eden bir örneklem gerektiğinde önemlidir kısa yaşam makromo...

<table><tbody><tr><td>Medimachine sistemi</td><td>BD</td><td>340587</td><td></td></tr><tr><td>Medicon ünitesi (50 &mu; m)</td> <td>BD</td><td>340591</td><td></td></tr><tr><td>Filcon ünitesi (50 &mu; m)</td> <td>BD</td><td>340603</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>430-2100</td><td></td></tr><tr><td>Fetal buzağı serumu</td><td>PAA</td><td>A11-151</td><td></td></tr><tr><td>NDA</td><td>Chemos BmbH</td><td>277081</td><td></td></tr><tr><td>H & # 8211; chst 33342</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>14533</td><td>Stok çözeltisi 5 mg / ml; 5 & mu'luk bir nihai konsantrasyonda kullanılır; g/ml</td></tr><tr><td>Propidium iyodür</td><td>Sigma-Aldrich 287075</td><td></td><td>Stok çözeltisi 1 mg/ml; 50 & mu'luk bir nihai konsantrasyonda kullanılır; g/ml</td></tr></tbody></table>

testis hücre cezalı hazırlanması için basit ve verimli tekniği

Simple and Efficient Technique for the Preparation of Testicular Cell Suspensions

Memeli testis somatik testis hücreleri ve eşey hücrelerinde farklı aşamalarında dahil olmak üzere 30 farklı hücre tipleri, içeren çok karmaşık organlardır. Bu heterojenlik sperm gelişimi belirli aşamalarında saf ya da zenginleştirilmiş hücre popülasyonlarının en moleküler analizler 1 için gerekli olduğu gibi, memeli spermatogenez üsleri, çalışmaları ile ilgili önemli bir sorun var. Bu Staput 2,3, santrifüj elutrasyon 1, ve akış sitometri gibi çeşitli stratejileri (FC) 4,5 diferansiyel gen ekspresyon çalışmaları sağlamak amacıyla zenginleştirilmiş ya da saflaştırılmış testiküler hücre popülasyonlarının elde etmek için kullanılmıştır. Bu hücrelerin en zenginleştirme / saflaştırma yaklaşımlar için süspansiyon içinde olduğu gereklidir. İdeal olarak, hücre süspansiyonu orijinal dokunun temsili olacak, canlı hücreler ve az multinucleates yüksek bir oranda olması - çünkü şekline eğilimindedirve eksikliği hücre kümeleri 1 - seminifer epitel 6,7 sinsisyal doğası. Önceki raporlar sadece mekanik yöntemle hazırlanan testiküler hücre süspansiyonları tripsinize olanlar 1&#39;den daha kolay clumped olduğunu kanıtladığı vardı. RNases ve / veya tripsin ve belirli alt uygulamalar için istenmeyen belirli makromoleküller bozulma, kollajenaz gibi kurşun ayırmak enzimler ile diğer yandan, enzimatik işlemlerin. İdeal süreci, mRNA gibi ilgi makromoleküllerin iyi bir koruma elde edilmesi amacıyla, mümkün olduğunca kısa ve minimal manipülasyon içermelidir. Katı dokulardan hücre süspansiyonlarının hazırlanması için mevcut protokoller genellikle zaman alan ve yüksek operatöre bağlı olan ve seçici olarak belirli bir hücre tipi 1,8 zarar verebilir. Burada sunulan protokol bir ile son derece tekrarlanabilir ve son derece kısa bir mekanik ayrıştırma avantajlarını birleştirirAkış sitometrik analizi ve sıralama 4 ve art gen ekspresyon çalışmaları 9 için kullanılabilecek iyi kalitede hücre süspansiyonları yol açan enzimatik tedavi bsence.

Burada tarif edilen protokol ile hazırlanan fare testis, iyi ayrıştırılmış hücre süspansiyonu, bir örneği Şekil 1&#39;de gösterilmiştir. Enzimatik tedavi 6,8 ve daha önce açıklanan mekanik ayrıştırma yöntemleri 2 ile karşılaştırıldığında, burada sunulan bir (özellikle diğer mekanik göre, çok daha hızlı daha az işleme içerir, (değil operatöre bağlı) kolayca tekrarlanabilir ve kıt hücre artıkları vermektedir yöntem) ve çok az multinucleates (geniş doku ma...

Enzimler ve deterjan kaçınarak kemirgen malzemeden testis hücre süspansiyonları, mekanik hazırlanması için bir yeni protokol tarif edilmektedir. Yöntem çok basit, hızlı, tekrarlanabilir ve akış sıralama ve RNA ekstraksiyon için uygun kaliteli hücre süspansiyonları, vermektedir.

Testis Hücre Cezalı Hazırlanması için basit ve Verimli Tekniği

Mammalian testes are very complex organs that contain over 30 different cell types, including somatic testicular cells and different stages of germline ...

Bu videoda, kemirgenlerden test materyalinin hücresel süspansiyonunu sadece 15 dakika içinde elde etmek için oldukça basit ve etkili bir protokol sunulacaktır. Bu yöntem fare, sıçan ve kobay farelerinden alınan test materyalleri üzerinde uygulanmış olup, kapsüllenmiş dokuyu ayrıştırmak için bir meta makinesi cihazı kullanmaktadır. Filtrasyon ve boyama işlemlerinin ardından, hücre süspansiyonu akış sitometrisi için hazır hale gelir.Sito analiz veya ayıklama Hücre popülasyonlarının homojenliği, erkek GA diferansiyasyonu sırasındaki biyokimyasal ve moleküler olayların analizi için ön koşuldur. Bu nedenle, 30'dan fazla farklı hücre tipinin bulunduğu testiküler heterojenlik, memeli spermatogenezinin moleküler temelinin incelenmesiyle ilgili ana problemlerden birini teşkil eder. Bu nedenle, PU ve santrifüj ayırma da dahil olmak üzere, zenginleştirilmiş veya saflaştırılmış testiküler hücre popülasyonları elde etmek için çeşitli yöntemler kullanılmıştır.Herhangi bir hücre ayırma yöntemi için ilk adım, bir hücresel süspansiyonun hazırlanmasıdır. Ancak, mevcut protokoller genellikle zaman alıcıdır ve sonraki ekspresyon analizleri için istenmeyen bir durum olan RNA'lar gibi kısa ömürlü moleküllerin kaybına yol açabilir. Burada sunulan protokolün temel avantajı, hayvan kurban edilmesi ile sperma evresine özgü moleküler çalışmalar arasındaki adımları ortadan kaldırması, ancak aynı zamanda hücresel süspansiyonlarda iyi kalite ve mükemmel hücre tipi temsilini sağlamasıdır.Prosedürü, yöntemi geliştiren AL Laboratuvarı araştırmacısı Dr. Ana Rodriguez ve sitometrik analizlerden sorumlu olan akış sitometrisi uzmanı Federico San Lopezle gösterecektir. Prosedür, medicon ve fcon aksesuarlarıyla birlikte meach sistemi adlı küçük bir ekipman gerektirir. Bununla birlikte, fcon aksesuarlarının yerine aynı gözenek boyutuna sahip naylon membranlar mükemmel şekilde kullanılabilir.Gerekli olan diğer malzemeler ve reaktifler cam yayma çubuğu, iki adet petri kabı, makas ve pens, üç ila beş mililitrelik bir şırınga, bağırsak odası, %10 fetal sığır serumu ve NDA ile desteklenmiş DMEM kültür ortamıdır. RNA manipülasyonlarını içeren alt uygulamalar planlanıyorsa, tüm malzemeler ve solüsyonlar protokolu gerçekleştirmek için buna uygun şekilde işleme tabi tutulmalıdır. Diseke edilen testisi, 10 mililitre desteklenmiş soğuk DMEM içeren 96 milimetrelik bir cam petri kabına yerleştirin.TAL Virginia'yı çıkarın, başsız testisi her kenarı iki ila üç milimetrelik kare parçalara bölün. Bu parçalardan dört ila beş tanesini, bir mililitre katkılı D kodu ile birlikte tek kullanımlık bir medikon içine yerleştirin ve meta makine sisteminde 50 saniye boyunca işleyin. Her medikon ünitesi, çevresi altı mikro bıçakla çevrili, yaklaşık yüz adet altıgen deliğe sahip sabit bir paslanmaz çelik ekrana sahiptir.Doku, medicon haznesinin içindeki metal bir rotor tarafından her bir deliğe getirilir ve ekran altındaki bir mikro pompanın sıvı sağladığı ve kabukları dışarı attığı esnada, keskin deliklerin üzerinden geçirilip metal elekten geçirilerek ayrıştırılır. Sonuç olarak elde edilen hücre süspansiyonu, medicon'dan iğnesiz üç ila beş milimetrelik bir şırınga kullanılarak geri alınır. Ardından, 50 mikrometre falcon veya aynı boyutlarda bir naylon ağ geçici olarak yarım mililitre besiyeri ile ıslatılır ve süspansiyon bunun üzerinden süzülür.Adımı, 25 µm naylon ağ veya eşdeğer bir falcon ünitesi kullanarak tekrarlayın ve buz üzerine yerleştirin, hücre süspansiyonundan bir alikot alarak noyer kamarasında sayın ve hücre konsantrasyonunu kültür ortamında 1-2 × 10⁷ hücre/mL olacak şekilde ayarlayın. Son olarak, hücre kümelenmesini önlemek ve sonraki akış çalışmalarında tıkanıklıkları engellemek için final konsantrasyonu %0,2 olacak şekilde NDA ekleyin. Hücre canlılığının değerlendirilmesi amaçlanıyorsa, bu işlem akış sitometrik analizden önce, üreticinin talimatları takip edilerek hayvan hücreleri için canlı-ölü canlılık kiti aracılığıyla floresan boya eklenerek gerçekleştirilebilir.Florokrom seçimi mevcut lazerlere bağlı olacaktır. Bu gösterimde, DNA'ya bağlanan farklı boyaların kullanımı gösterilecektir. Propidiyum iyodür, düşük konsantrasyonlarda fikse edilmiş veya ölü hücreler için yaygın olarak kullanılan boya olmasına rağmen, yüksek konsantrasyonlarda kullanıldığında, burada sunulan yöntemle hazırlanan süspansiyonlardaki fikse edilmemiş testis hücrelerine girdiğini saptadık.Bu durum, muhtemelen beraberinde gelen mekanik stresten kaynaklanmaktadır; bu stres, seminal epitelin duyusal doğasıyla birleştiğinde, minimal manipülasyonla hücreler arası bağlantı köprülerinin kopmasına yol açabilir. Propidium iyodür boyaması için, örnek analizinden 10 dakika önce, hücre süspansiyonuna 50 µg/mL nihai konsantrasyonda çözelti ekleyin ve 0 °C'de karanlıkta inkübe edin. Propidium iyodür boyalı hücrelerin analizi ve daha sonraki sıralama işlemleri için, 488 nm dalga boyunda yayım yapacak şekilde ayarlanmış koherent argon iyon lazerli bir FACS Vantage akış sitometresi kullanıyoruz. Lazer gücü 100 mW olarak ayarlanmış olup, propidium iyodürden yayılan floresans, 575/26 band geçişli filtre kullanılarak FL2 detektörü ile toplanmaktadır.Akış sitometrisi ölçümleri için 70 mikrometre nozul ve aşağıdaki parametreleri analiz etmek için squa yazılımı kullanın. İleri saçılma, yan saçılma, toplam yayılan floresans veya puls alanı ve floresan emisyonların süresi veya puls genişliği. Sonuçlar, her floresan seviyesindeki olay sayısını temsil eden grafikler ve yan saçılmaya karşı floresan puls alanını ve floresan puls alanına karşı genişliğini gösteren D grafikleri şeklinde sunulmuştur.SM monosit popülasyonlarının ayıklanması için fax vantage set ayıklama modu normal R veya normal C olarak ayarlanmışken, floresan darbe alanı ile genişliği arasındaki DO grafikler kullanılarak dubletler analizden hariç tutulur ve zarf olarak üç ayıklanmış damla kullanılır. Hücreleri saniyede 500 ila 1500 hızında analiz etmek için örnek diferansiyeli ayarlayın. Bir soğutma ünitesi kullanarak örnek ve toplama tüplerini üç ila dört derece santigratta tutun.Alternatif olarak, süspansiyondaki hücreler diğer florokromlarla boyanabilir. Örneğin, vital boya HER 3 3 3 4 2, nihai konsantrasyonu 5 µg/mL olacak şekilde kullanılabilir ve ışıktan korunarak 37 °C'de en az 10 dakika boyunca inkübe edilebilir.3, 3, 3, 4, 2 boyanmış örnek. Hücre analizi, 25 milliwatt gücünde çalışan bir UV eksitasyon dalga boyu lazerine ve 70 micrometer nozula sahip bir MO akış sitometresi ile gerçekleştirilmiştir. Hücre süspansiyonları faz kontrast optiği altında analiz edilip kesim kalitesi süspansiyonları gözlemlendiğinde, daha önce belirtilen aynı parametreleri analiz etmek için Summit 4.3 yazılımını veya benzerini kullanın.Bu protokolün temel avantajları, öncelikle testis hücresi süspansiyonlarının çoklu cihaz kullanılarak hazırlanması ve test C-kesitini, doku kesimini, homojenizasyonu, cihazla işlemeyi ve filtrasyonu kapsayan toplam 15 dakikalık bir sürede tamamlanmasıdır; bu zaman aralığı, diğer protokollerin genellikle aldığı sürenin yaklaşık sekizinci birine tekabül eder. Bu protokolün kısalığı ve minimum işlem gerektirmesi, orijinal hücre popülasyonunda bulunan bileşiklerin temsili bir örneğine ihtiyaç duyulduğunda kritik öneme sahip olan, kısa ömürlü makromoleküllerin iyi korunmasını sağlar. Yöntem minimum işlem gerektirdiği için, bu tabloda kolayca yeniden üretilebilir.Yöntemin tekrarlanabilirliğini göstermek amacıyla, yetişkin sıçanlarla gerçekleştirilen ve akış sitometrisi ile analiz edilen yedi bağımsız deneydeki farklı testis hücresi popülasyonlarının bağıl yüzdeleri örnek olarak sunulmuştur. Testis hücresi süspansiyonlarının hazırlanmasında günümüzde kullanılan çoğu yöntemin aksine, burada sunulan yöntem enzimatik işlem içermemektedir. Genellikle dahil edilen enzimler olan kollajenaz damlaları RNA'larda dokunun yetersiz ayrışmasına katkıda bulunsa da, ilgilenilen makromoleküllerin korunmasını etkileyebilirler.Enzimatik işlemlerin kullanılmaması sadece RNA ve proteinlerin korunmasını desteklemekle kalmaz, aynı zamanda protokolün maliyetini de düşürür. Mekanik olarak hazırlanan hücre süspansiyonlarının, tripsinize edilmiş olanlara göre daha kolay kümeleştiği daha önce bildirilmiş olsa da, bu protokolün enzimatik etki olmaksızın iyi ayrıştırılmış hücre süspansiyonlarına yol açtığını gördük. NDA eklenmesinin, hücre kümeleşmesini önlemede oldukça faydalı olduğu kanıtlanmıştır.Süspansiyonların yüksek kalitesi, gözlemlenen minimum hücre kalıntısı ile değerlendirilen sitometrik analizle de kanıtlanmaktadır. Yayınlanmış bilgilere göre, hücre süspansiyonları tamamen mekanik bir yöntemle veya tripsin varlığında hazırlandığında, yuvarlak spermlerin yaklaşık %13'ü çok çekirdekli olarak bulunur. Bununla birlikte, makine ile hazırlanan birçok süspansiyon oldukça az sayıda çok çekirdekli hücre vermektedir; bu durum, büyük olasılıkla çok çekirdekli hücrelerin temel olarak doku manipülasyonu sonucunda oluştuğu belirtildiği için, azalmış dolaşıklığa bağlıdır.Sıçan testisinden Minced-Machine yöntemiyle hazırlanan bir hücre süspansiyonu örneği bu resimde görülmektedir. Görüldüğü üzere, sitoplazmalar iyi korunmuştur; farklı kemirgenlerde Minced-Machine ile hazırlanan testiküler süspansiyonlardaki 2C ve 4C hücre popülasyonlarının göreceli yüzdeleri, sağlam testislerin değerleriyle benzerlik göstermiştir.Bu durum, burada açıklanan yöntemin herhangi bir spesifik hücre tipine seçici olarak zarar vermediği varsayımını desteklemektedir. Şaşırtıcı bir şekilde, makine ile hazırlanan birçok süspansiyondaki hücre tipi temsili, klasik damlatma hazırlama yöntemlerine göre çok daha iyi korunmaktadır. Görülebileceği üzere, işlem görmüş testis hücresi süspansiyonları için elde edilen sitografik veriler, daha önce bildirilenlerden önemli ölçüde farklılık göstermemektedir.Aslında, elde edilen histogramlar ve nokta grafikleri, DNA içeriğine dayalı olarak üç karakteristik 4C'den C'ye ve C testis hücresi popülasyonlarının yanı sıra, oldukça yoğunlaşmış haploid spermatozoaları temsil eden görünür subhaploid popülasyonu sergilemektedir. Bu profiller, sırasıyla sürdürülebilir veya propidyum iyodür boyalı süspansiyonlar için gözlemlenmiş olup, bu durum hem yetişkin hem de genç örnekler için geçerlidir. Spermatogenik hücrelerin ayıklanması, DNA içeriğine dayalı seçilmiş testis popülasyonları veya aynı DNA içeriğine sahip ancak farklı kromatin yoğunlaşma seviyelerine sahip olan leptoten ve pachyten miyositleri gibi alt popülasyonlar için %98'in üzerinde saflıkla başarıyla gerçekleştirilmiştir.Gine domuzu test süspansiyonlarında gözlemleyebileceğimiz üzere, protokol RNA işlemini içermediği için ayrıştırılmış popülasyonlar iyi RNA kalitesi sunmakta ve propidyum iyodür ile boyanmış popülasyonlar için bile diferansiyel gen ekspresyon çalışmalarına olanak sağlamaktadır. Bu bağlamda, diğer boyaların aksine propidyum iyodürün DNA'nın yanı sıra çift zincirli RNA'yı da boyadığını hatırlatmakta fayda vardır; ancak, bir gine domuzu testis süspansiyon analizine ait bu grafiklerde, propidyum iyodür ile DNA'ya özgü hayati bir boya olan vibrantized cycle orange'ın paralel kullanımında elde edilen benzer profiller, RNA boyamasının sitometrik histogram paternlerini önemli ölçüde etkilemediğini göstermektedir.Bu liste, sunulan protokolün temel avantajlarını özetlemektedir. Burada açıklanan optimize edilmiş yöntem; testis diseksiyonu, doku kesimi ve ME makine sistemi aracılığıyla işlemenin dahil olduğu süreçle, kemirgenlerin farklı sperm evrelerinin sitometrik analizi için uygun testis hücresi süspansiyonlarının hazırlanmasını sadece 15 dakikaya indirerek hızlandırmaktadır. Kısalığı, daha yüksek tekrarlanabilirlik kalitesi ve hücre süspansiyonlarındaki hücre tipi oranları, bu yöntemi halihazırda kullanılan diğer daha zahmetli ve zaman alıcı manuel hazırlama teknikleri için iyi bir alternatif haline getirmektedir.Ayrıca, bu yöntem çok az manipülasyon gerektirdiği, enzim ve deterjan kullanımından kaçındığı için gen ekspresyon çalışmaları gibi hassas alt uygulamalar için ideal bir seçimdir.

simple-efficient-technique-for-preparation-testicular-cell

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Belirli doku tiplerinin hücreleri Dissociating doku aggitation için belirli parametreler uygulanabilir kültürlenebilen hücrelerinin yüksek ses elde etmek için gereklidir. Miltenyi gentleMACS Dissociator basit, pratik bir protokol ile bu görevi en iyi hale getirir. Bu yayında, nerual doku bu cihazların kullanımı açıklanmıştır.

Fare Sinir Doku Hücre Tek Cezalar Üretimi

Bu video, testislerin bir bileşeni olan fare seminifer tübüllerinden Sertoli hücrelerinin izolasyon prosedürünü göstermektedir. Enzimatik sindirim ve tekrarlanan yıkamalar, Sertoli hücrelerinin çözeltiye salınmasını teşvik eder, bu da çoğalma ve büyüme için daha fazla kültürlenebilir.

Fare Seminifer Tübüllerinden İmmün Düzenleyici Sertoli Hücrelerinin İzolasyonu

Erişkin farelerin spermatogoniumların ve progenitör hücre hatları türetmek ve korumak için basit bir yöntem sunulmuştur. Yöntemi yetişkin fare testis somatik hücre bölmesi kaynaklanan besleyici hücreler kullanır. Bu teknik transgenik, knock-out dahil, ortak fare suşları, uygulanabilir ve knock-fareler.

Uzun vadeli Yetişkin Fare SSC Hatları türetilmesi için Kültür Spermatogonial Kök ve progenitör hücrelerin Seri Zenginleştirme (DGM)

STA-PUT yöntem büyüklüğü ve yoğunluğuna bağlı olarak spermatojenik farklı hücre popülasyonlarının ayrılması sağlar.

STA-PUT Hız Sedimentasyon kullanma spermatogenic Hücre Tiplerinin Ayrılması

Buradaki materyal testis germ hücrelerinin üç boyutlu kromatin yapısını korumak için geliştirilen bir yöntemi açıklamaktadır. Bu, üç boyutlu (3D) slayt yöntemi olarak ad verilmiştir. Bu yöntem subnükleer yapıların tespiti için hassasiyeti artırır ve immünoresans, DNA ve RNA floresan in situ hibridizasyon (FISH) için geçerlidir.

Testis Germ Hücrelerinin Üç Boyutlu Kromatin Mimarisini Korumak için Slayt Hazırlama Yöntemi

Birincil Sertoli hücreleri immüno özelliklerinin iltihap ya da enfeksiyon ve yararlanma sırasında testis immün ayrıcalığı, sinyal transdüksiyonunu çalışmak için gereklidir. Burada yüksek derecede saflaştırılmış birincil Sertoli hücreleri ve sıçan testis peritübüler hücrelerin izolasyonu için bir enzim bazlı protokol açıklar.

Sıçan Testislerindeki Sertoli Hücreleri İzolasyon ve peritübüler Hücreler

Bu çalışma, farklı memeli türlerinin testiküler dokusundan saflaştırılmış germ hücresi popülasyonlarının elde edilmesi için bir yöntemin standartlaştırılmasını açıklamaktadır. Mekanik testis ayrışmasını, Hoechst-33342 ve propidyum iyodür ile boyamayı ve FACS sınıflandırmasını birleştiren basit bir protokoldür ve erkek üreme biyolojisi karşılaştırmalı çalışmalarında geniş uygulamalar yapılmıştır.

Memeli Erkek Germ Hücrelerinin Çok Denekli Saflaştırılmasında Standart Bir Yaklaşım, Mekanik Doku Ayrılma ve Akış Sitometrisi ile

Burada sunulan pachytene spermatositler zenginleştirmek için bir protokol, yuvarlak spermatidler, ve yetişkin fare testislerinden uzayan spermatidler standart laboratuvar ekipmanları ile bir kesintili sığır serum albumin yoğunluğu gradyanı kullanarak.

Standart Laboratuvar Ekipmanları Kullanılarak Fare Testlerinden Pachytene Spermatosit ve Spermatidlerin Zenginleşmesi

Burada, ticari olarak mevcut mikrokuyu kültür sistemini kullanarak testis spesifik doku mimarisi ile domuz testis organoidlerinin tekrarlanabilir üretimi için bir protokol sıyoruz.

Microwell Kültürü kullanılarak Testis'e Özgü Mimariye Sahip Domuz Testis Organoidlerinin Üretimi

Burada primer neonatal murine testis hücrelerinden testis organoidi üretmek için dört yöntem tanımlanmıştır. Bu teknikler birden fazla araştırma uygulamasına sahiptir ve özellikle testis gelişimi ve fizyolojisi in vitro eğitimi için yararlıdır.

Ekstra Hücresel Matris Tabanlı ve Ekstra Hücresel Matrissiz Murine Testiküler Organoidlerin Üretimi

Burada yetişkin fare testislerinden canlı meiotik ve post-meyotik mikrop hücrelerini izole etmek için basit ve etkili bir yöntem salıyoruz. Düşük sitotoksisite, menekşe heyecanlı DNA bağlayıcı boya ve floresan-aktive hücre sıralama kullanarak, bir birçok downstream uygulamaları için son derece zenginleştirilmiş spermatojenik hücre popülasyonları izole edebilirsiniz.

Mor-Heyecanlı Hücre-Geçirgen DNA Bağlayıcı Boya Kullanılarak Murine Spermatojenik Hücrelerin İzolasyon

Öğrenin, kemirgen testis dokusundan enzimatik işlem kullanmadan yüksek kaliteli hücre süspansiyonu hazırlama yöntemini. Bu hızlı protokol akış sitometrisi ve gen ekspresyonu çalışmaları için idealdir.

Testis Hücre Cezalı Hazırlanması için basit ve Verimli Tekniği

Daha fazla video keşfet