Merkez Sinir Sistemi Tek Hücreler Etiketleme

Bu prosedürün genel amacı, erken evre 17 drosophila embriyolarının merkezi sinir sistemindeki tek nöronları etiketlemektir. Bu, yumurtaları toplayarak ve doğru aşamaya gelmelerine izin vererek gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, yumurtaları manuel olarak klorlamak ve hizalamaktır.

Bu divayı takiben embriyoların kolonizasyonu ve törpülenmesi sinir kordonunu erişilebilir hale getirir. Son adım, lipofilik kalıp kalıbı gözünün İyono retik uygulaması ile tek hücreleri etiketlemektir. Sonuç olarak, sonuçlar, bilinen GFP ekspresyon paternleri bağlamında ve/veya mutant arka planda istenirse tek nöron morfolojisinin görselleştirilmesine izin verir.

Bu tekniğin markum gibi mevcut tek hücre etiketleme yöntemlerine göre en büyük avantajı, embriyoda çalışması ve tanımlanmış hücrelerin kasıtlı olarak görselleştirilmesine izin vermesidir. Bu yöntemin görsel gösterimi, birçok adımın hassas olması ve bu nedenle öğrenilmesi zor olması nedeniyle son derece yararlıdır. Sağlıklı sineklerin embriyoları agar plakalarına bırakmasına izin verin.

Plakayı her bir buçuk saatte bir 25 santigrat derecede değiştirin ve embriyoları saklayın. Embriyoları, gerekli gelişim aşamasına ulaşana kadar 25 veya 18 santigrat derecede plakalarında kuluçkaya yatırın. Hazır olduğunda, embriyoları çift taraflı yapışkan bantla kaplı bir slayta aktarın.

Embriyolarla herhangi bir agar transfer etmekten kaçının çünkü bu, bantlara yapışmalarını engelleyecektir. Kasetin üzerinde. Beklerken embriyoların beş ila 10 dakika kurumasını bekleyin.

24 milimetreye 60 milimetrelik bir kapak kızağını heptan yapıştırıcısı ile kaplayın. Sürgünün ortasına küçük bir damla yapıştırıcı yerleştirin ve 18 milimetre karelik bir kapak fişi kullanarak çok ince bir film halinde yayın. Embriyolar kuruduktan sonra, bir iğne ile hafifçe dokunun.

Koryon açılacak ve embriyo iğneye yapışacaktır. Klorsuz embriyoları kurumasını önlemek için hemen bir agar bloğuna aktarın. Onları orada arka arkaya 10 hizalayın, ventral tarafları yukarı bakacak şekilde.

Fazla agarı bloktan bir neşter ile kesin. Daha sonra heptan tutkal kaplı kapak fişi ile embriyolara hafifçe dokunun. Ventral tarafları aşağı bakacak şekilde kapak kızağına yapışmalıdırlar.

Kapak kaymasının etrafına bir çerçeve yapışkan bant uygulayın ve bir mikroskop lamına yapıştırın. Embriyoları kapak fişinin üstünde tutmak. Embriyoları, her embriyonun arka ucuna yakın dorsal tarafında bol miktarda PBS ile örtün.

Bir cam iğne ile vitel zarına nüfuz edin, zarı dorsal orta hat boyunca yırtın ve embriyoyu zardan dışarı sürükleyin. Şimdi embriyo ventral tarafını heptan yapıştırıcı substratı üzerinde başka bir yere yeniden yönlendirin. Vücut duvarını nazikçe delerek ve sırt orta hattı boyunca yırtarak embriyoyu bir cam iğne ile törpüleyin.

İğneyi kullanarak, slayta yapışması için vücut duvarını aşağı doğru itin. Bağırsağı ön ve arka uçlarından yırtın ve bağırsağı kaldırın. Aynı slaytta birkaç embriyo dosyalanacağından, oryantasyonları konusunda çok doğru olmak veya oryantasyonlarının bir çizimini yapmak faydalı olacaktır.

Daha sonra, embriyolar PBS'de% 7.4 formaldehit içinde 10 ila 15 dakika boyunca hafifçe sabitlenebilir, ardından PBS'de dört yıkama yapılır, embriyoların çözeltinin yüzeyine dokunmasını önlemek için çok dikkatli olun. Yüzey gerilimi kuvvetleri onları 10 x hedef altında yok edecektir. Hazırlanmış bir embriyo üzerindeki görüş alanını ortalayın, büyütmeyi artırın ve ilgilenilen hücreyi DIC optiği veya floresan altında bulun.

Hedef hücre GFP'yi ifade ediyorsa, mikroskobun alan diyaframının dar bir aydınlatmanın ötesine değil, görüş alanının hemen kenarına kadar açıldığından emin olun. Işın, mikro pipetin konumlandırılmasına, 10 x objektife geri dönmesine yardımcı olacak ve DC amplifikatörü için banyo elektrodunu embriyodan ve mikro pipetin yolundan uzaktaki çözeltiye yerleştirecektir. Lityum klorür çözeltisi ile doldurulmuş enjeksiyon mikro pipetini tutucuya monte edin ve mikro manipülatöre takın.

Kurs kontrollerini kullanarak mikropipeti objektifin altına ve embriyonun çok üzerine yerleştirin. Mikro peppe'nin açısı çok dikse, uç odak alanına girmeyecektir. Çok sığsa, şaft banyo duvarına çarpacak ve ucu görüş alanında ortalayacaktır.

Şimdi mikro pipeti indirin ve pipet PBS'ye girene ve embriyonun çok üzerinde olmayana kadar dönüşümlü olarak odaklanın. Şimdi yüksek güç hedefine geçin ve pipeti görüş alanı içinde ortalayın. Şaft odaktayken, mikro pipeti, ucu görüş alanının ortasına gelene kadar X ekseninde hareket ettirin.

Mikro pipet ucu embriyo seviyesinin çok üzerinde olmalıdır. Floresan aydınlatmaya geçin ve ucu inceleyin. Boya gözünde sızıntı olup olmadığını kontrol edin.

DC akımını, boya gözü kristali uçta birikmeyecek şekilde ayarlayın. Şimdi mikro pipeti Z ekseninde embriyoya doğru indirin. Embriyo odak noktasına geldikçe odağı aşamalı olarak ayarlamak.

İnce kontrolü kullanmaya geçin. Enjekte edilecek hücreyi alanın merkezine odaklayın ve ardından mikro pipet ucuna yeniden odaklanın. Bu noktadan sonra, embriyoyu mikro pipete göre hareket ettirmek için mikroskobun aşama kontrolünü kullanmak daha uygun olabilir.

Mikro pipet ucunu hücre ile temas ettirin ve yüzeyinde bir çöküntü yapın. Birkaç saniye boyunca birkaç nano amper depolarize edici akım geçirin. Hücrenin etiketlendiğini doğrulamak için hücre üzerinde küçük bir boya gözü kristali oluşacaktır.

Alanı floresan ışıkla aydınlatmak için deklanşörü kısa bir süre açın. Hücrenin gövdesi etiketleme belirtileri gösteriyorsa, birkaç saniye daha akım uygulayın. Ardından akımı kapatın ve aşama kontrollerini kullanarak embriyoyu mikro pipetten hızlı bir şekilde çekin.

D göz etiketlemesi belirgin değilse, mikro pipet tıkanmış olabilir ve değiştirilmesi gerekebilir. Pipetin ucu kökteki diğer dokuları hücreye dolaştırır ve bu dokuyu lekelerse, mikro pipeti hafifçe geri çekmeyi deneyin ve gerektiğinde mikro pipeti değiştirmeye başvurmadan önce hücreye yeniden yaklaşın. Aynı embriyodaki veya aynı slayttaki diğer embriyolardaki diğer hücreleri etiketlemeye devam edin.

Ucu görüş alanının kenarına getirin ve işlemi tekrarlayın. Enjeksiyon odasındaki çözeltinin çoğunu çıkarın. Daha sonra 10 dakika boyunca% 7.4 formaldehit PBS ekleyerek embriyoları sabitleyin, ardından PBS ile dört yıkama yapın.

Preparat artık belirtilen protokol kullanılarak konfokal mikroskopi için fotoğrafa dönüştürülebilir veya monte edilebilir. Dai dolgulu bir inter nöron, DIC optiği altında kusursuz bir şekilde foto dönüştürüldü. Etiketli hücrenin etiketlenmemiş çevre doku içindeki uzamsal bağlamı iyi bir şekilde çözüldü.

Örneğin, hücre gövdesinin korteks içindeki pozisyonları ve nöro hap içindeki lif projeksiyonunun her ikisi de bu hazırlıkta görülebilir. Boya damlası biraz fazla büyüktü. Birkaç komşu hücre aynı anda etiketlendi, bu da bireysel projeksiyonları farklı hücre gövdeleriyle ilişkilendirmeyi zorlaştırıyor.

Ayrıca, floresan mikroskobu altında, fotoğraf dönüştürme olmadan arka plan çözünürlüğünün çok daha düşük olduğuna dikkat edin. Bu preparatta komşu segmentlerdeki birden fazla hücre de enjekte edilebilir, bu da nöro haptaki hızlı iki fales lekesine karşı bir antikordur. Berrak hücre gövdelerine rağmen, preparasyon, uzun süreli foto dönüşüm sürelerinin olası bir yan etkisini göstermektedir.

Daha yoğun bir şekilde etiketlenmiş hücreler, tek bir hücreyi konfokal optiklerle etiketlemeye kıyasla aşırı lekelenme ve şişmeye başlama eğilimindedir. GFP raportör yapılarını taşıyan embriyolardaki boya gözü etiketlemesi, GFP pozitif nöronal veya glial hücre tiplerinin belirli popülasyonları içinde D dolgulu hücrenin mekansal bağlamını ve kimliğini sağlayabilir. Bu videoyu izledikten sonra, oph sonrası embriyonik CNS'deki tek nöronların etiketlemelerinin nasıl hazırlanacağını ve gerçekleştirileceğini iyi anlamış olmalısınız.

Ancak bu prosedürü denerken, lütfen her adımın zorlu olduğunu unutmayın, bu nedenle tüm prosedür sorunsuz bir şekilde çalışana kadar birkaç tekrar bekleyin.