Name: Mürin Atriyal ve Ventriküler kardiyomiyositlerde izolasyonu ve Kv Kanal Kayıtları (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 33 s
Description: Öğrenin genetik olarak modifiye edilmiş farelerden atriyal ve ventriküler kardiyomiyosit izolasyonunu ve Kv kanal kayıtlarını. Bu yöntem, kardiyak aritmi mekanizmalarını anlamak için değerli bir araç sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), Fritz-Thyssen-Stiftung ve Charité / MDC hibe tarafından finanse edildi.

1. Hayvan Anestezi ve Organ Toplama <ol><li> Ketamin (200 mg / kg) ve ksilazin (20 mg / kg) intraperitoneal (ip) enjeksiyonu ile fare narkoz. </li><li> Kan pıhtılaşması ve trombus oluşumunu önlemek için 250 IU Heparin ip enjekte antikoagülan için. </li><li> Derin narkoz arefleksi ile karakterize olan, ulaşılana kadar bekleyin. Hafifçe kuyruk çimdikleme kornea veya test uçuşu refleks dokunarak arefleksi, test korneal refleks kontrol etmek için. </li><li> Ameliyat masasının üzerine fare aktarın ve yatar pozisyonda sabitleyin. </li><li> Cilt ve kılıç şeklinde aşağıda karın duvarı kesilirken ve kapaklı torakotomi gerçekleştirin: kosta kemer boyunca her iki taraf için kesme uzatın ve daha sonra medial aksiller hat kaburga kesilmiş, göğüs kafesi yukarı saptırmak. </li><li> , Perikard aç büyük damarları bulmak. Yavaşça iyi aorta görüntülemek için kalp kaudal basın. Forseps kullanarak aort Kelepçe. </li><li> Nin bir çift içbükeylik olarak kalp yerleştirin<html> cissors ve tek kesim ile tüm bağlantı damarları teşrih. Langendorff kanülasyon için asendan aort yeterince büyük bir bölümünü korumak için emin olun. </li><li> Buz gibi soğuk ve pre-Oksijenli çözümü 1 (çözümler için, bkz Tablo 1) ile dolu bir Petri kabı hemen çıkarılarak kalp aktarın. </li></ol> 2. Kalp ve Langendorff Perfüzyon hazırlanması <ol><li> Bir 1.8F çelik kanül ile aorta kanüle. Hava embolisi önlemek için emin olun. </li><li> Çözelti 1 1 ml olan bir cerrahi dikiş ve çalkalama ile koroner aort kanülünün üzerinde sabitleştirmek. </li><li> Langendorff aparatı ile kanül takın. </li><li> Torakotomi gelen Langendorff kanülasyon için zaman emin olun miyokarda Uzamış iskemi / reperfüzyon hasarı önlemek için 120 sn aşmaz. </li><li> Ca 2 10 ml serpmek kalp + serbest çözelti 2 (4 ml / dak.) </li><li> 8 dak (4 mL / dak) kollagenaz için çözelti 3 ile serpmek kalp. </li></ol>Kardiyak Chambers le &quot;&gt; 3. Mikrocerrahi Ayrışma <ol><li> Düşük Ca 2 + çözümü 4 içeren önceden ısıtılmış 100 mm Petri kabı içine Transferi kalp. </li><li> Dikkatlice makas ile aort ve diğer non-kardiyak doku kaldırmak ve atın. </li><li> Ayrı atriyumlar ve ventriküller ve ayrı ayrı her odası ile devam edin. Çözüm 4 dalmış hücreleri tutun. Küçük hacimli (az 5 ml) kullanın. </li></ol> 4. Kardiyomiyositlerin Diğer Ayrışma <ol><li> Atriyal kardiyomiyositlerde: <ol><li> Atriyal kardiyomiyositlerde ayrı önceden ısıtılmış 100-mm kültür çanak içine kulakçıklar aktarmak ve nazikçe ince forseps ile didik didik dokuya disosiye bireyselleştirmeye için. Dokusunun neredeyse tam bir ayrışma olun. </li><li> 5 dakika boyunca çözelti 5, 1 ml hücre askıya almak için büyütülmüş bir ateş cilalı bir plastik pipet ucu ile bir 1 ml pipet kullanın. </li><li> Bir hücre filtresi (200 mikron göz açıklığı) kullanılarak artıklardan hücreleri ayırın. </li> &lt;li&gt; 5 ml hücre süspansiyonu ile çözelti 5 ve oda sıcaklığında 16 x g&#39;de 2 dakika süre ile santrifüje ekleyin. </li><li> Aşağıdaki adımlar, bir hücre kültürü kaputu altında işletilmektedir. 6 çözelti 5 ml süpernatant ve yeniden askıya pelet atın. </li><li> Bir 15 ml tüp içinde 10 dakika boyunca yerçekimi ile sedimantasyon sonra, oda sıcaklığında 16 xg&#39;de 1 dakika süreyle santrifüjlenir. Süpernatantı. Solüsyonu 6 1-5 ml kendi miktar bağlı hücreleri yeniden askıya. </li></ol></li><li> Ventriküler kardiyomiyositlerde: <ol><li> 4. çözelti 5 ml ince forseps ile söz konusu sol ventrikül bölge teşrih. </li><li> Hücrelerin en ayrılır kadar yavaşça pipetle hücreler süspanse edin. 50 ml&#39;lik bir tüpe (200 mikron göz açıklığı) filtrelenmesinden sonra çözelti hücre transferi, 25 ml&#39;lik bir hacme ekleyin. </li><li> Oda sıcaklığında 16 x g&#39;de 2 dakika süre ile santrifüje. </li><li> Aşağıdaki adımlar, bir hücre kültürü kaputu altında işletilmektedir. Süpernatantı, 25 ml pelet yeniden askıya6 ve çözelti 10 dk için hücrelerin sedimantasyon izin verir. </li><li> Hücreleri sayın ve süpernatant kaldırmak, 25 eklemek - 50 ml çözelti 6 hücreleri üzerinde. </li></ol></li></ol> 5. Biyokimyasal Hücresel Elektrofizyoloji, ya Çalışmaları IF kardiyomiyositlerin hazırlanması <ol><li> Elektrofizyolojik çalışmalar için, bir 50 ml tüp içinde çözelti halinde 6 miyositleri tutmak ve sedimantasyon inhibe ederler. </li><li> Için biyokimyasal çalışmalar, örneğin kalsiyum görüntüleme, laminin kaplı hücre kültürü çanak tabak miyositler (son konsantrasyonu 20 mg / PBS ml laminin). </li><li> Immunofloresan boyama cam kapak slipleri ile bir hücre kültürü çanağı plaka hazırlamak ve laminin çözeltisi (nihai konsantrasyon 50 mg / ml PBS içerisinde laminin) ile kaplanmış için. <ol><li> Kaplama miyositlerin önce çözüm çıkarın. Levha hücreleri ve bir mikroskop kullanarak, hücre yoğunluğu kontrol eder. </li><li> % 2 CO2 içinde 37, 1 saat boyunca kayma ° C kapsayacak şekilde miyositleri bağlı olsun, çözelti çıkarmakve standart bir boyama işlemi protokolü ile hemen başlayabilirsiniz. </li><li> Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca PBS içinde sabitleştirici, örneğin,% 4 PFA (pH 7.5) ile inkübe edin ve 5 dakika her biri için üç PBS yıkama adımları ile takip. </li><li> Hücreler geçirgenliği ve spesifik olmayan bağlayıcı antikor% 10 serum ve% 0.3 Triton, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca PBS içinde% 0.2 BSA ile miyositleri inkübe inhibe etmek. </li><li> 37, 1 saat boyunca birincil antikor ile inkübe ° C ve daha önce anlatıldığı gibi yıkayın. </li><li> Oda sıcaklığında 1 saat süreyle ikincil antikor ile inkübe edin. Çekirdekler counterstain ve α-aktinin kullanımı DAPI ve florokrom konjuge phalloidin (Alexa Fluor 488, Invitrogen) için. </li><li> Yıkadıktan sonra, cam kapak floresans montaj orta silan tedavi mikroskop slaytlar ve embed hücreleri üzerinde dikkatle kayıyor aktarın. </li></ol></li></ol> 6. Hücresel Elektrofizyoloji <ol><li> Fre üzerine Tüm-hücre yama klemp kayıtları yapınshly oda sıcaklığında atriyal ve ventriküler kardiyomiyositlerde izole. </li><li> Ekstrasellüler banyo solüsyonu tanımlı ses ile dolu perfüzyon odasının içine sağlıklı görünmesini kardiyomiyositlerde aktarın. 117 mM NaCl, 4 mM KCI, 1 mM KH 2 PO 4, 4 mM NaHCO 3, 1,7 mM MgCl2, 3 mM CoCl 2, 10 mM HEPES, 10 mM glukoz, ve 0.02 mM Tetrodotoxin (TTX), (pH 7.4) . PH değeri ayarı için NaOH kullanın. </li><li> (Yani IX71 inverted mikroskop, bir Multiclamp 700B Amplifikatör, pClamp10.3 yazılımı (Moleküler Cihazlar) ile Digidata 1440A toplama sistemi ve PC) düzgün yama kelepçe teçhizat kullanın. </li><li> 2. CP Na 130 mM KCl, 2 mM MgCl2, 11 mM HEPES, 11 mM EGTA, 5 mM Na 2 ATP, 0.4 mM Na 2 GTP, 5 mM ihtiva eden hücre içi solüsyonu ile dolu olduğunda MΩ 3-5 arasında dirençleri ile yama pipet kullanarak ve 4.9 mM CaCl2 (pH 7.2). PH değerinin ayarlanması için KOH kullanın. </li><li> Dışa K + akımları du Evokehalka 4.5-sn voltaj adımları -60 ve 20 ms -40 mV prepulse sonra -70 mV tutarak potansiyelinden 10 mV adımlarla +50 mV arasında potansiyelleri test etmek. </li><li> Sızıntı akımları her zaman &lt;100 pA olduğundan emin olun. </li><li> , Heteropodatoxin 2 (HpTx2; Alomone) veya tetraetilamonyum (TİM, Sigma); farklı K diseksiyonu için + akımları gibi 4-aminopiridin (ICN Biomedicals, Irvine, CA, USA 4-AP) gibi spesifik inhibitörleri kullanmak. Stok çözeltileri ekstraselüler banyo solüsyonu olarak hazırlanmış ve &quot;temel&quot; kayıt sonra bir mikro tip yoluyla hücre olası en yakın çevresine doğrudan doğruya uygulanabilir. Dengeleme &quot;ilaç&quot; kayıtları önce 2-3 dakika süreyle izin verilmelidir. </li><li> Analizi için hücre boyutu ayrı ayrı hücrelerde (tam hücre zarındaki kapasitans) akım genlikleri normalleştirmek. PClamp10.3 yazılımı (Moleküler Cihazlar) veya benzer yazılımları kullanarak çevrimdışı verileri analiz. </li></ol>

<ol><li>Abbott, G. W., Goldstein, S. A., Sesti, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Do+all+voltage-gated+potassium+channels+use+MiRPs%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Do all voltage-gated potassium channels use MiRPs?</a> Circ. Res. 88, 981-983 (2001).</li>
<li>Abbott, G. W., Sesti, F., Splawski, I., Buck, M. E., Lehmann, M. H., Timothy, K. W., Keating, M. T., Goldstein, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MiRP1+forms+IKr+potassium+channels+with+HERG+and+is+associated+with+cardiac+arrhythmia%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">MiRP1 forms IKr potassium channels with HERG and is associated with cardiac arrhythmia.</a> Cell. 97, 175-187 (1999).</li>
<li>Barry, D. M., Trimmer, J. S., Merlie, J. P., Nerbonne, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression+of+voltage-gated+K%2B+channel+subunits+in+adult+rat+heart.+Relation+to+functional+K%2B+channels%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Differential expression of voltage-gated K+ channel subunits in adult rat heart. Relation to functional K+ channels?</a> Circ. Res. 77, 361-369 (1995).</li>
<li>Benjamin, E. J., Wolf, P. A., D'Agostino, R. B., Silbershatz, H., Kannel, W. B., Levy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+atrial+fibrillation+on+the+risk+of+death%3A+the+Framingham+Heart+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Impact of atrial fibrillation on the risk of death: the Framingham Heart Study.</a> Circulation. 98, 946-952 (1998).</li>
<li>Bou-Abboud, E., Nerbonne, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+correlates+of+the+calcium-independent%2C+depolarization-activated+K%2B+currents+in+rat+atrial+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Molecular correlates of the calcium-independent, depolarization-activated K+ currents in rat atrial myocytes.</a> J. Physiol. 517 (Pt 2), 407-420 (1999).</li>
<li>Gaborit, N., Steenman, M., Lamirault, G., Le, M. N., Le, B. S., Lande, G., Leger, J., Charpentier, F., Christ, T., Dobrev, D., Escande, D., Nattel, S., Demolombe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+atrial+ion+channel+and+transporter+subunit+gene-expression+remodeling+associated+with+valvular+heart+disease+and+atrial+fibrillation%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Human atrial ion channel and transporter subunit gene-expression remodeling associated with valvular heart disease and atrial fibrillation.</a> Circulation. 112, 471-481 (2005).</li>
<li>Guo, W., Xu, H., London, B., Nerbonne, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+of+transient+outward+K%2B+current+diversity+in+mouse+ventricular+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Molecular basis of transient outward K+ current diversity in mouse ventricular myocytes.</a> J. Physiol. 521 (Pt 3), 587-599 (1999).</li>
<li>Lundby, A., Ravn, L. S., Svendsen, J. H., Hauns, S., Olesen, S. P., Schmitt, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KCNE3+mutation+V17M+identified+in+a+patient+with+lone+atrial+fibrillation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Physiol.+Biochem%22%5BJournal%5D)">KCNE3 mutation V17M identified in a patient with lone atrial fibrillation.</a> Cell Physiol. Biochem. 21, 47-54 (2008).</li>
<li>Ma, K. J., Li, N., Teng, S. Y., Zhang, Y. H., Sun, Q., Gu, D. F., Pu, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+KCNQ1+current+by+atrial+fibrillation-associated+KCNE4+%28145E%2FD%29+gene+polymorphism%5BTitle%5D)+AND+%22Chin+Med.+J.+%28Engl.%29%22%5BJournal%5D)">Modulation of KCNQ1 current by atrial fibrillation-associated KCNE4 (145E/D) gene polymorphism.</a> Chin Med. J. (Engl.). 120, 150-154 (2007).</li>
<li>McCrossan, Z. A., Abbott, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MinK-related+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">The MinK-related peptides.</a> Neuropharmacology. 47, 787-821 (2004).</li>
<li>Pongs, O., Schwarz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ancillary+subunits+associated+with+voltage-dependent+K%2B+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Ancillary subunits associated with voltage-dependent K+ channels.</a> Physiol. Rev. 90, 755-796 (2010).</li>
<li>Ravn, L. S., Aizawa, Y., Pollevick, G. D., Hofman-Bang, J., Cordeiro, J. M., Dixen, U., Jensen, G., Wu, Y., Burashnikov, E., Haunso, S., Guerchicoff, A., Hu, D., Svendsen, J. H., Christiansen, M., Antzelevitch, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gain+of+function+in+IKs+secondary+to+a+mutation+in+KCNE5+associated+with+atrial+fibrillation%5BTitle%5D)+AND+%22Heart+Rhythm%22%5BJournal%5D)">Gain of function in IKs secondary to a mutation in KCNE5 associated with atrial fibrillation.</a> Heart Rhythm. 5, 427-435 (2008).</li>
<li>Ravn, L. S., Hofman-Bang, J., Dixen, U., Larsen, S. O., Jensen, G., Haunso, S., Svendsen, J. H., Christiansen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relation+of+97T+polymorphism+in+KCNE5+to+risk+of+atrial+fibrillation%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Relation of 97T polymorphism in KCNE5 to risk of atrial fibrillation.</a> Am. J. Cardiol. 96, 405-407 (2005).</li>
<li>Roepke, T. K., Abbott, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacogenetics+and+cardiac+ion+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Vascul.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Pharmacogenetics and cardiac ion channels.</a> Vascul. Pharmacol. 44, 90-106 (2006).</li>
<li>Roepke, T. K., Kontogeorgis, A., Ovanez, C., Xu, X., Young, J. B., Purtell, K., Goldstein, P. A., Christini, D. J., Peters, N. S., Akar, F. G., Gutstein, D. E., Lerner, D. J., Abbott, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+deletion+of+kcne2+impairs+ventricular+repolarization+via+disruption+of+I%28K%2Cslow1%29+and+I%28to%2Cf%29%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Targeted deletion of kcne2 impairs ventricular repolarization via disruption of I(K,slow1) and I(to,f).</a> FASEB J. 22, 3648-3660 (2008).</li>
<li>Sesti, F., Abbott, G. W., Wei, J., Murray, K. T., Saksena, S., Schwartz, P. J., Priori, S. G., Roden, D. M., George, A. L., Goldstein, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+common+polymorphism+associated+with+antibiotic-induced+cardiac+arrhythmia%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A common polymorphism associated with antibiotic-induced cardiac arrhythmia.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 10613-10618 (2000).</li>
<li>Temple, J., Frias, P., Rottman, J., Yang, T., Wu, Y., Verheijck, E. E., Zhang, W., Siprachanh, C., Kanki, H., Atkinson, J. B., King, P., Anderson, M. E., Kupershmidt, S., Roden, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atrial+fibrillation+in+KCNE1-null+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Atrial fibrillation in KCNE1-null mice.</a> Circ. Res. 97, 62-69 (2005).</li>
<li>Yang, Y., Xia, M., Jin, Q., Bendahhou, S., Shi, J., Chen, Y., Liang, B., Lin, J., Liu, Y., Liu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+KCNE2+gain-of-function+mutation+in+patients+with+familial+atrial+fibrillation%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Hum.+Genet%22%5BJournal%5D)">Identification of a KCNE2 gain-of-function mutation in patients with familial atrial fibrillation.</a> Am. J. Hum. Genet. 75, 899-905 (2004).</li>
<li>Zeng, Z. Y., Pu, J. L., Tan, C., Teng, S. Y., Chen, J. H., Su, S. Y., Zhou, X. Y., Zhang, S., Li, Y. S., Wang, F. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%5BThe+association+of+single+nucleotide+polymorphism+of+slow+delayed+rectifier+K%2B+channel+genes+with+atrial+fibrillation+in+Han+nationality+Chinese%5D%5BTitle%5D)+AND+%22Zhonghua+Xin.+Xue.+Guan.+Bing.+Za+Zhi%22%5BJournal%5D)">[The association of single nucleotide polymorphism of slow delayed rectifier K+ channel genes with atrial fibrillation in Han nationality Chinese].</a> Zhonghua Xin. Xue. Guan. Bing. Za Zhi. 33, 987-991 (2005).</li>
<li>Zhang, M., Jiang, M., Tseng, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((minK-related+peptide+1+associates+with+Kv4.2+and+modulates+its+gating+function%3A+potential+role+as+beta+subunit+of+cardiac+transient+outward+channel%3F+Circ%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">minK-related peptide 1 associates with Kv4.2 and modulates its gating function: potential role as beta subunit of cardiac transient outward channel? Circ.</a> Circ. Res. 88, 1012-1019 (2001).</li>
</ol>

Biz ifşa etmek başka bir şey var.

Gen delesyonu ile ilgili kardiyak fonksiyon ve kardiak patoloji incelemek için GDO&#39;lu fare suşları artan gelişimi ile in vitro spesifik gen silinmesi etkilerini incelemek için özel yöntemler giderek artan bir ilgi de var. Laboratuarımızda kardiyak repolarizasyon üzerine Kv kanal yan alt birimden bir aile rollerini incelemek. KCNE genler KCNEs kendi üzerinde herhangi bir potasyum akımları geçemez tek transmembran alanı Kv kanal yan alt birimden vardır. Insan ventriküler ve atriyal repolariz...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td></tr><tr><td> Tetrodotoxin </td><td> Alomone </td></tr><tr><td> 4-aminopiridin </td><td> ICN Biomedicals </td></tr><tr><td> 2 Heteropodatoxin </td><td> Alomone </td></tr><tr><td> Tetraetilamonyum </td><td> Sigma Kimyasallar </td></tr><tr><td> Kollajenaz Tip 2 </td><td> Worthington </td></tr></tbody></table>

mürin atriyal ve ventriküler kardiyomiyositlerde izolasyonu ve kv kanal kayıtları

Isolation and Kv Channel Recordings in Murine Atrial and Ventricular Cardiomyocytes

KCNE genlerin fonksiyonel özelliklerini değiştirmek için Kv kanalı alfa alt birimden heteromerik kompleksler oluştururlar Kv kanal yan altbirimden küçük bir aile için kodlamak. KCNE genlerdeki mutasyonlar gibi uzun QT sendromu ve / veya atriyal fibrilasyon gibi kardiyak aritmiler olan hastalarda bulunmuştur. Bununla birlikte, bu hastalıklara yol açan belirli moleküler patofizyolojisi belirsiz kalır. Önceki çalışmalarda bu genlerdeki mutasyonların sebep olan hastalığın elektrofizyolojik özellikleri çoğunlukla heterolog ekspresyon sistemleri incelenmiş ve rapor edilmiş etkileri doğrudan yerli kardiyomiyositlerde tercüme edilebilir eğer biz emin olamayız. Laboratuvarımızda bu yüzden farklı bir yaklaşım kullanır. Biz görüntülenmiştir Deneyleri Dergisi bu sayısında tanımlayan benzersiz bir teknik - Biz doğrudan hücresel elektrofizyoloji tarafından nakavt farelerin izole kardiyomiyositlerde KCNE gen delesyonu etkilerini incelemek. Genetica gelen kalplerlly mühendislik KCNE farelerin hızla eksize ve aort kanülasyon tarafından Langendorff aparatı monte edilirler. Miyokardda Serbest Ca 2 + EGTA tarafından bağlanır ve kardiyak miyosit dissosiasyon ardından özel bir düşük Ca 2 + tampon içeren kollajenaz ile koroner arterlerin retrograd perfüzyon elde edilir. Atria, serbest sağ ventriküler duvara ve sol ventrikül sonra, mikrocerrahi teknikler ile ayrılabilmektedir. Kalsiyum sonra yavaş yavaş işlem çamaşır içeren bir çoklu adım izole kardiyomiyositler tekrar ilave edilir. Spontan kontraksiyonları ile sağlıklı görünüm Atriyal ve ventriküler kardiyomiyositlerde sonra hemen izolasyonu takiben ilk 6 saat içinde yama klemp tekniği veya diğer biyokimyasal analizler ile elektrofizyolojik analizlere tabi tutulmaktadır.

In vitro ilgi belirli genlerin işlevini incelemek için genetiği değiştirilmiş farelerin erişkin fare kardiyomiyositlerde izolasyonu daha da kardiyak patofizyoloji anlamak için güçlü bir araç haline gelmiştir. Bu yöntem, şu anda dünya çapında temel bilim laboratuarları sadece bir küçük ama artan sayıda tarafından kullanılır. Ancak, yetişkin ventriküler murin kardiyomiyositlerde izolasyonu zor ve tecrübeli eller tarafından iyice ve tekrarlı yapılması gerekiyor olabilir. Şekil 1 taze izole timsali...

Kv kanal disfonksiyonu kardiyak aritmiler ile ilişkilidir. Biz Kv kanal yan altbirim knockout farelerde atriyal ve ventriküler kardiyomiyositlerde izolasyonu için sistematik bir protokol kullanmak gibi aritmiler neden moleküler mekanizmaları incelemek için. İzole kardiyomiyositlerde hemen sonra hücresel elektrofizyolojik çalışmalar, biyokimyasal ya da immunofloresan (IF) deneyleri için de kullanılabilir.

Mürin Atriyal ve Ventriküler kardiyomiyositlerde izolasyonu ve Kv Kanal Kayıtları

KCNE genes encode for a small family of Kv channel ancillary subunits that form heteromeric complexes with Kv channel alpha subunits to modify their ...

Bu prosedürün genel amacı, tüm hücre yama kenetleme (whole cell patch clamp) kaydı ve diğer deneylerde kullanılmak üzere, genetiği değiştirilmiş farelerden canlı atriyal ve ventriküler kardiyomiyositler izole etmektir. Bu işlem, öncelikle anestezi uygulanmış hayvanın kalbinin dikkatli ancak hızlı bir şekilde çıkarılmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım ise, çıkarılan ve kanüle edilen kalbin LOR düzeneğine bağlanmasıdır.Ardından, bağ dokuyu gevşetmek için kalp, kollajenaz çözeltisi ile geniş bir şekilde retro-perfüze edilir; son adım ise dokuyu ince pensetlerle nazikçe çekerek ayrıştırmak ve hücreleri ucu ateşle eritilerek genişletilmiş bir plastik pipet ucuyla süspande etmektir. Bundan sonra hücreler, kalsiyum açısından zengin çözelti ile kademeli olarak yeniden süspande edilir. Nihayetinde, voltaja bağımlı potasyum kanalı akımlarındaki farkları göstermek için tüm hücre yama kenetleme (whole cell patch clamp) tekniği kullanılır.Bu yöntemin temel avantajı, sonraki deneyler için uygun özelliklere sahip, yeterli miktarda HL ve ventriküler kardiyomiyosit elde edebilecek olmanızdır. Genel olarak, bu yöntemi ilk kez kullanacak bilim insanları zorluk yaşayabilirler; çünkü bu prosedürü hassas bir şekilde uygulamak ve gerçekten iyi sonuçlar almak çok fazla pratik gerektirir. Ben, anestezikleri ve 250 IU heparin enjekte ettikten sonra, kaçış refleksini kontrol etmek için kuyruğu sıkarak farenin derin anestezi altında olduğundan emin olurum.Ardından, fareyi sırtüstü pozisyonda ameliyat masasına transfer edin. Daha sonra, xiphoid altındaki cilt ve karın duvarı üzerinde bir insizyon yapın. Clamshell torakotomi işlemini gerçekleştirmek için.Kesiyi kostal ark boyunca her iki yana doğru uzatın. Ardından, medial aksiller hatta kaburgaları kesin ve göğüs kafesini yukarı doğru kaldırın. Bundan sonra perikardiyumu açın ve büyük damarları bulun.Aortayı daha iyi görüntülemek için kodlanmış kalbe hafifçe bastırın. Ardından aortayı bir pens yardımıyla klempleyin. Kalbi dikkatlice yukarı kaldırın, ardından kalbin altına bir makas yerleştirin ve tüm bağlantılı damarları tek bir kesişle diseke edin.Lor kanülasyonu için asendan aortanın yeterince büyük bir kısmının korunduğundan emin olun. Ardından, eksize edilen kalbi derhal buz soğukluğundaki pre solüsyon ile doldurulmuş bir Petri kabına aktarın. Bu prosedürde, aortayı 1.8 French çelik kanül ile kanüle edin ve hava embolisinden kaçındığınızdan emin olun.Ardından, aortu cerrahi bir sütür ile kanüle sabitleyin. Bundan sonra, koronerleri bir mililitre solüsyon ile yıkayın. Kanülü, miyokarda uzun süreli iskemi reperfüzyon hasarını önlemek için bir Langendorff aparatına bağlayın.Torakotomi ile L endorf kanülasyonu arasındaki prosedürleri 120 saniye içinde tamamladığınızdan emin olun. Ardından, L endorf sisteminin ısıtma bobini kalsiyumsuz solüsyon ile önceden doldurulduktan sonra, kalbi bu solüsyonun 10 mililitresi ile dakikada dört mililitre hızında perfüze edin.Ardından, kalbi kollajenaz çözeltisi ile perfüze edin. Dört ml/dakika hızında sekiz dakika boyunca. Şimdi kalbi, düşük kalsiyum çözeltisi içeren önceden ısıtılmış 100 mm'lik bir Petri kabına aktarın. Dört.Aortik ve diğer kardiyak olmayan dokuları makasla dikkatlice temizleyin. Ardından atriyumları ve ventrikülleri ayırın; atriyal ve ventriküler dokuları az miktarda solüsyon içinde bekletin. Dört. Atriyal kardiyomiyositleri izole etmek için atriyumları, önceden ısıtılmış ayrı bir 100 milimetrelik kültür kabına aktarın.Dokuyu ince penslerle nazikçe çekerek ayırın ve dokunun neredeyse tamamen disosiye olduğundan emin olun. Ardından, hücreleri bir mililitre çözelti içinde süspande etmek için ucu genişletilmiş, ateşle cilalanmış plastik pipet ucu bulunan bir mililitrelik pipet kullanın. Atriyal hücreler için dört ve beş mililitre çözelti.Ventriküler hücreler için beş dakika boyunca dördüncü çözeltide bekletin. Ardından, hücreleri 200 mikron gözenek boyutundaki bir hücre filtresi kullanarak kalıntılardan ayırın. Hücreleri, atriyal hücreler için bir dakika, ventriküler hücreler için ise iki dakika boyunca, oda sıcaklığında ve hücre kültürü kabininde 16 ×g hızında dördüncü çözeltide santrifüjleyin; süpernatanı uzaklaştırın ve peleti beş mililitre çözelti içinde yeniden süspanse edin.Atriyal hücreler için beş ve yaklaşık 20 ila 25 mililitre. Ventriküler hücreler için, hücre peletini çözmek amacıyla tüpü hafifçe çalkalayın ve oda sıcaklığında 16 ×g'de bir dakika boyunca tekrar santrifüjleyin; ikinci santrifüjden sonra süpernatantı tekrar dökün ve peleti beş mililitre çözeltide yeniden süspanse edin. Atriyal hücreler için altı ve ventriküler hücreler için yaklaşık 20 ila 25 mililitre.Ardından hücrelerin 10 dakika boyunca çökelmesine izin verin. Bir hücre kültürü kabininde süpernatanı uzaklaştırın ve ardından hücreleri sayın. Elektrofizyoloji çalışmaları için hücrelere 25 ila 50 mililitre çözelti altı ekleyin.Miyositleri 50 mililitrelik bir tüp içerisinde çözüm altıda tutun ve çökmeyi önleyin. İmmünofloresan boyama için, final konsantrasyonu 50 µg/mL olacak şekilde laminin çözeltisi ile kaplanmış cam lameller içeren bir hücre kültürü kabı hazırlayın.Hücre kültürü kabını PBS içindeki laminin ile 37 °C'de iki saat boyunca inkübe edin. Ardından, laminin çözeltisini uzaklaştırın. Miyositleri mikroskop altında ekim yapmadan önce, hücreleri ekleyin ve hücre yoğunluğunu kontrol edin.Miyositlerin %2CO2 içeren 37 °C sıcaklıkta bir saat boyunca lamelle yapışmasını sağlayın. Bir saat sonra çözeltiyi uzaklaştırın ve vakit kaybetmeden standart boyama prosedürü protokolüne başlayın. Ardından miyositleri tespit edici ile inkübe edin.Örneğin, pH 7.5'de PBS içinde %4 PFA ile oda sıcaklığında 10 dakika bekletin. Ardından, hücreleri permeabilize etmek ve spesifik olmayan antikor bağlanmasını önlemek için beşer dakikalık üç PBS yıkama adımı uygulayın. Miyositleri, PBS içinde %10 serum, %0.3 Triton ve %0.2 BSA ile oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.Ardından, örnekleri bir saat boyunca 37 °C'de primer antikor ile inkübe edin ve daha önce açıklandığı gibi yıkayın. Sonrasında, çekirdekleri ve alfa aktinin'i karşı boyamak için oda sıcaklığında bir saat boyunca sekonder antikor ile inkübe edin. Sekonder antikoru, DPI ve florokrom konjuge phin ile oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin.Yıkama transferinden sonra, lam camı dikkatlice salin ile işlem görmüş mikroskop lamlarına kaydırılır. Ardından, tüm hücre yama kenetleme (patch clamp) kayıtları için hücreler floresan montaj ortamına gömülür. Sağlıklı görünen kardiyomiyositler, tanımlanmış bir hacimde hücre dışı banyo çözeltisi ile doldurulmuş perfüzyon haznesine aktarılır.Hücre içi solüsyonla doldurulduğunda üç ila beş mega ohm dirence sahip uygun patch clamp ekipmanı ve patch pipetleri kullanın. Standart patch clamp kayıtları için, bir hücre patch edildikten ve giga seal oluşturulduktan sonra, -60 millivolt'tan 50 millivolt'a 10 millivolt'luk artışlarla 4,5 saniyelik voltaj basamakları ile dışa yönlü potasyum akımlarını uyararak potasyum akımlarını ölçmek için standart bir protokol uygulayın. Sızıntı akımlarının her zaman 100 pico amp'ten küçük olduğundan emin olun.Farklı potasyum akımlarını ayırt etmek için four amino paridine, hetero potto, toin veya tetraethyl ammonium gibi spesifik inhibitörler kullanın. Stok çözeltiler hücre dışı banyo çözeltisinde hazırlanmalı ve bir mikro uç aracılığıyla hücrenin mümkün olan en yakın çevresine doğrudan uygulanmalıdır. Bazal kayıtlar tamamlandıktan sonra.İlaç uygulamasından sonra kayıtlar başlamadan önce iki ila üç dakikalık bir dengeleme süresi tanınmalıdır. Son aşamada, verileri P clamp 10.3 yazılımı veya benzeri bir yazılım kullanarak çevrimdışı olarak analiz edin. Bu şekil, DPI ve LOR 4 88 Phin ile boyanmış örnek bir ventriküler kardiyomiyositi göstermektedir. Burada ise tüm hücre patch clamp kaydının örnek izleri yer almaktadır.Bu şekil, DPI ve florokrom konjuge phin ile boyanmış örnek bir atriyal kardiyomiyosit göstermektedir. Burada ise tüm hücre yama kenetleme (whole cell patch clamp) kaydının örnek izleri yer almaktadır. Uzmanlaşıldığında, bu teknik uygun şekilde gerçekleştirilirse yaklaşık bir buçuk saat içinde tamamlanabilir. Bu videoyu izledikten sonra, genetik olarak modifiye edilmiş farelerin atriyal ve ventriküler kardiyomiyositlerinin nasıl izole edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

isolation-kv-channel-recordings-murine-atrial-ventricular

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu hücre içi Ca için kullanılabilecek insan atriyal miyosit izolasyonunu...

Ca aynı anda Ölçümler İnsan Atriyal miyositlerin izolasyonu<sup&gt; 2 +</sup&gt; Geçici ve Membran Akımlar

Burada bir perfüzyon Langendorff sistemi kullanılarak erişkin fare cardiomyoctyes izolasyonunu tarif eder. Elde edilen hücreler, + toleranslı elektriksel olarak hareketsiz Ca2 ve kültürlenmiş ve adeno-veya gen ekspresyonunu değiştirmek için lentivirüsler ile transfekte edilmiş olabilir. Bunların işlevi de MMSYS sistemi ve yama kelepçe teknikler kullanılarak analiz edilebilir.

İzolasyon, Kültür ve Yetişkin Fare Cardiomyoctyes Fonksiyonel Karakterizasyonu

Yabani tip ve mutant farelerden alınan bireysel kardiyomiyositler, kasılmalarını ve kalsiyum geçişlerini incelemek için kalpten izole edilebilir. Bu, hücresel disfonksiyonun herhangi bir nedenden dolayı kalp disfonksiyonuna katkısının karakterizasyonuna izin verir.

Fare kardiyomiyositlerde İzolasyon ve Fizyolojik Analizi

Kalp hastalıklarının hücre temelinde Mevcut bilgi çok hayvan modelleri üzerinde yapılan çalışmalara dayanmaktadır. Burada açıklamak ve insan ventrikülün küçük cerrahi örneklerinden tek bir canlı kardiyomiyositlerin elde etmek için yeni bir yöntem doğrulamak. İnsan ventriküler miyositler elektrofizyolojik çalışmalar ve uyuşturucu testi için kullanılabilir.

Taze Cerrahi Örneklerden İzolasyon ve İnsan Ventriküler kardiyomiyositlerin Fonksiyonel Karakterizasyonu

Burada, biz bir en iyi duruma getirilmiş, Langendorff tabanlı bir fare modeli Metabolik sendromu ile ilgili kalp yetmezliği ile korunmuş ejeksiyon fraksiyonu tek hücreli atriyal cardiomyocytes yalıtım için açıklayınız. El ile düzenleme intraluminal basınç kalp boşlukları, işlevsel olarak sağlam miyositler uyarma-kasılma-kaplin çalışmaları için uygun verim için uygulanır.

Bir fare modeli Metabolik sendromu ile ilgili kalp yetmezliği ile korunmuş ejeksiyon fraksiyonu atriyal Cardiomyocytes izolasyonu

Bu protokol, bir öbek sindirim yaklaşımı kullanarak yetişkin fare kalbi tek atriyal kardiyomiyositler izole etmek için kullanılır. Bu yaklaşım, yama kelepçe çalışmalarında atriyal miyosit elektrofizyolojisini karakterize etmek için kullanılabilecek sağ veya sol atriyal miyositleri izole etmek için kullanılır.

Yetişkin fareler atriyal Miyoksit izolasyonu

Sunulan vibratome kesilmiş miyokardiyal dilimlerden insan ve hayvan ventriküler kardiyomiyosit izolasyon için bir protokoldür. Kalsiyuma dayanıklı hücrelerin yüksek verimi (200 hücre/mg'a kadar) az miktarda dokudan (&lt;50 mg) elde edilebilir. Protokol soğuk iskemiye maruz kalan miyokardiyum için 36 saate kadar geçerlidir.

Vibratome-Cut Miyokardiyal Dilimlerden İnsan Ventriküler Kardiyomiyositlerin İzolasyon

Miyositlerin ve miyosit olmayanların tek bir yetişkin fare kalbinin hem atria hem de ventriküllerinden eşzamanlı izolasyonu için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu protokol, yüksek oranda uygulanabilir kardiyak miyositlerin ve miyosit olmayanların tutarlı verimini sağlar ve fenotipleme ve in vitro analiz için en uygun hücreye özgü kültür koşullarını detaylandırmaz.

Yetişkin Fare Kalbinden Atriyal Miyositler, Ventrikül Miyositleri ve Miyosit Olmayanların Eşzamanlı İzolasyonu ve Kültürü

Fare modelleri, aritmogenezin temel mekanizmalarının incelenmesine izin verir. Bu amaçla, yama-kelepçe ölçümleri yapmak için yüksek kaliteli kardiyomiyositler gereklidir. Burada, kalsiyum geçicilerinin ve L-tipi kalsiyum akımının eşzamanlı ölçümlerine izin veren retrograd enzim bazlı Langendorff perfüzyonu yoluyla murin atriyal ve ventriküler miyositleri izole etmek için bir yöntem tanımlanmıştır.

Ca2+ geçici ve L-tipi kalsiyum akımının eşzamanlı ölçümleri için yüksek kaliteli murin atriyal ve ventriküler miyositlerin izolasyonu

Bu protokol, yetişkin farelerden atriyal ve ventrikül miyositlerinin eşzamanlı izolasyonu için aort kanülasyonunun derinliğini de içeren Langendorff yönteminin modifikasyonlarını açıklar.

Yetişkin Farelerden Atriyal ve Ventrikül Miyositlerinin Eşzamanlı İzolasyonu için Langendorff Yönteminin Modifikasyonları

Öğrenin genetik olarak modifiye edilmiş farelerden atriyal ve ventriküler kardiyomiyosit izolasyonunu ve Kv kanal kayıtlarını. Bu yöntem, kardiyak aritmi mekanizmalarını anlamak için değerli bir araç sunar.

Mürin Atriyal ve Ventriküler kardiyomiyositlerde izolasyonu ve Kv Kanal Kayıtları

Daha fazla video keşfet