Name: Yapısal Çalışmaları üretimi disülfid stabilize Transmembran Peptit Kompleksi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 5 s
Description: Öğrenin disülfid stabilize transmembran peptit kompleksleri üretimini E. coli'de histidin etiketli füzyon protein ekspresyonu ve nikel afinitesi kromatografisi kullanarak. Bu yöntem çözüm NMR ile yapısal analiz için uygundur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

MEC ve Victoria Hükümeti (Veski Yenilik Fellowship, bu iş için Harçlar Ulusal Sağlık ve Avustralya Tıbbi Araştırma Konseyi (WEHI Bağımsız Araştırma Enstitüleri Altyapısını Destekleme Programı [IRIISS] hibe MEC ve MJC için NHMRC proje hibesi 1011352) tarafından sağlanır; WEHI için Victoria Eyalet Hükümeti Operasyonel Altyapısını Destekleme). MEC Avustralya Araştırma Konseyi Kraliçe Elizabeth II üyesidir. EFXB Melbourne Üniversitesi&#39;nde Norma Hilda Schuster Burs Programı desteğini onaylar.

1. Klonlama ve Construct Tasarım HindIII ve BamHI sınırlama siteleri (bkz. Şekil 1) kullanarak PMM-peptid vektör (hangi istek üzerine temin edilebilir) içine ilgi dizileri klonlama. Çift sarmallı DNA sokmasını aşağıdaki sırayla içermelidir: Bir HindIII sitesi; CNBR bölünme için tek bir metionin kodon; E. kodlama sekansı coli kodon-optimize peptid, bir stop kodonu, bir BamHI sitesi. Peptid diğer tüm methionines bertaraf edilmesi gerekir ve bu da asidik koşullar altında ayrılır edileceği gibi dipeptid sekans Asp-Pro kaçınılmalıdır. Benzersiz bir sistein artığını nihai komplekse disülfid çapraz bağ arzu edilen konumlandırma göre her bir peptid sıranın içerisine sokulmuştur olmalıdır ve tüm diğer sistein, serin için mutasyonlu olmalıdır. Plazmit seçimi için bir kanamisin direnç kasedi taşır. 2. TrpLE-pepti İfadede Füzyon <ol><li> (0.1 mM CaCI2, 2 mM MgSO4, 3 g / L, KH 2 PO 4, 7.5 g / L Na 2 HPO 4 · 2H 2 O, 0.5 g / L NaCl, makyaj ve steril filtre M9/Kan en az büyüme ortamının 1 g / L NH4CI, 4 g / L glukoz, 50 mg / L kanamisin sülfat). Çözünmeyen malzeme ve steril filtre turuncu süpernatant kaldırmak için 30 dakika, santrifüj için karıştırma ile 40 ml H 2 O 1 tablet çözülür:. Olan Merkez Komple A B vitaminleri ve iz metaller sağlamak Çinko Supplement 2 haftaya kadar ve M9 4 ml / L kullanımı için karanlıkta 4 ° C de saklayınız stok solüsyonu. NOT: eğer istenirse 15 N-zenginleştirilmiş NH4CI, 13 C-zengin glikoz veya diğer sabit-izotop etiketli öncüleri, bu aşamada M9 ortam olarak dahil edilebilir. </li><li> Taze transforme BL21 (DE3) suşu E. 100 ml starter kültür inoküle M9/Kan ortamda coli. 200 rpm&#39;de sallama ile 37 ° C &#39;de gece boyunca büyümeye. </li><li> Ertesi sabah, başlangıç ​​kültür OD 600, - bu 2 veya daha büyük bir aralık içinde olmalıdır. Merkez-takviye M9 orta 1 L toplam hacmi içine 100 ml starter kültür seyreltin. Iki 2 L şaşkın şişeler (her bir şişeye 500 ml kültür) bölünür ve 37 büyüyecek ° C OD 600 0.6 ulaşıncaya kadar 140 rpm&#39;de sallayarak. </li><li> 18 çalkalayıcı sıcaklığını ayarlayın ° C ve kültürler indüksiyonundan önce tamamen soğumasını sağlayan, 1 saat boyunca sallayarak devam. </li><li> (OD 600 = 1 bir kültürün 50 ul eşdeğeri) SDS-PAGE analizi için bir ön-indüksiyon numune alın, sonra trpLE-peptid füzyon ifadesini teşvik etmek için 0.1 mM nihai konsantrasyona IPTG ilave edin. 18 ° IPTG indüksiyon altında gecede C/140 Devri (16-20 saat) büyüyor devam edin. </li></ol> 3. İçerme Vücut Hazırlama ve Nikel Matrix Ciltleme <ol><li> Az orta gecede ifade kültürlerin son OD 600 değişken ve sho olduğunuuld 2.5 ve 5.0 arasında olmalıdır. SDS-PAGE analizi için numune alın (OD 600 = 1 bir kültür 50 ul eşdeğeri) ve 5.000 x g&#39;de 20 dakika süreyle santrifüj hücreleri toplamak. </li><li> Yeniden süspanse hücre pelet, 50 ml lizis tamponu (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 20 mM β-ME, 0.2 M NaCI) içinde 1 M kültüründen. Hücre süspansiyonu daha sonra işlenmek için dondurulmuş saklanabilir. </li><li> 5 dakika buz üzerinde 1 dakika ve geri kalanı için maksimum çıkışta buz üzerinde sonication tarafından hücreleri Lyse. Biz ½-inç yüksek yoğunluklu değiştirilebilir ucu ile bir Misonix sonikatör 3000 (max çıkış 600 watt) kullanın. Sonication / üç kür için soğutma tekrarlayın. </li><li> 20.000 g&#39;de 15 dakika santrifüj ile çözünmeyen inklüzyon cisimciği (IB) malzeme toplayın ve supernatant atın. Açık renkli hücre enkaz gevşek, ince bir tabaka yoğun IB pelet üstünde görülebilir, bu nazik ajitasyon ile su veya tampon kullanarak uzak yıkanabilir. Adımları 3.3 ve 3.4 IB fraksiyonu saflığını iyileştirmek için tekrar edilebilir eğer desikırmızı. Pelet ve süpernatant malzeme örnekleri dahil organlarına trpLE-TM füzyon yerelleştirme onaylamak için SDS-PAGE analizi için alınmalıdır. </li><li> İşlenmiş kültür litresi başına 25-50 ml kullanılarak guanidin çözeltisi (6 M guanidin HCI, 50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 200 mM NaCI, 1% Triton X-100, 5 mM β-ME), IB granül çözülür. Bu adım, çalkalama ve sonikasyon ile zaman zaman hafif bir kaç saat gerektirir. </li><li> 75,000-100,000 xg&#39;de 1 saat ile 20 ° C için santrifüjleme ile IB lizat temizleme Bir 0.2 um membran ile süpernatantı ve filtre süzün. </li><li> 50 ml&#39;lik konik bir tüp içinde temizlenmiş IB lizat, ya da su ve guanidin çözeltisi ile dengelenmiş ile yıkandı nikel afinite reçine ile, sıkıca kapatılmış olabilir daha büyük bir kap birleştirin. TrpLE-DAP12TM (Şekil 3, şerit 2), burada gösterildiği gibi benzer bir dereceye kadar ifade füzyonları için işlenmiş kültür litre başına 3-4 ml yerleşik reçine kullanımı. Oda t geceleme kuluçkaya alarak Toplu bind<html> nazik karıştırma ile emperature. </li></ol> 4. On-sütun Oksidatif Crosslinking <ol><li> Tüm hacmi akan kadar sürekli olarak ekleyerek, gözenekli yatak desteği ile boş bir yerçekimi akışı sütuna IB lizat / nikel reçine süspansiyon yükleyin. Toplamak ve hala çözülmüş füzyon proteini içerebilir flowthrough, bir kenara koymak. </li><li> Β-ME 5 mM üre çözeltinin 5 yatak hacmi (8 M üre, 50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 200 mM NaCl) ile yerçekimi akışı ile nikel reçine yıkanır. </li><li> Β-ME olmadan üre çözeltisi 5 yatak hacmi ile tekrar nikel reçine yıkayın. </li><li> 20 uM CuSO 4 ve glutatyon okside 2 mM ile takviye edilmiş üre çözeltisi 5 yatak hacmi ile nikel reçine üçüncü kez yıkayın. Bu yıkamadan sonra, sütun çıkış yakın ve en fazla disülfit bağ oluşumunu sağlamak için oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edilir. </li></ol> 5. TFA Elüsyon ve Miktar içeriği &quot;&gt; DİKKAT: Trifloroasetik asit (TFA) deri ve duman ile temas şiddetli yanıklara neden son derece rahatsız edici olan Konsantre TFA göz koruması olmayan lateks eldiven ile onaylı kimyasal davlumbaz kullanılmalıdır tüm kimyasal uyumluluğunu kontrol edin.. malzemeler; polipropilen Bu protokol tüm adımları ile uyumludur. <ol><li> Su 10 yatak hacmi ile oksitleyici üre çözeltisi yıkayın ve sütun çıkışına bir vakum hattı uygulayarak sütun yatak kurulayın. </li><li> Kolon çıkışında kapatın ve düzgün (99-100%) TFA 1.5 yatak hacmi ekleyin. Asit ile dahi maruz kalmasının ve 5 dakika inkübe edilir ve küçük bir spatula ile nikel reçine karıştırın. Kolon çıkış açın ve tüm sıvı dışarı itmek için gerekli ise, bir şırınga veya basınçlı hava hattı ile yavaşça basınçlandırma, asit ile arındırıldı ve toplamak. </li><li> Düzgün TFA başka 1.5 yatak hacmi ile asit elüsyon adımı yineleyin. Beade tam çözünmesini önlemek için bu aşamada hızlı çalışınd agaroz matrisi. Protein verim Beer-Lambert denklem ile trpLE-peptid dizisi teorik molar tükenme katsayısına göre bu noktada tespit edilebilir. Trifluoroethanol içinde TFA ile arındırıldı (1:20-01:50) (TFE) bir örnek seyreltilir ve bir boş olarak aynı dilüsyonda, TFA / TFE kullanılarak, 280 nm&#39;de absorbansı ölçülür. </li></ol> 6. CNBR Sindirim DİKKAT: siyanojen bromür (CNBR) son derece toksik ve sadece onaylı kimyasal davlumbaz ele alınmalıdır. Emniyet gözlüğü, laboratuvar önlüğü ve olmayan lateks eldiven dahil KKD kesinlikle gereklidir. CNBR neme reaktif ve açmadan önce oda sıcaklığına getirilmelidir. Nötralizasyon / CNBR-kontamine çözümleri ve malzemelerin bertaraf talimatları için kurumsal güvenlik ofisine başvurun. <ol><li> Hafifçe karıştırma sırasında damla damla su ilave edilerek% 80 TFA nihai konsantrasyon asit elüsyon seyreltilir. Bir çökelti oluştu, bir varsadd geri temiz TFA küçük bir miktarda (0,5-1 ml) çözeltisi su ile% 80 yeniden doğru, daha sonra açıklık kadar. Sıvı azot içinde dondurulması ve hemen örnek liyofilize edilmesiyle, SDS-PAGE analizi için bir 5 ul ön özet numune alın. </li><li> Kapalı, önceden tartılmış tüpleri güvenle toksik kimyasal tartmak bakımı veya kimyasal davlumbaz içinde bir denge kullanarak, yaklaşık 0.2 g / ml CNBR kristalleri ekleyin. Tamamen eriyene kadar yavaşça karıştırın. Yıkayın ve atıl gaz (argon ya da azot akışı) altında tepkime kabı mühürlemek ve ışıktan koruyarak, oda sıcaklığında 3-4 saat inkübe edilir. </li><li> SDS-PAGE analizi için 5 ul sonrası özet numune alın ve dondurma ve hemen lyophilize. Beklenen peptid kompleksi boyutu göre, 3.5 kDa ya da daha az bir moleküler ağırlığa sahip bir kesme rejenere selüloz diyaliz kaset ya da boru (selüloz asetat konsantre asit içinde eriyecektir) ile sindirmek reaksiyon aktarın. Su içinde 4 M vermek üzere gece boyunca Dialyzekimyasal davlumbaz TFA konsantrasyonunu azaltmak ve herhangi bir reaksiyona girmemiş CNBR ayrıştırılması. Gecede diyaliz sırasında hacminde önemli bir artış (kadar üç kat iki-gibi) için diyaliz kaset veya tüp boşluk bırakın. </li><li> Diyaliz kaset ya da boru (protein en TFA konsantrasyonu düşük olduğu zaman çökelti olacaktır) asılı bir çökelti ile diyalize edilen çözelti tepkime çıkarın ve 50 ml konik tüpe süspansiyon aktarın. Freeze ve su CNBR / TFA izlerini kaldırmak için lyophilize. Bu adım birkaç gün ihtiyacı doğacaktır. DİKKAT: diyalizlenmiş özeti reaksiyonu ve diyaliz su Hem toksik ve uygun önlemler ile bertaraf / ele muamelesi devam edilmelidir. </li><li> Öncesi indüksiyon ve hasat dönemlerinde, inklüzyon body süpernatant ve pelet, TFA arındırıldı ve CNBR-sindirilmiş malzemeden kültürlerin örnekleri SDS-PAGE ile analiz edilebilir. 95 ile ısıtma ile numuneler hazırlayın Invitrogen NuPAGE LDS sampl ° Ce tampon. TFA arındırıldı ve özet örneklerinin oksidatif crosslinking ürün tanımlama ve değerlendirme kolaylaştırmak için azaltma ve non-düşürücü hem koşullarda hazırlanmalıdır. </li><li> En küçük özet ürünlerin optimum çözümü için MES-SDS tamponu kullanılarak çalışan bir% 12 NuPAGE bis-tris önceden dökme akrilamid jel üzerinde örnekleri ayırın. </li></ol> 7. Disülfür çapraz bağlı peptid komplekslerini arasında Ters-faz HPLC saflaştırma <ol><li> Bir preparatif-ölçek üzerine 2-3 ml formik asit ve muntazam yük (21.2 x 150 mm) içine liyofilize özet ürünleri 100 mg a kadar eritilir Agilent Zorbax SB-300, çözücü, C3 PrepHT A sütunu (tipik olarak% 10-20 asetonitril ya da 5 % 0.1 TFA ile su içinde% 10 izopropanol). </li><li> En az 5 kolon hacmi üzerinden çözücü B gradyanı (% 0.1 TFA ile asetonitril veya izopropanol) içinde özet ürünler Zehir. Farklı peptidle optimum eğim koşulları seçimi önerileri için TARTIŞMA bakınız. </li><li> AlmakSDS-PAGE analizi ve dondurma ve hemen lyophilize için her HPLC fraksiyonu 50-100 ul örnekleri. HPLC solvent kaldırılmasını hızlıdır ve 1-2 saat içinde tam olmalıdır. </li><li> Herhangi bir indirgen ajan ile Invitrogen NuPAGE LDS numune tamponu içinde 95 ° C ye ısıtmak suretiyle SDS-PAGE için liyofilize HPLC numuneleri hazırlanır. Soğutulur ve onları ve yeniden ısıtma kısaca birine 100 mM DTT ekleyerek, eşit 2 mikrosantrifüj tüpleri içine her bir numune ayrılır. </li><li> MES-SDS olarak yukarıdaki tampon ile çalışan bir% 12 NuPAGE bis-tris önceden dökme akrilamid jel üzerinde daha az olmayan ve azaltılmış HPLC numuneleri ayırın. Küçük, hidrofobik peptitler genellikle Coomassie sıra leke yapmayız ve beklenen molekül ağırlıklarında çalışmayabilir. Ancak, azaltılmış ve non-azaltılmış örneklerinin karşılaştırılması çapraz peptid ürünleri ve saflık değerlendirilmesi belirlenmesi kolaylaştırmalıdır. </li><li> Matriks destekli lazer desorpsiyon iyonlaşma time-of-flight (MALDI-TO tarafından aday peptid içeren fraksiyonları analizF) kütle spektrometresi (TARTIŞMA bakınız) faiz türleri belirlemek ve beklenen kitle onaylayın. </li><li> , Kombine saf, çapraz bağlı TM peptid kompleksi ihtiva eden HPLC fraksiyonları dondurmak ve lyophilize ve verimi belirlemek için, son ürünün bir kuru ağırlık al. Yüksek izopropanol içerikli Kesirler dondurulmuş kalmayabilir. Peptit parçaları yerine bir kabarık liyofilize edilmiş ürüne göre daha aşağı kuru film halinde, saf hekzafloroizopropanol (HFIP) küçük bir hacim içinde tamamen filmi yeniden çözülür donma ve tekrar lyophilize. HFIP ile tedavi edilen ürün, kolaylıkla dışarı uçlu ve tartılmış küçük, beyaz bir koni olmalıdır. </li></ol>

<ol><li>Call, M. E., Chou, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+view+into+the+blind+spot%3A+solution+NMR+provides+new+insights+into+signal+transduction+across+the+lipid+bilayer%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">A view into the blind spot: solution NMR provides new insights into signal transduction across the lipid bilayer.</a> Structure. 18, 1559-1569 (2010).</li>
<li>Bocharov, E. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+structure+of+the+dimeric+transmembrane+domain+of+the+growth+factor+receptor+ErbB2+presumably+corresponding+to+the+receptor+active+state%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Spatial structure of the dimeric transmembrane domain of the growth factor receptor ErbB2 presumably corresponding to the receptor active state.</a> The Journal of Biological Chemistry. 283, 6950-6956 (2008).</li>
<li>Mineev, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+structure+of+the+transmembrane+domain+heterodimer+of+ErbB1+and+ErbB2+receptor+tyrosine+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Spatial structure of the transmembrane domain heterodimer of ErbB1 and ErbB2 receptor tyrosine kinases.</a> J. Mol. Biol. 400, 231-243 (2010).</li>
<li>Mineev, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+structure+and+dimer--monomer+equilibrium+of+the+ErbB3+transmembrane+domain+in+DPC+micelles%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Spatial structure and dimer--monomer equilibrium of the ErbB3 transmembrane domain in DPC micelles.</a> Biochim. Biophys Acta. 1808, 2081-2088 (2011).</li>
<li>Lau, T. L., Kim, C., Ginsberg, M. H., Ulmer, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+the+integrin+alphaIIbbeta3+transmembrane+complex+explains+integrin+transmembrane+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">The structure of the integrin alphaIIbbeta3 transmembrane complex explains integrin transmembrane signalling.</a> The EMBO Journal. 28, 1351-1361 (2009).</li>
<li>Zhu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+a+receptor+with+two+associating+transmembrane+domains+on+the+cell+surface%3A+integrin+alphaIIbbeta3%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">The structure of a receptor with two associating transmembrane domains on the cell surface: integrin alphaIIbbeta3.</a> Molecular Cell. 34, 234-249 (2009).</li>
<li>Call, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+the+zetazeta+transmembrane+dimer+reveals+features+essential+for+its+assembly+with+the+T+cell+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The structure of the zetazeta transmembrane dimer reveals features essential for its assembly with the T cell receptor.</a> Cell. 127, 355-368 (2006).</li>
<li>Call, M. E., Wucherpfennig, K. W., Chou, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structural+basis+for+intramembrane+assembly+of+an+activating+immunoreceptor+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The structural basis for intramembrane assembly of an activating immunoreceptor complex.</a> Nat. Immunol. 11, 1023-1029 (2010).</li>
<li>Diefenderfer, C., Lee, J., Mlyanarski, S., Guo, Y., Glover, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reliable+expression+and+purification+of+highly+insoluble+transmembrane+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Reliable expression and purification of highly insoluble transmembrane domains.</a> Anal. Biochem. 384, 274-278 (2009).</li>
<li>Schnell, J. R., Chou, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+mechanism+of+the+M2+proton+channel+of+influenza+A+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure and mechanism of the M2 proton channel of influenza A virus.</a> Nature. 451, 591-595 (2008).</li>
<li>Xie, X. Q., Zhao, J., Zheng, H. E. xpression <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((purification%2C+and+isotope+labeling+of+cannabinoid+CB2+receptor+fragment%2C+CB2%28180-233%29%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expr.+Purif%22%5BJournal%5D)">purification, and isotope labeling of cannabinoid CB2 receptor fragment, CB2(180-233).</a> Protein Expr. Purif. 38, 61-68 (2004).</li>
<li>Miozzari, G. F., Yanofsky, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translation+of+the+leader+region+of+the+Escherichia+coli+tryptophan+operon%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Translation of the leader region of the Escherichia coli tryptophan operon.</a> J. Bacteriol. 133, 1457-1466 (1978).</li>
<li>North, C. L., Blacklow, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+independence+of+ligand-binding+modules+five+and+six+of+the+LDL+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Structural independence of ligand-binding modules five and six of the LDL receptor.</a> Biochemistry. 38, 3926-3935 (1999).</li>
<li>Staley, J. P., Kim, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+a+native-like+subdomain+in+a+partially+folded+intermediate+of+bovine+pancreatic+trypsin+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Formation of a native-like subdomain in a partially folded intermediate of bovine pancreatic trypsin inhibitor.</a> Protein Sci. 3, 1822-1832 (1994).</li>
<li>Narayanan, S., Sato, T., Wolfe, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+C-terminal+region+of+signal+peptide+peptidase+defines+a+functional+domain+for+intramembrane+aspartic+protease+catalysis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A C-terminal region of signal peptide peptidase defines a functional domain for intramembrane aspartic protease catalysis.</a> The Journal of Biological Chemistry. 282, 20172-20179 (2007).</li>
<li>Klunk, W. E., Pettegrew, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alzheimer%27s+beta-amyloid+protein+is+covalently+modified+when+dissolved+in+formic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Alzheimer's beta-amyloid protein is covalently modified when dissolved in formic acid.</a> J. Neurochem. 54, 2050-2056 (1990).</li>
<li>Klunk, W. E., Xu, C. J., Pettegrew, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMR+identification+of+the+formic+acid-modified+residue+in+Alzheimer%27s+amyloid+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">NMR identification of the formic acid-modified residue in Alzheimer's amyloid protein.</a> J. Neurochem. 62, 349-354 (1994).</li>
<li>Previero, A., Coletti-Previero, M. A., Cavadore, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+reversible+chemical+modification+of+the+tryptophan+residue%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">A reversible chemical modification of the tryptophan residue.</a> Biochim. Biophys. Acta. 147, 453-461 (1967).</li>
<li>Kim, H. J., Howell, S. C., Van Horn, W. D., Jeon, Y. H., Sanders, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+Advances+in+the+Application+of+Solution+NMR+Spectroscopy+to+Multi-Span+Integral+Membrane+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Nucl.+Magn.+Reson.+Spectrosc%22%5BJournal%5D)">Recent Advances in the Application of Solution NMR Spectroscopy to Multi-Span Integral Membrane Proteins.</a> Prog. Nucl. Magn. Reson. Spectrosc. 55, 335-360 (2009).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.

TrpLE-TM füzyonlar Ekspresyonu. Bizim tecrübelerimize göre, trpLE-TM füzyonlar zayıf 37 ° C&#39;de zengin kültür ortamı olarak ifade edilir, ve burada açıklanan kültür koşullarında verimleri değişen bir ila dört TM etki içeren birçok farklı dizileri için başarısı kanıtlanmış 50 ile 150 mg / saf, bozulmamış füzyon L. Fusions kodlama üç veya dört-TM GPCR parçaları (insan CCR5 sırasıyla TM1-TM3 ve TM4-TM7,) ya da insan sinyal peptit peptidaz (dört TM etki; ref 15) bir çekirdek katalitik fragmanı ifade b...

Bu protokol detayları biz çözüm NMR kullanarak yapısal çalışmalar için disülfid stabilize transmembran kompleksleri (TM) peptidler üretmek için gelişmiş bir prosedür. Prosedür ΔtrpLE1413 füzyon sistemi (aşağıya bakınız) tarafından tanınan sağlam ifade yararlanır ve tanımlanan bileşim TM peptid komplekslerini modern çok boyutlu NMR deneyleri için gelişmiş bir kararlı-izotop etiketleme teknikleri kullanılarak oluşturulmasına olanak sağlar. Biz lenfosit aktive edici immunoreceptors (son 1 yorum) kendi TM alanları arasındaki etkileşim yoluyla birden membran protein alt monte edilen ilgili önemli yeni bilgiler ortaya çeşitli NMR yapılarını belirlemek için bu teknikler istihdam var. Bu teknikler, bir çok başka zar proteini sistemlerinin yanı sıra çözelti NMR ek olarak aşağı analitik yöntemler geniş bir yelpazede için de geçerlidir. Burada verilen örnekte yerli sistein kalıntıları kullanır ikendoğal disülfit-gümrüklü protein taklit eden bir kompleks oluşturmak için, tasarım eşit derecede iyi normalde böyle homo-ve hetero-dimerik TM kompleksleri gibi zayıf, non-kovalent etkileşimler arada tutarak kompleksleri stabilize etmek için tasarlanmış disülfit bağları oluşturmak için uygundur epidermal büyüme faktörü reseptörü (EGFR) ailesi proteinleri 2-4 veya heterodimerik αβ integrin kompleksleri 5,6. Bu tür lipit türetilmiş olanlar gibi, son derece hidrofobik peptid dizileri kapsayan-çift-katlı TM proteinlerinin kısımlarını biyokimyasal ve biyofiziksel çalışmalar için son derece zor konusudur. Standart protein ve peptid kimyası teknikleri kullanılarak manipüle etmek çok zor olmasının yanı sıra, genellikle hücreler için oldukça toksik olan ve bu nedenle yeniden birleştirilerek üretmek zordur. Biz 7,8 ve diğerleri 9-11 sahip olan in-frame karboksi-terminal olarak bakteri gibi zor peptid sekansları ifade önemli bir başarıE. türetilen ΔtrpLE1413 dizisinin değiştirilmiş bir versiyonu ile füzyonları coli trp operon 12. Bu sekans ile kodlanan ~ 13 kDa trpLE polipeptid bir T7 promotor altında yüksek düzeyde üretilebilir ve tamamen toksisite ve / veya istikrarsızlık ile ilgili problemler atlatılabilir edilir dahil organları lokalize edilmektedir. Bir amino-terminal 9-histidin etiketi 13 ve trpLE sıra, iç metionin ve sistein kalıntıları ortadan kaldırılması metal iyon afinite kromatografisi ile saflaştırıldı ve sindirildi edilmesi için izin verilen 14 trpLE-peptid füzyonları ve siyanojen bromür (CNBR kullanılarak eklenmesi ile sekans modifikasyonu ) istenen peptid dizisi serbest kalmasını sağlar. Biz başarıyla en fazla dört TM alanları içeren membran proteini parçaları temsil trpLE füzyonlar gibi bir düzine farklı dizilerin daha ifade etmek için bu sistemi kullanılmış (7,8 ve yayınlanmamış sonuçlar; ayrıca TARTIŞMA bölümüne bakınız). Bu protokolde de önemli bir yenilik yapısal olmayan ve çok az çözünen trpLE-TM füzyonları verimli bir iş akışı bağlamında disülfür-çapraz bağlı olabilir hangi koşullar altında tespit edilmesidir. Yüksek verim ifadesi, taşıma ve peptid ürünlerinin saflaştırılması birkaç yönü de iyice optimize, ve burada sunulan öneriler olmayan disülfit çapraz bağlı (monomerik) TM peptid ürünlerinin üretimi için aynı derecede geçerli olarak oylandı.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif / Malzeme Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog Numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Siyanojen bromür </td><td> Aldrich </td><td> P.No-C91492, CAS-506-68-3 </td><td> TEHLİKELİ MADDE. TEHLİKELİ MAL. Teneffüs edilmesi, deri ile teması ve yutulması halinde zararlıdır. Asitlerle temasında çok toksik gaz çıkarır. Sudaki organizmalar için çok toksik, su ortamında uzun süreli olumsuz etkilere neden olabilir. </td></tr><tr><td> Trifloroasetik asit </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P.CODE-1000984387, CAS Numarası 76-05-1 </td><td> TEHLİKELİ MADDE. TEHLİKELİ MAL., Ciddi yanıklara neden olur. Solunması halinde sağlığa zararlıdır. Sudaki organizmalar için zararlı, su ortamında uzun süreli olumsuz etkilere neden olabilir. </td></tr><tr><td> 2-merkaptoetanol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P.No M7154, CAS Numarası 60-24-2 </td><td> TEHLİKELİ MADDE. TEHLİKELİ MAL. Solunduğunda, cilt ile temasında ve yutulduğunda toksiktir. Cildi tahriş eder. Gözlere ciddi hasar riski. Deri ile teması halinde hassasiyete neden olabilir. Sudaki organizmalar için çok toksik, su ortamında uzun süreli olumsuz etkilere neden olabilir. </td></tr><tr><td> 1,1,1,3,3,3-heksafluoro-2-propanolün hazırlanması </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> Ürün Numarası 52512, CAS-No. 920-66-1 </td><td> TEHLİKELİ MADDE. TEHLİKELİ MAL. Solunması halinde sağlığa zararlıdır ve yutulduğunda toksiktir. Yanıklara neden olur. </td></tr><tr><td> Formik asit </td><td> Merck KGaA </td><td> K41186564 </td><td> Yanıcı sıvı ve buhar. Ciddi derecede deri yanıkları ve göz hasarına neden olur. </td></tr><tr><td> Üre </td><td> UNIVAR, AJAX Finechem </td><td> Ürün Numarası, 817, CAS-No 57-13-6 </td><td> ısıtmalı, deckarbon dioksit ve amonyak ile omposes, yanmış halinde, azot oksit, az miktarda yayar. Kızarıklık ve cilt ve gözlerde tahrişe neden olabilir. </td></tr><tr><td> Guanidin HİDROKLORİD </td><td> Amresco </td><td> P.No-M110, CAS Numarası: 50-01-1 </td><td> Yutulması halinde zararlıdır, Ciddi derecede göz tahrişine neden olur cilt tahrişi, Akut Toksisite Oral, Cilt Tahriş edici, Göz Tahriş edici neden olur. </td></tr><tr><td> TRİTON X-100 </td><td> SIGMA </td><td> Ürün Numarası-T8532 CAS No: 9002-93-1 </td><td> Triton X-100 sık sık proteinleri çözünür biyokimyasal uygulamalarında kullanılan bir iyonik olmayan deterjan,% 100 aktif maddedir. Triton X-100, herhangi bir antimikrobiyal özelliklere sahiptir ve nispeten hafif bir denatüre edici olmayan bir deterjan olarak kabul </td></tr><tr><td> Onun-Seçiniz Nikel-Affinity jel </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> Katalog Num-P6611 </td><td> IS-Select Nikel Affinity Jel bir immobilize metal iyon afinite kromatografisi (IMAC) ürünüdür. HIS-Seçiniz NickEl Affinity jel özellikle histidin içeren proteinlere bağlamak için tasarlanmıştır nikel ile tahsil boncuklu agaroz üzerine özel bir quadridentate preparatıdır. </td></tr><tr><td> (-)-Glutatyon, okside </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> Katalog num 150568 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Misonix S-3000 sonikatör </td><td> QSONICA </td><td> S-3000 (üretilmiyor) </td><td> Maksimum çıkış gücü 600 watt. 1/2-inch değiştirilebilir uçlu prob 1/2-inch yüksek yoğunluklu, yüksek hacimli ipuçları ve yüksek yoğunluklu, düşük hacimli ipuçları bir dizi alır. Bu firma şu anda mevcut en yakın modeller Q500 ve Q700 vardır. </td></tr><tr><td> RP-HPLC: Biyolojik Çift Geçişli kromatografi sistemi, Yazılım Sürüm 5.3 </td><td> Bio-Rad Laboratories </td><td> Katalog Num 760-0047, Config No: AU500571, Seri No: 484BR3705 </td><td> Peptitler yüksek aq faz HPLC kolonları ters bağlanırueous mobil faz ve yüksek organik hareketli faz ile RP HPLC kolonları arasından kolonda sürüklenecektir. RP HPLC peptidlerin hidrofobik özelliğine göre ayrılır. Peptitler, organik çözücü bir doğrusal gradyan ile çalışan ayrılabilir. </td></tr><tr><td> Hazırlık HT C3 Zorbax 300SB-Analitik HPLC Kolon, 21.2 x 150 mm, 5 mm partikül boyutu </td><td> Agilent </td><td> Ürün No: 895150-909 </td><td> Ters-faz HPLC kolon </td></tr><tr><td> NuPAGE% 12 Bis-Tris Jeller </td><td> Yaşam Teknolojileri </td><td> NP0341BOX </td><td> Protein elektroforezi için Prefabrik jeller </td></tr><tr><td> Slide-A-Lyzer G2 Diyaliz Kasetler, 3,5 K MWCO </td><td> Thermo Scientific </td><td> Ürün No: 87724 </td><td> Örnek diyaliz </td></tr></tbody></table>

yapısal Çalışmaları üretimi disülfid stabilize transmembran peptit kompleksi

Production of Disulfide-stabilized Transmembrane Peptide Complexes for Structural Studies

Membran proteinlerinin lipid gömülü alfa-sarmal etki arasındaki fiziksel etkileşimleri membran protein komplekslerinin katlama ve montaj ve böyle transmembran (TM) sinyalizasyon ve hücre yüzey proteini seviyelerinin düzenlenmesi gibi dinamik süreçler önemli bir rol oynamaktadır. Özellikle dizilerinin dernek sürüş yapısal özelliklerini anlama TM peptid komplekslerini sofistike biyofiziksel ve biyokimyasal analizleri gerektirir. Ancak, TM etki aşırı hidrofobik standart peptid kimyası teknikleri kullanarak işlemek için onları çok zorlaştırır, ve uygun eğitim materyalleri üretimi genellikle engelleyici zorlu kanıtlıyor. Peptidler stabil helisel konformasyonları ve form kompleksleri kabul hangi koşullar altında belirlenmesi kendiliğinden zorluk daha ileri bir düzeyi ekler. Burada E. olarak ifade edilmiştir homo-ya da malzemelerden hetero dimerik TM peptid komplekslerini üretimi için bir işlem sunulmaktadır coli, böylece nükleer manyetik rezonans için izotop etiketler (NMR) ya da nispeten pahalı olmayan diğer uygulamalar için, doğal olmayan amino asitler birleşme sağlar. Bu yöntemde önemli yenilik TM kompleksleri üretilen ve deterjan, yağ veya diğer membran-mimetik malzemelerin içine rekonstitüe zaman istikrarlı stokiyometrik ve homojen yapılar oluşturabilirler kovalent ilişkili (disülfid-çapraz) birleştirmeleri olarak saflaştırılmış olmasıdır. Biz de Tekli TM etki veya çapraz kompleksleri üretiminde olsun aynı şekilde uygulanabilir ve yeni TM dizileri için bu yöntemleri adapte etmek için önerilerde ifade ve saflaştırma için özenle optimize prosedürleri sunuyoruz.

TrpLE füzyonları için elde ekspresyon seviyesi, değişken ve ekli peptidin amino asit dizisinin büyük ölçüde bağlıdır. Şekil 3, önceden indüksiyon SDS-PAGE analizi (hat 1) ve time-of-hasat (kulvar 2) göstermektedir kültürü 1 litre ve 4 ml nikel matris saf, bozulmamış trpLE-DAP12TM füzyon yaklaşık 120 mg&#39;lik bir kültür örnekleri. TrpLE-DAP12TM füzyon Tüm olarak süpernatant (yol 3) karşı inklüzyon cisimciği pelet (şeritli 4) lokalize edilmiştir. Nikel-saflaştırılmış trpLE-D...

Membran-gömülü protein etki arasındaki etkileşimler biyofiziksel ve biyokimyasal çalışmalarda uygun çalışma malzemesi elde edilir ilki birçok teknik sorunlarla karşı karşıya. Bu makale, çözelti nükleer manyetik rezonans (NMR) ve diğer analitik uygulamalar tarafından yapısal analizi için uygun olan disülfid stabilize transmembran peptid komplekslerini üretme ve arıtma için bir protokol açıklanmaktadır.

Yapısal Çalışmaları üretimi disülfid stabilize Transmembran Peptit Kompleksi

Physical  interactions among the lipid-embedded alpha-helical domains of membrane  proteins play a crucial role in folding and assembly of membrane ...

Bu protokol, membran proteinlerinin lipid gömülü alanları aracılığıyla birbirleriyle nasıl etkileşime girdiğini anlamayı amaçlayan yapısal çalışmalar için kovalent olarak stabilize edilmiş transmembran peptit kompleksleri üretir. İlk olarak, e coli'de ilgilenilen transmembran dizisini içeren tarihi etiketli bir füzyon proteinini ifade edin. Daha sonra, bir nikel afinite matrisi kullanarak gine ve deterjan kullanarak proteini inklüzyon vücut fraksiyonundan çıkarın.Tarih etiketli füzyon proteinini konsantre edin ve di sülfür, sütunu oksitleyici maddeler içeren bir çözelti içinde yıkayarak çap formuna çapraz bağlayın. Daha sonra, çapraz bağlı füzyon proteinini Tri Fluor asetik asit içinde elüte edin ve füzyon ortağını serbest bırakmak için siyanojen bromür ile muamele edin, çapraz bağlı peptit ürününü ters fazlı HPLC ile sindirim karışımından izole etmeye devam edin. Sonuç olarak, ürünlerin kimliği ve saflığı SDS sayfası ve kütle spektrometresi analizleri ile doğrulanır.Bu tekniğin temel avantajı, çözelti veya katı hal NMR gibi teknikler kullanılarak yapısal çalışmalar için saf sosyometrik komplekslerin üretilmesidir. İki transmembran alanının etkileşime girdiği bilinse bile, peptit ç

production-disulfide-stabilized-transmembrane-peptide-complexes-for

Research

JoVE Journal

Chemistry

Kimya

Tarama kantitatif, yüksek miktarda ifade ve küçük ölçekli Escherichia coli kültürlerinden füzyon proteinlerinin saflaştırılması için analitik bir protokol tarif disülfid zengin hayvansal protein zehir hedeflerin ekspresyonu uygulanır.

Üretilen Rekombinant Disülfid zengin Venom Proteinler Uygulanan Yüksek Randımanlı Sayısal Anlatım Tarama ve Arıtma<em&gt; E. coli</em

Bir yöntem olup (Strep-taktin) reçinesi kovalent Bis (sülfosuksinimidil) suberat (BS3) ile çapraz bağlanmış, modifiye edilmiş streptavidin ile ilgili çift-Strep-etiketli füzyon proteinleri ve bunların özel komplekslerinin etkin arıtma için açıklanmıştır. Bir yöntem hızlı hızlı, iyi bir hedef protein geri kazanımı ve yüksek saflıkta avantajları vardır ve kütle spektrometresi ile bir sonraki analiz ile uyumludur.

Tek aşamalı Strep-taktin Reçine Bis (sülfosuksinimidil) ile çapraz bağlanmış suberat (BS3) hakkında Çift Strep-etiketli proteinler ve komplekslerinin saflaştırılması

Kanser ilaçlarını tümör bölgelerine yüksek özgüllük ve azaltılmış yan etkilerle ulaştırmak için nanopartiküllere dayalı yeni yöntemler gereklidir. Burada, hidrojen peroksit aracılı oksidasyon ile kolayca hazırlanabilen ve yükleri serbest bırakmak için indirgeyici bir tümör ortamı altında verimli bir şekilde ayrışabilen disülfür çapraz bağlı miselleri açıklıyoruz.

Döner disülfür Çapraz bağlı misellerin Üretimi için basit ve etkin Yaklaşım

Bu makale, lipid-proksimal bir ortamda çeşitli partner faktörlerle in vitro olarak integral membran proteinlerinin etkileşimlerini ve montajlarını değerlendirmek için bir yöntemi açıklamaktadır.

İskele Lipozomlar kullanarak Lipid-proksimal protein-protein etkileşimleri Sulandırın için İn Vitro

Prolin-prolin endopeptidaz-1 (PPEP-1), insan patojeni Clostridium difficile'den salgılanan bir metalloprotaz ve umut verici ilaç hedefidir. Burada, bu proteinin üretimi ve yapısının belirlenmesi için gerekli tüm yöntemleri açıklıyoruz.

Üretim, Kristalleşme ve Yapı Tayini ve<em&gt; C. difficile</em&gt; PPEP-1 mikro-tohumlama ve Çinko-SAD aracılığıyla

stabilize edici ve yeni bir iki boyutlu poliakrilamit jel elektroforez bağlanmış bir amin-reaktif protein çapraz bağlayıcı kullanılarak modifiye edilmemiş doku lizattan doğal protein kompleksleri ayırmak için bir yöntem olup (PAGE) sistemi sunulmuştur.

Multimer-PAGE: Biyolojik örnekler olarak yakalamak için bir yöntem ve özümleme protein kompleksleri

Helisel peptidler sülfür hayvan zinciri fotoğraf kaynaklı thiol-KD/thiol-yne hydrothiolation kullanarak thioether/vinil inşası için bir iletişim kuralı mevcut.

Thioether/vinil sülfür-gergin helisel peptidler fotoğraf yolu ile indüklenen Thiol-KD/yne Hydrothiolation oluşturmak

Burada, fluorescently Qβ VIP üzerinde disulfides dibromomaleimide ile functionalize için bir yordam mevcut. Biz Qβ ifade ve arıtma, molekülleri dibromomaleimide functionalized sentezi ve dibromomaleimide ve Qβ arasında konjugasyon tepki açıklanmaktadır. Elde edilen Sarı floresan konjuge parçacık bir floresan sonda hücrelere olarak kullanılabilir.

Konjugasyon kaynaklı floresan pegile virüs benzeri moleküller tarafından Dibromomaleimide-disülfür Kimya yapma

1,2-dithiolane sentezi için bir protokol peptid ve peptid kendinden montajlı kaynaklanan supramolecular yapıları karakterizasyonu değiştiren.

1,2-Dithiolane malzemelerin ve kendi kendine montaj peptidler değiştirilme tarihi

Sistein-zengin peptidler onların disülfür bağlantısı bağlı olarak farklı üç boyutlu yapılar içine katlayın. Arabellek oksidasyon istenen disülfür bağlantı yol değil tek tek disülfit izomerler hedeflenen sentezi gereklidir. Protokol ile 3 disülfür bağ peptidler ve NMR ve MS/MS çalışmaları kullanarak onların yapısal analiz sentez seçici fırsatlar.

Sentez ve μ-Conotoxin PIIIA izomerler farklı disülfür Connectivities ile yapı belirlenmesi

Disulfide bağlantıları uzun birçok proteinlerin yapısını stabilize olduğu bilinmektedir. Bu bağlantıyla stabilize edilmiş multimerik kompleksleri analiz etmek için basit bir yöntem, SDS-PAGE analizinin azaltılması yoluyla yapılır. Burada, bu yöntem, insan kemiği osteosarkomu hücre hattı U-2 OS dutpase nükleer izoformu analiz ederek gösterilmektedir.

Kültürde memeliler hücrelerinde Disulfide bağlantıları ile stabilize Multimeric kompleksleri algılamak için non-azaltma SDS-sayfa analizi ve kimyasal Crosslinking birleştiren

Öğrenin disülfid stabilize transmembran peptit kompleksleri üretimini E. coli'de histidin etiketli füzyon protein ekspresyonu ve nikel afinitesi kromatografisi kullanarak. Bu yöntem çözüm NMR ile yapısal analiz için uygundur.

Yapısal Çalışmaları üretimi disülfid stabilize Transmembran Peptit Kompleksi

Daha fazla video keşfet