Name: Testis Hücre Cezalı Hazırlanması için basit ve Verimli Tekniği (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 33 s
Description: Öğrenin, kemirgen testis dokusundan enzimatik işlem kullanmadan yüksek kaliteli hücre süspansiyonu hazırlama yöntemini. Bu hızlı protokol akış sitometrisi ve gen ekspresyonu çalışmaları için idealdir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışma kısmen CSIC (I + D proje C022) ve PEDECIBA tarafından desteklenmiştir. Yazarlar yavaşça bu projede kullanılan tüm kobay örnekler sağlamak için MoFlo hücre sıralayıcı ve Merial-Montevideo ile ilgili cömert işbirliği için Hücre Biyolojisi Birimi (Institut Pasteur de Montevideo) den Mariela Bollati ve Valentina Porro teşekkür etmek istiyorum. Şekil 1 Şekil 2 ve 3, ve S. Karger AG, Basel izni ile Tablo 1,, BioMed Central izni ile yeniden ve Şekil 4 ve 5 John Wiley &amp; Sons, Inc (ait telif hakkı izni ile çoğaltılamaz veya uyarlandı Wiley- Blackwell, 2011).

1. Hücre süspansiyonlarının hazırlanması <ol><li> Bu IACUC veya eşdeğeri olarak özel komitelerin önerileri takip kullanılacak örnek Sacrifice (Uruguay, Ulusal Komisyonu Hayvan Deney için [CNEA]). Bizim durumumuzda, pentobarbital aşırı dozda uygulandı. </li><li> Onaylı Standart prosedürler takip testis ayır ve buz gibi soğuk 10 mi DMEM içeren, buz üzerinde bir 96 mm cam petri tabağına yerleştirin,% 10 fetal dana serumu ile desteklenmiştir. </li><li> Tunika albuginea çıkarın ve 2 kare parçalar halinde Decapsulated testis kesmek - Her iki tarafta 3 mm. </li><li> Bu parçalar daha sonra bir Medimachine, doku bir delikli paslanmaz çelik ekran ve bir metal rotor içeren bir tek birim içinde ayrıştırılmış bir otomatik mekanik taşlama işlenir. 50 mikron tek birim, disaggregator açın ve süreç içinde bu parçaları 5 - Bunu yapmak için, soğuk yerine 1 ml DMEM ve 4 takviye<html> üreticisinin basit yönergeleri izleyerek 50 sn. </li><li> Iğne olmadan 5 ml şırınga - 3 kullanarak ayrıştırma ünitesinden çıkan hücre süspansiyonu kurtarın. </li><li> 0.5 ml DMEM takviye ile daha önce ıslatılmış 50 mikron naylon örgü, süzülmeye. </li><li> Bir batırılmış 25 mikron naylon örgü, ve buz üzerinde yer kullanarak tekrar süspansiyon filtre. </li><li> Bir Neubauer odasında saymak ve 1 ile hücresel konsantrasyonu ayarlayın - 2 x 10 7 hücre / ml desteklenmiş DMEM ile. En az 4 x 10 7 hücre / testis malzemesinin gramı Ortalama elde edilir. </li><li> Son olarak, hücre topaklanma önlemek için% 0.2 &#39;lik nihai bir konsantrasyona kadar (2-naftol-6 ,8-disülfonik asit, dipotasyum tuzu) NDA ekleyin. </li><li> İsteğe bağlı: Üreticinin talimatları izleyerek, hayvan hücreleri için bir ticari canlılığı kiti ile testis hücre süspansiyonları hücre canlılığı kontrol edin. </li></ol> 2. Akış Sitometrik Analizi ve_content &quot;&gt; Biz propidyum iyodür yüksek konsantrasyonlarda (PI) ile lekeli hücrelerin analizi için 488 nm dalga boyunda yayan ayarlı bir Coherent argon iyon lazer ile donatılmış, bir Becton-Dickinson FACSVantage akış sitometresi kullandık. (sabitlenmemiş içine PI giriş sorunu stres altında hücreleri) başka bir yerde 9,10 ele alınmıştır. <ol><li> PI boyama için, 50 hücre süspansiyonu ug / ml &#39;lik bir son konsantrasyonda florokrom ekleyin ve 0 ° C&#39;da 10 dakika ° C&#39;de karanlıkta inkübe edin. </li><li> Lazer gücü 100 mW ve 575/26 bant geçiren filtre FL2 PI-yayılan floresan toplamak için kullanılır ayarlanır. </li><li> Biz bir 70 mikron nozul ile FC ölçümleri. Spermatosit nüfus sıralama için, zarf olarak 3 sıralama kriteri damla kullanarak, Normal-R veya Normal-C modunda sıralama ayarlayın. 3 de örnek ve toplama tüpleri tutun - 4 ° C soğutma ünitesi kullanarak. Saniyede 1.500 500 oranında hücreleri analiz etmek için örnek diferansiyel ayarlayın. </li><li> Analiz etmek CellQuest yazılım (BD) kullanınAşağıdaki parametreleri: forward scatter (FSC-H); tarafında dağılım (SSC-H), toplam yayılan floresan veya darbe alan (FL2-A) ve floresan emisyon veya darbe genişliği (FL2-W) süresi. </li></ol> Alternatif olarak, 5 mg / ml &#39;lik bir nihai konsantrasyona kadar önemli bir boya Hoechst 33342 kullanılan ve 37 dakika 10 ° C&#39;de karanlıkta inkübe var. Hücre analizi bir MoFlo Sitometreyi (DakoCytomation) aracılığıyla 25 mW bir UV dalgaboyu lazer çalışma ile donatılmış ve 70 mikron nozul kullanılarak yapılmıştır. Veri işleme Zirvesi v4.3 yazılımı (DakoCytomation) ile yapıldı.

<ol><li>Meistrich, M. L. Separation of spermatogenic cells and nuclei from rodent testes. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMeistrich%2C+ML+%22Methods+of+Cell+Biology%22">Methods of Cell Biology</a>. Prescott, D. M. 15, Academic Press. New York. 15-54 (1977).</li>
<li>Lam, D. M. K., Furrer, R., Bruce, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+separation%2C+physical+characterization%2C+and+differentiation+kinetics+of+spermatogonial+cells+of+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">The separation, physical characterization, and differentiation kinetics of spermatogonial cells of the mouse.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 65, 192-199 (1970).</li>
<li>Romrell, L. J., Bellve, A. R., Fawcet, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+mouse+spermatogenic+cells+by+sedimentation+velocity%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Separation of mouse spermatogenic cells by sedimentation velocity.</a> Dev. Biol. 19, 119-131 (1976).</li>
<li>Geisinger, A., Rodríguez-Casuriaga, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+for+gene+expression+studies+in+mammalian+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cytogenet.+Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry for gene expression studies in mammalian spermatogenesis.</a> Cytogenet. Genome Res. 128, 46-56 (2010).</li>
<li>Getun, I. V., Torres, B., Bois, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+purification+of+mouse+meiotic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry purification of mouse meiotic cells.</a> J. Vis. Exp. (50), e2602(2011).</li>
<li>Meistrich, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+mouse+spermatogenic+cells+by+velocity+sedimentation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Separation of mouse spermatogenic cells by velocity sedimentation.</a> J. Cell Physiol. 80, 299-312 (1972).</li>
<li>Meistrich, M. L., Bruce, W. R., Clermont, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+composition+of+fractions+of+mouse+testis+cells+following+velocity+sedimentation+separation%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Cellular composition of fractions of mouse testis cells following velocity sedimentation separation.</a> Exp. Cell Res. 79, 213-227 (1973).</li>
<li>Malkov, M., Fisher, Y., Don, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+schedule+of+the+postnatal+rat+testis+determined+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Rep%22%5BJournal%5D)">Developmental schedule of the postnatal rat testis determined by flow cytometry.</a> Biol. Rep. 59, 84-92 (1998).</li>
<li>Rodríguez-Casuriaga, R., Geisinger, A., Santiñaque, F., López, B., Folle, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-purity+flow+sorting+of+early+meiocytes+based+on+DNA+analysis+of+guinea+pig+spermatogenic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">High-purity flow sorting of early meiocytes based on DNA analysis of guinea pig spermatogenic cells.</a> Cytometry A. 79, 625-634 (2011).</li>
<li>Davey, H. M., Hexley, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Red+but+not+dead%3F+Membranes+of+stressed+Saccharomyces+cerevisiae+are+permeable+to+propidium+iodide%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Red but not dead? Membranes of stressed Saccharomyces cerevisiae are permeable to propidium iodide.</a> Environ. Microbiol. 13, 163-171 (2011).</li>
<li>Rodríguez-Casuriaga, R., Geisinger, A., López-Carro, B., Porro, V., Wettstein, R., Folle, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-fast+and+optimized+method+for+the+preparation+of+rodent+testicular+cells+for+flow+cytometric+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Proced.+Online%22%5BJournal%5D)">Ultra-fast and optimized method for the preparation of rodent testicular cells for flow cytometric analysis.</a> Biol. Proced. Online. 11, 184-195 (2009).</li>
<li>Spanò, M., Evenson, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+analysis+for+reproductive+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric analysis for reproductive biology.</a> Biol Cell. 78, 53-62 (1993).</li>
</ol>

Burada açıklanan optimize yöntemi enzim ve deterjan tedavi kaçınarak ve iyi hücre bütünlüğü ve tipi oranlarını koruyarak, çok hızlı ve tekrarlanabilir bir şekilde kemirgen testis dokusundan hücre süspansiyonları hazırlanması sağlar. Prosedürü (15 dakika süresi testis diseksiyonu, doku kesme ve işleme dahil), yer az işleme ve enzimatik tedavilerin yokluğu kısalık en önemli avantajlarından bazılarıdır. Tüm bu orijinal hücre popülasyonu bulunan bileşiklerin temsil eden bir örneklem gerektiğinde önemlidir kısa yaşam makromo...

<table><tbody><tr><td>Medimachine sistemi</td><td>BD</td><td>340587</td><td></td></tr><tr><td>Medicon ünitesi (50 &mu; m)</td> <td>BD</td><td>340591</td><td></td></tr><tr><td>Filcon ünitesi (50 &mu; m)</td> <td>BD</td><td>340603</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>430-2100</td><td></td></tr><tr><td>Fetal buzağı serumu</td><td>PAA</td><td>A11-151</td><td></td></tr><tr><td>NDA</td><td>Chemos BmbH</td><td>277081</td><td></td></tr><tr><td>H & # 8211; chst 33342</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>14533</td><td>Stok çözeltisi 5 mg / ml; 5 & mu'luk bir nihai konsantrasyonda kullanılır; g/ml</td></tr><tr><td>Propidium iyodür</td><td>Sigma-Aldrich 287075</td><td></td><td>Stok çözeltisi 1 mg/ml; 50 & mu'luk bir nihai konsantrasyonda kullanılır; g/ml</td></tr></tbody></table>

testis hücre cezalı hazırlanması için basit ve verimli tekniği

Simple and Efficient Technique for the Preparation of Testicular Cell Suspensions

Memeli testis somatik testis hücreleri ve eşey hücrelerinde farklı aşamalarında dahil olmak üzere 30 farklı hücre tipleri, içeren çok karmaşık organlardır. Bu heterojenlik sperm gelişimi belirli aşamalarında saf ya da zenginleştirilmiş hücre popülasyonlarının en moleküler analizler 1 için gerekli olduğu gibi, memeli spermatogenez üsleri, çalışmaları ile ilgili önemli bir sorun var. Bu Staput 2,3, santrifüj elutrasyon 1, ve akış sitometri gibi çeşitli stratejileri (FC) 4,5 diferansiyel gen ekspresyon çalışmaları sağlamak amacıyla zenginleştirilmiş ya da saflaştırılmış testiküler hücre popülasyonlarının elde etmek için kullanılmıştır. Bu hücrelerin en zenginleştirme / saflaştırma yaklaşımlar için süspansiyon içinde olduğu gereklidir. İdeal olarak, hücre süspansiyonu orijinal dokunun temsili olacak, canlı hücreler ve az multinucleates yüksek bir oranda olması - çünkü şekline eğilimindedirve eksikliği hücre kümeleri 1 - seminifer epitel 6,7 sinsisyal doğası. Önceki raporlar sadece mekanik yöntemle hazırlanan testiküler hücre süspansiyonları tripsinize olanlar 1&#39;den daha kolay clumped olduğunu kanıtladığı vardı. RNases ve / veya tripsin ve belirli alt uygulamalar için istenmeyen belirli makromoleküller bozulma, kollajenaz gibi kurşun ayırmak enzimler ile diğer yandan, enzimatik işlemlerin. İdeal süreci, mRNA gibi ilgi makromoleküllerin iyi bir koruma elde edilmesi amacıyla, mümkün olduğunca kısa ve minimal manipülasyon içermelidir. Katı dokulardan hücre süspansiyonlarının hazırlanması için mevcut protokoller genellikle zaman alan ve yüksek operatöre bağlı olan ve seçici olarak belirli bir hücre tipi 1,8 zarar verebilir. Burada sunulan protokol bir ile son derece tekrarlanabilir ve son derece kısa bir mekanik ayrıştırma avantajlarını birleştirirAkış sitometrik analizi ve sıralama 4 ve art gen ekspresyon çalışmaları 9 için kullanılabilecek iyi kalitede hücre süspansiyonları yol açan enzimatik tedavi bsence.

Burada tarif edilen protokol ile hazırlanan fare testis, iyi ayrıştırılmış hücre süspansiyonu, bir örneği Şekil 1&#39;de gösterilmiştir. Enzimatik tedavi 6,8 ve daha önce açıklanan mekanik ayrıştırma yöntemleri 2 ile karşılaştırıldığında, burada sunulan bir (özellikle diğer mekanik göre, çok daha hızlı daha az işleme içerir, (değil operatöre bağlı) kolayca tekrarlanabilir ve kıt hücre artıkları vermektedir yöntem) ve çok az multinucleates (geniş doku ma...

Enzimler ve deterjan kaçınarak kemirgen malzemeden testis hücre süspansiyonları, mekanik hazırlanması için bir yeni protokol tarif edilmektedir. Yöntem çok basit, hızlı, tekrarlanabilir ve akış sıralama ve RNA ekstraksiyon için uygun kaliteli hücre süspansiyonları, vermektedir.

Testis Hücre Cezalı Hazırlanması için basit ve Verimli Tekniği

Mammalian testes are very complex organs that contain over 30 different cell types, including somatic testicular cells and different stages of germline ...

Bu videoda, kemirgenlerden test materyalinin hücresel süspansiyonunu sadece 15 dakika içinde elde etmek için oldukça basit ve etkili bir protokol sunulacaktır. Bu yöntem fare, sıçan ve kobay farelerinden alınan test materyalleri üzerinde uygulanmış olup, kapsüllenmiş dokuyu ayrıştırmak için bir meta makinesi cihazı kullanmaktadır. Filtrasyon ve boyama işlemlerinin ardından, hücre süspansiyonu akış sitometrisi için hazır hale gelir.Sito analiz veya ayıklama Hücre popülasyonlarının homojenliği, erkek GA diferansiyasyonu sırasındaki biyokimyasal ve moleküler olayların analizi için ön koşuldur. Bu nedenle, 30'dan fazla farklı hücre tipinin bulunduğu testiküler heterojenlik, memeli spermatogenezinin moleküler temelinin incelenmesiyle ilgili ana problemlerden birini teşkil eder. Bu nedenle, PU ve santrifüj ayırma da dahil olmak üzere, zenginleştirilmiş veya saflaştırılmış testiküler hücre popülasyonları elde etmek için çeşitli yöntemler kullanılmıştır.Herhangi bir hücre ayırma yöntemi için ilk adım, bir hücresel süspansiyonun hazırlanmasıdır. Ancak, mevcut protokoller genellikle zaman alıcıdır ve sonraki ekspresyon analizleri için istenmeyen bir durum olan RNA'lar gibi kısa ömürlü molekü

simple-efficient-technique-for-preparation-testicular-cell

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Belirli doku tiplerinin hücreleri Dissociating doku aggitation için belirli parametreler uygulanabilir kültürlenebilen hücrelerinin yüksek ses elde etmek için gereklidir. Miltenyi gentleMACS Dissociator basit, pratik bir protokol ile bu görevi en iyi hale getirir. Bu yayında, nerual doku bu cihazların kullanımı açıklanmıştır.

Fare Sinir Doku Hücre Tek Cezalar Üretimi

Bu video, testislerin bir bileşeni olan fare seminifer tübüllerinden Sertoli hücrelerinin izolasyon prosedürünü göstermektedir. Enzimatik sindirim ve tekrarlanan yıkamalar, Sertoli hücrelerinin çözeltiye salınmasını teşvik eder, bu da çoğalma ve büyüme için daha fazla kültürlenebilir.

Fare Seminifer Tübüllerinden İmmün Düzenleyici Sertoli Hücrelerinin İzolasyonu

Video, bir murin beyin dokusundan tek hücreli bir bağışıklık hücresi süspansiyonunun hazırlanmasını göstermektedir. Hücreleri beyin dokusundan serbest bırakmak için enzimatik sindirimi ve ardından tek hücreli süspansiyonu elde etmek için bağışıklık hücrelerini yoğunluklarına göre izole etmek için yoğunluk gradyanlı santrifüjlemeyi içerir.

Murin Beyin Dokusundan Tek Hücreli Bağışıklık Hücrelerinin Süspansiyonunun Hazırlanması

Erişkin farelerin spermatogoniumların ve progenitör hücre hatları türetmek ve korumak için basit bir yöntem sunulmuştur. Yöntemi yetişkin fare testis somatik hücre bölmesi kaynaklanan besleyici hücreler kullanır. Bu teknik transgenik, knock-out dahil, ortak fare suşları, uygulanabilir ve knock-fareler.

Uzun vadeli Yetişkin Fare SSC Hatları türetilmesi için Kültür Spermatogonial Kök ve progenitör hücrelerin Seri Zenginleştirme (DGM)

STA-PUT yöntem büyüklüğü ve yoğunluğuna bağlı olarak spermatojenik farklı hücre popülasyonlarının ayrılması sağlar.

STA-PUT Hız Sedimentasyon kullanma spermatogenic Hücre Tiplerinin Ayrılması

Buradaki materyal testis germ hücrelerinin üç boyutlu kromatin yapısını korumak için geliştirilen bir yöntemi açıklamaktadır. Bu, üç boyutlu (3D) slayt yöntemi olarak ad verilmiştir. Bu yöntem subnükleer yapıların tespiti için hassasiyeti artırır ve immünoresans, DNA ve RNA floresan in situ hibridizasyon (FISH) için geçerlidir.

Testis Germ Hücrelerinin Üç Boyutlu Kromatin Mimarisini Korumak için Slayt Hazırlama Yöntemi

Birincil Sertoli hücreleri immüno özelliklerinin iltihap ya da enfeksiyon ve yararlanma sırasında testis immün ayrıcalığı, sinyal transdüksiyonunu çalışmak için gereklidir. Burada yüksek derecede saflaştırılmış birincil Sertoli hücreleri ve sıçan testis peritübüler hücrelerin izolasyonu için bir enzim bazlı protokol açıklar.

Sıçan Testislerindeki Sertoli Hücreleri İzolasyon ve peritübüler Hücreler

Bu çalışma, farklı memeli türlerinin testiküler dokusundan saflaştırılmış germ hücresi popülasyonlarının elde edilmesi için bir yöntemin standartlaştırılmasını açıklamaktadır. Mekanik testis ayrışmasını, Hoechst-33342 ve propidyum iyodür ile boyamayı ve FACS sınıflandırmasını birleştiren basit bir protokoldür ve erkek üreme biyolojisi karşılaştırmalı çalışmalarında geniş uygulamalar yapılmıştır.

Memeli Erkek Germ Hücrelerinin Çok Denekli Saflaştırılmasında Standart Bir Yaklaşım, Mekanik Doku Ayrılma ve Akış Sitometrisi ile

Burada sunulan pachytene spermatositler zenginleştirmek için bir protokol, yuvarlak spermatidler, ve yetişkin fare testislerinden uzayan spermatidler standart laboratuvar ekipmanları ile bir kesintili sığır serum albumin yoğunluğu gradyanı kullanarak.

Standart Laboratuvar Ekipmanları Kullanılarak Fare Testlerinden Pachytene Spermatosit ve Spermatidlerin Zenginleşmesi

Burada primer neonatal murine testis hücrelerinden testis organoidi üretmek için dört yöntem tanımlanmıştır. Bu teknikler birden fazla araştırma uygulamasına sahiptir ve özellikle testis gelişimi ve fizyolojisi in vitro eğitimi için yararlıdır.

Ekstra Hücresel Matris Tabanlı ve Ekstra Hücresel Matrissiz Murine Testiküler Organoidlerin Üretimi

Burada yetişkin fare testislerinden canlı meiotik ve post-meyotik mikrop hücrelerini izole etmek için basit ve etkili bir yöntem salıyoruz. Düşük sitotoksisite, menekşe heyecanlı DNA bağlayıcı boya ve floresan-aktive hücre sıralama kullanarak, bir birçok downstream uygulamaları için son derece zenginleştirilmiş spermatojenik hücre popülasyonları izole edebilirsiniz.

Mor-Heyecanlı Hücre-Geçirgen DNA Bağlayıcı Boya Kullanılarak Murine Spermatojenik Hücrelerin İzolasyon

Öğrenin, kemirgen testis dokusundan enzimatik işlem kullanmadan yüksek kaliteli hücre süspansiyonu hazırlama yöntemini. Bu hızlı protokol akış sitometrisi ve gen ekspresyonu çalışmaları için idealdir.

Testis Hücre Cezalı Hazırlanması için basit ve Verimli Tekniği

Daha fazla video keşfet