Yapısal Çalışmaları üretimi disülfid stabilize Transmembran Peptit Kompleksi

Bu protokol, membran proteinlerinin lipid gömülü alanları aracılığıyla birbirleriyle nasıl etkileşime girdiğini anlamayı amaçlayan yapısal çalışmalar için kovalent olarak stabilize edilmiş transmembran peptit kompleksleri üretir. İlk olarak, e coli'de ilgilenilen transmembran dizisini içeren tarihi etiketli bir füzyon proteinini ifade edin. Daha sonra, bir nikel afinite matrisi kullanarak gine ve deterjan kullanarak proteini inklüzyon vücut fraksiyonundan çıkarın.

Tarih etiketli füzyon proteinini konsantre edin ve di sülfür, sütunu oksitleyici maddeler içeren bir çözelti içinde yıkayarak çap formuna çapraz bağlayın. Daha sonra, çapraz bağlı füzyon proteinini Tri Fluor asetik asit içinde elüte edin ve füzyon ortağını serbest bırakmak için siyanojen bromür ile muamele edin, çapraz bağlı peptit ürününü ters fazlı HPLC ile sindirim karışımından izole etmeye devam edin. Sonuç olarak, ürünlerin kimliği ve saflığı SDS sayfası ve kütle spektrometresi analizleri ile doğrulanır.

Bu tekniğin temel avantajı, çözelti veya katı hal NMR gibi teknikler kullanılarak yapısal çalışmalar için saf sosyometrik komplekslerin üretilmesidir. İki transmembran alanının etkileşime girdiği bilinse bile, peptit çözünürlüğü ve kompleks oluşumu deneysel koşullar altında genellikle çelişmektedir. İyi tanımlanmış bir kovalent stabilize kompleksle başlamak, yüksek kaliteli veri toplama için test edilebilecek deneysel koşullar aralığını önemli ölçüde genişletebilir.

Genel olarak, bu yönteme yeni olan kişiler, bu son derece hidrofobik protein parçalarını işlemenin zorluğuyla mücadele edeceklerdir. Bu protokol ve beraberindeki el yazmasında verilen tavsiyeler, tahmin ve saflaştırma sürecindeki en yaygın zorluklardan bazılarına basit bir çözüm sağlamak için tasarlanmıştır. Damak, işkembe peptit füzyonunu ifade eden bir litrelik bir bakteri kültürü ve 50 mililitre lizis tamponunda yeniden süspanse edilir.

Daha sonra bir dakika boyunca maksimum çıkışta üç döngü sonikasyon gerçekleştirin ve beş dakika boyunca buz üzerinde soğutun. Çözünmeyen inklüzyon cisimciği malzemesini 15 dakika dekant boyunca 20.000 G'de santrifüjleme ile hasat edin ve süpernatanı bir kenara koyun. IB fraksiyonunun geliştirilmiş bir saflığı gerekiyorsa, sonikasyon ve santrifüjleme adımları tekrarlanabilir.

Geziyi onaylamak için SDS sayfa analizi için pelet ve süpernatan malzeme örneklerini ayırın. İnklüzyon cisimciklerine TM füzyon lokalizasyonu artık inklüzyon cisimciği peletlerini litre kültür başına 25 ila 50 mililitre kullanarak gine çözeltisi içinde çözmektedir. İşlenmiş, ara sıra güneşlenme ile birkaç saat oda sıcaklığında nazikçe karıştırın.

Daha sonra, inklüzyon cisi lizatını bir saat boyunca 75.000 ila 100.000 kez G'de santrifüjleme ile temizleyin. Oda sıcaklığında, supernat'ı 50 mililitrelik konik bir tüpte 0,2 mikronluk zardan süzün. Temizlenmiş inklüzyon cisi lizatını, toplu bağlama için gine çözeltisine dengelenmiş, nikel afinite reçinesi ile birleştirin.

Süspansiyonu gece boyunca oda sıcaklığında nazikçe karıştırın. İnklüzyon gövdesi lizat nikel reçine süspansiyonunu, tüm hacim akana kadar gözenekli yatak destekli boş bir yerçekimi akış kolonuna yükleyin. Hala bağlanmamış füzyon proteini içerebilecek akışı toplayın ve bir kenara koyun.

Ardından nikel reçinesini yerçekimi ile yıkayın. Beş milimolar ışın merkaptoetanol içeren beş yatak hacmi üre çözeltisi ile akış. Üçüncü yıkama için ışın merkaptoetanol olmadan ikinci bir yıkama yapın.

Bakır sülfat ve oksitlenmiş glutatyon ile desteklenmiş üre çözeltisi kullanın. Ardından kolon çıkışını kapatın ve maksimum di sülfür bağı oluşumuna izin vermek için oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Oksitleyici üre çözeltisini 10 yatak hacmi su ile yıkayın.

Ardından kolon yatağını kurutmak için bir vakum hattı uygulayın ve kolon çıkışını kapatın. Şimdi bir kimyasal güvenlik davlumbazında, 1,5 yatak hacmi temiz TFA ekleyin, aside eşit maruz kalmayı sağlamak için nikel reçinesini küçük bir spatula ile karıştırın ve beş dakika inkübe edin. Asit eluatını toplayın, gerekirse tüm sıvıyı dışarı itmek için sıkıştırılmış bir hava yolu ile hafifçe basınç uygulayın.

Asit seyreltme adımını başka bir 1.5 yatak hacmi temiz TFA ile tekrarlayın Protein verimini ölçmek için, TFA EIT'in tri floro etanol içinde seyreltilmesini yapın ve 280 nanometrede ATF'ye karşı emiciliği ölçün. Asit elu'yu damla damla %80 nihai TFA konsantrasyonuna seyreltin. Hafifçe karıştırırken su ilavesi.

Formları çökeltirseniz, çözelti netleşene kadar az miktarda TFA ekleyin. Sonra su ile% 80'e kadar düzeltin. SDS sayfa analizi için beş mikrolitrelik bir ön digest numunesi ayırın ve hemen sıvı nitrojen içinde dondurun.

Daha sonra, siyanojen bromür kristallerini mililitre numune başına yaklaşık 0.2 gram tartın. Toksik kimyasalı güvenli bir şekilde tartmaya özen göstermek. Siyanojen bromürü bir güvenlik başlığında numuneye ekleyin ve tamamen eriyene kadar hafifçe karıştırın.

Şimdi reaksiyon kabını inert gaz contası içinde yıkayın ve ışıktan korunan oda sıcaklığında üç ila dört saat inkübe edin. SDS sayfa analizi için beş mikrolitrelik bir son sindirim numunesi ayırın, hemen sıvı nitrojen içinde dondurun ve ön sindirim numunesi ile birlikte liyofilize edin. Daha sonra sindirim reaksiyonunu rejenere bir selüloz diyaliz kasetine aktarın ve hacimde önemli bir artışa izin verin.

Numuneyi kimyasal femme davlumbazındaki dört litre suya karşı gece boyunca diyalize edin. Ertesi sabah, askıda protein çökeltisi ile diyaliz reaksiyon çözeltisini diyaliz kasetinden çıkarın ve süspansiyonu 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Daha sonra, suyu çıkarmak için numuneyi birkaç gün dondurun ve liyofilize edin ve herhangi bir siyanojen, bromür ve TFA izi, çözelti tamamen berraklaşana kadar 100 miligrama kadar Liyofilize sindirim ürününü üç mililitre saf formik asit karışımına çözün.

Numuneyi, beş mililitrelik bir numune döngüsü kullanarak bir çözücü A akışında hazırlayıcı ölçekli bir zoax SB 300 C3 kolonuna yükleyin. Daha sonra sindirim ürünlerini en az beş sütun hacmi boyunca bir çözücü B gradyanında elüte edin. İlgilenilen türü belirlemek ve beklenen kütle liyofilizesini doğrulamak için HPLC fraksiyonlarını SDS sayfası ve MALDI TOF kütle spektrometresi ile analiz edin.

Çapraz bağlı peptit ürününü içeren HPLC fraksiyonları. Ürün bir toz yerine bir filme kurursa, sıvı içinde dondurulan ve liyofilize edilen küçük bir HFIP hacminde yeniden çözülebilir. Yine, sonuç, kolayca devrilen ve tartılan kabarık beyaz bir koni olacaktır İmmüno-reseptör transmembran sinyal molekülünün transmembran ve işaretleme bölgelerini kodlayan bir DNA dizisi.

DAP 12, Hintçe üç ve BAM H bir kısıtlama bölgesi kullanılarak PMM peptit vektörüne klonlandı. Elde edilen bakteriyel ekspresyon yapısı, siyanojen bromür bölünmesi ve oksidatif çapraz bağlama için benzersiz iç metiyonin ve sistin kalıntılarına sahip bir his etiketli trip füzyon proteini üretir. İşkembe füzyonları için elde edilen ekspresyon seviyesi, bağlı peptidin amino asit dizisine bağlı olarak değişir.

Bu preparat, bir litre kültür ve dört mililitre nikel matrisinden yaklaşık 120 miligram saf bozulmamış füzyon proteini verdi. Hücre lizizinden sonra, füzyon proteini, inklüzyon cisimciği peletine lokalize edildi. Nikel saflaştırılmış işkembe DAP 12 TM füzyonunun yaklaşık% 70'i, DME formuna çapraz bağlı disülfürdü.

DAP 12 TM peptit ürünleri, toplam SİYANOJEN bromür sindirim numunelerinde kolayca tanımlanamasa da, indirgenmiş sindirim numunesindeki bozulmamış füzyon ve açma fragmanı bantlarının karşılaştırılması, sindirim ürünlerinin bu tipik ayrımında füzyonun sindiriminin yaklaşık %60 oranında tamamlandığını gösterir. Ters fazlı HPLC kullanan hazırlayıcı bir ölçek C3 kolonunda, bağlı ürünler iki aşamalı bir çözücü B gradyanında ima edilir. Diss sülfür çapraz bağlı peptit ürünü, indirgeyici olmayan ve indirgeyici olmayan koşullar altında ana HPLC fraksiyonlarının SDS sayfa analizinde tanımlanabilir. Maldi tof kütle spektrometresi analizi, 6729.2 Dalton'daki ana ürün ile zirve dördüncüdeki deme peptidinin kimliğini doğrular.

Siyanojen, bromür, organik çözücüler ve konsantre asitlerle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın. Bu prosedürler uygulanırken uygun koruyucu giysiler giyilmeli ve siyanojen bromür asla onaylanmış kimyasal güvenlik başlığının dışında kullanılmamalıdır. Bu teknik, çok alt birimli immün reseptörlerin lenfosit zarı içindeki protein etkileşimleri yoluyla nasıl bir araya geldiğini gösteren transmembran peptit komplekslerinin üç farklı çözelti n mr yapısı için anahtar çalışma materyali sağlamıştır.

Bu tekniğin uygulanmasının diğer membran protein sistemleri için de eşit derecede değerli olacağına inanıyoruz.