Name: Merkez Sinir Sistemi Tek Hücreler Etiketleme Drosophila melanogaster (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-04T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: Öğrenin, Drosophila melanogaster embriyolarında merkez sinir sistemindeki tek nöronları lipofilik boya ile etiketleme yöntemini. Bu teknik, konfokal mikroskopi ile nöronal morfoloji analizini mümkün kılar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma DFG gelen GMT hibe tarafından desteklenen

<ol><li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118, 401-415 (1993).</li>
<li>Broadie, K., Sink, H., Van Vactor, D., Fambrough, D., Whitington, P. M., Bate, M., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+growth+cone+to+synapse%3A+the+life+history+of+the+RP3+motor+neuron%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Suppl%22%5BJournal%5D)">From growth cone to synapse: the life history of the RP3 motor neuron.</a> Dev. Suppl. , 227-238 (1993).</li>
<li>Campos-Ortega, J., Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCampos-Ortega%2C+J+%22The+Embryonic+Development+of+Drosophila+melanogaster%22">The Embryonic Development of Drosophila melanogaster</a>. , Springer. Berlin. (1985).</li>
<li>Featherstone, D. E., Chen, K., Broadie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harvesting+and+Preparing+Drosophila+Embryos+for+Electrophysiological+Recording+and+Other+Procedures%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Harvesting and Preparing Drosophila Embryos for Electrophysiological Recording and Other Procedures.</a> J. Vis. Exp. (27), e1347(2009).</li>
<li>Grenningloh, G., Rehm, E. J., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+growth+cone+guidance+in+Drosophila%3A+fasciclin+II+functions+as+a+neuronal+recognition+molecule%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of growth cone guidance in Drosophila: fasciclin II functions as a neuronal recognition molecule.</a> Cell. 67, 45-57 (1991).</li>
<li>Kunz, T., Kraft, K. F., Technau, G. M., Urbach, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+of+Drosophila+mushroom+body+neuroblasts+and+generation+of+divergent+embryonic+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Origin of Drosophila mushroom body neuroblasts and generation of divergent embryonic lineages.</a> Development. 139, 2510-2522 (2012).</li>
<li>Lanciego, J. L., Wouterlood, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+half+century+of+experimental+neuroanatomical+tracing%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chem.+Neuroanat%22%5BJournal%5D)">A half century of experimental neuroanatomical tracing.</a> J. Chem. Neuroanat. 42, 157-183 (2011).</li>
<li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+for+studies+of+gene+function+in+neuronal+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis.</a> Neuron. 22, 451-461 (1999).</li>
<li>Levick, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Another+tungsten+microelectrode%5BTitle%5D)+AND+%22Med.+Biol.+Eng%22%5BJournal%5D)">Another tungsten microelectrode.</a> Med. Biol. Eng. 10, 510-515 (1972).</li>
<li>Matthes, D. J., Sink, H., Kolodkin, A. L., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Semaphorin+II+can+function+as+a+selective+inhibitor+of+specific+synaptic+arborizations%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Semaphorin II can function as a selective inhibitor of specific synaptic arborizations.</a> Cell. 81, 631-639 (1995).</li>
<li>Murray, M. J., Whitington, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+roundabout+on+growth+cone+dynamics%2C+filopodial+length%2C+and+growth+cone+morphology+at+the+midline+and+throughout+the+neuropile%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Effects of roundabout on growth cone dynamics, filopodial length, and growth cone morphology at the midline and throughout the neuropile.</a> Journal of Neuroscience. 19, 7901-7912 (1999).</li>
<li>Murray, M. J., Merritt, D. J., Brand, A. H., Whitington, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+dynamics+of+axon+pathfinding+in+the+Drosophilia+CNS%3A+a+time-lapse+study+of+an+identified+motorneuron%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">In vivo dynamics of axon pathfinding in the Drosophilia CNS: a time-lapse study of an identified motorneuron.</a> J. Neurobiol. 37, 607-621 (1998).</li>
<li>Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neuronal+subsets+and+other+cell+types+in+whole-mount+Drosophila+embryos+and+larvae+using+antibody+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Imaging neuronal subsets and other cell types in whole-mount Drosophila embryos and larvae using antibody probes.</a> Methods Cell Biol. 44, 445-487 (1994).</li>
<li>Rickert, C., Kunz, T., Harris, K. -L., Whitington, P. M., Technau, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+characterization+of+the+entire+interneuron+population+reveals+principles+of+neuromere+organization+in+the+ventral+nerve+cord+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Morphological characterization of the entire interneuron population reveals principles of neuromere organization in the ventral nerve cord of Drosophila.</a> Journal of Neuroscience. 31, 15870-15883 (2011).</li>
<li>Thomas, J. B., Bastiani, M. J., Bate, M., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+grasshopper+to+Drosophila%3A+a+common+plan+for+neuronal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">From grasshopper to Drosophila: a common plan for neuronal development.</a> Nature. 310, 203-207 (1984).</li>
<li>Whitington, P., Harris, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+axonogenesis+in+the+embryo+of+a+primitive+insect%2C+the+silverfish+Ctenolepisma+longicaudata%5BTitle%5D)+AND+%22Development+Genes+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">Early axonogenesis in the embryo of a primitive insect, the silverfish Ctenolepisma longicaudata.</a> Development Genes and Evolution. 205 (5-6), 272-281 (1996).</li>
<li>Whitington, P., Meier, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Segmentation%2C+neurogenesis+and+formation+of+early+axonal+pathways+in+the+centipede%2C+Ethmostigmus+rubripes+%28Brandt%29%5BTitle%5D)+AND+%22Development+Genes+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">Segmentation, neurogenesis and formation of early axonal pathways in the centipede, Ethmostigmus rubripes (Brandt).</a> Development Genes and Evolution. 199, 349-363 (1991).</li>
<li>Whitington, P. M., Seifert, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axon+growth+from+limb+motorneurons+in+the+locust+embryo%3A+the+effect+of+target+limb+removal+on+the+pattern+of+axon+branching+in+the+periphery%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Axon growth from limb motorneurons in the locust embryo: the effect of target limb removal on the pattern of axon branching in the periphery.</a> Developmental Biology. 106, 438-449 (1984).</li>
<li>Whitington, P. M., Leach, D., Sandeman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+change+in+neural+development+within+the+arthropods%3A+axonogenesis+in+the+embryos+of+two+crustaceans%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Evolutionary change in neural development within the arthropods: axonogenesis in the embryos of two crustaceans.</a> Development. 118, 449-461 (1993).</li>
<li>Williams, D. W., Tyrer, M., Shepherd, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tau+and+tau+reporters+disrupt+central+projections+of+sensory+neurons+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Tau and tau reporters disrupt central projections of sensory neurons in Drosophila.</a> J. Comp. Neurol. 428, 630-640 (2000).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.

Bir model sistem olarak Drosophila&#39;da bir büyük avantajı, tek hücreler seviyesinde gelişme ve işlev analizi olanak sağlamasıdır. Bu hücre türleri çeşitliliği son derece yüksek olduğunu ve komşu hücrelerin fonksiyon ve morfolojisi tamamen farklı olabilir sinir sistemi, ilgili özellikle yararlıdır. Burada mevcut yöntem ya da kalıcı bir leke veya floresan mikroskobu ile doğrudan muayene dönüştürülmüştür edilebilir bir boya ile bireysel nöronların etiketleme sağlar. Bu çok detaylı n...

Bireysel hücrelerin düzeyde nöronal morfolojinin Bilgi nöronal bağlantı ve MSS fonksiyonu anlamak için önemli bir önkoşuldur. Böylece, nörobilim ilk günlerinden itibaren, araştırmacılar tek bir hücre etiketleme teknikleri (bu konuda tarihsel bir tedavi için 7) geliştirmeye çalışmışlardır. Böyle Golgi boyama gibi klasik yöntemler nöronal morfolojinin mükemmel çözünürlük sağlayan ama bir boyama rastgele bir şekilde oluşur gibi, yönlendirilmiş bir şekilde nöron belli bir tip etikete istiyorsa uygun değildir. Bir mikroelektrot boyaların ya da hücre içi juxtacellular enjeksiyon ile tek bir hücre boyama için yöntemlerin geliştirilmesi spesifik etiketleme ihtiyacı ele. Drosophila tek nöron boya enjeksiyon uygulaması nedeniyle organizma ve nöronlar hem küçük boyutu, büyük bir meydan okumaydı. Embriyonik Drosophila Bununla birlikte, tek bir nöron boyama </em&gt; Nöronlar Corey Goodman 15 laboratuarda 1980&#39;lerin sağlandı. Yöntemi son derece yararlı olmuştur ve son 20-30 yıl içinde (örneğin 2, 10) üzerinde Drosophila nöronal gelişim için mekanizmalar içine bazı temel anlayışlar sağladı da, birçok işçi büyük ölçüde nedeniyle teknik talepleri, bu uzak shied var. Drosophila nöronal etiketleme için genetik tekniklerin daha son yıllarda durumu da nöronun boya enjeksiyon şöhreti katkıda bulunmuştur. Membran hedefli GFP yapıları gal4 yönettiği ifade nöral morfolojisi 1, 20 mükemmel çözünürlük sağlayabilir. Ancak bu yöntem bazı sınırlamaları vardır: Birden hücrelerinde GFP sık kaçınılmaz ifadesi bireysel nöronların yapısı belirsiz olabilir ve bir gal4 sürücü line ilgi belirli bir nöron ifade sürücü mevcut olmayabilir. MARCM (Bir Tecrübe ile Mozaik Analiziressible Hücre Marker) yöntemi 8 tek hücre düzeyinde aslında herhangi nöronun etiketleme, ancak başarıyla çünkü GAL80 proteinin yavaş ciro embriyo ve erken larva olarak kullanılamaz sağlayabilir. Genetik etiketleme bu sınırlamalar göz önüne alındığında, biz Drosophila embriyo o nöronun boya enjeksiyonu çok değerli bir yöntemdir kalır ve geniş uygulama hak inanıyorum. Bu hedefi desteklemek için, biz burada yöntemin ayrıntılı bir açıklamasını sağlar. Gücünü bir illüstrasyon geç Drosophila embriyo 14 abdominal neuromeres içinde internöron komple set morfolojisi bizim son hesabı tarafından sağlanmaktadır. Bireysel nöronal hücre tiplerinin morfolojik değişkenlik ve embriyonun MSS neuromere organizasyon ilkeleri hem ortaya bu çalışma, herhangi bir diğer mevcut etiketleme yöntemi ile mümkün olmazdı.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif / Malzeme Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog Numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> REAKTİFLER </td></tr><tr><td> DAB </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d5905" target="_blank">D-5905</a> </td><td> 100 mM Tris-HCl, pH 7.4 içinde 2-3 mg / ml &#39; </td></tr><tr><td> DII </td><td> Invitrogen / Moleküler Sondalar </td><td> <a href="http://products.invitrogen.com/ivgn/product/D282" target="_blank">D-282</a> </td><td> Etanol içinde 1 mg / ml </td></tr><tr><td> <a href="http://www.merckmillipore.com/germany/chemicals/formaldehydloesung-min-37-prozent/MDA_CHEM-104002/p_Wt6b.s1L6pAAAAEWpOEfVhTl" target="_blank">Formaldehit</a> </td><td> Merck Millipore </td><td></td><td> PBS içinde% 7,4 </td> &lt;/ Tr&gt; <tr><td> Gliserin </td><td> <a href="http://www.carlroth.com/catalogue/" target="_blank">Roth</a> </td><td> 3783 </td><td> PBS içinde% 70 </td></tr><tr><td> Heptan Tutkal </td><td> Beiersdorf AG </td><td> Çello 31-39-30 * </td><td> ca sulandırmak. N-Heptan ile 1-1 </td></tr><tr><td> PBS </td><td></td><td></td><td> 1x </td></tr><tr><td> TRIS </td><td> <a href="http://www.carlroth.com/catalogue/" target="_blank">Roth</a> </td><td> 4855 </td><td></td></tr><tr><td> Vectashield </td><td> Vektör Laboratuvarları </td><td> <a href="http://www.vectorlabs.com/catalog.aspx?prodID=427" target="_blank">H1000</a> </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> EKİPMAN </td></tr><tr><td> Konfokal Mikroskop </td><td> Leica </td><td> TCS SP2 </td><td> floresans labelings görüntülemek ve belgelemek için </td></tr><tr><td> DC - Birmplifier </td><td> Dragan Şirketi </td><td> Cornerstone ION-100 </td><td> labelings gerçekleştirmek </td></tr><tr><td> Lameller </td><td> <a href="http://www.menzel.de/" target="_blank">Menzel</a> </td><td> BB018018A1 </td><td> 18 x 18 mm </td></tr><tr><td> Lameller </td><td> <a href="http://www.menzel.de/" target="_blank">Menzel</a> </td><td> BB024060A1 </td><td> 24 x 60 mm </td></tr><tr><td> Mikroskop Diseksiyon </td><td> Leica </td><td> MZ8 </td><td> embriyolar hazırlamak ve Disect için </td></tr><tr><td> Düz Kapilerde </td><td> <a href="http://www.hilgenberg-gmbh.de/" target="_blank">Hilgenberg</a> </td><td></td><td> dış çapı 1 mm; cam kalınlığı 0,1 mm </td></tr><tr><td> Enjeksiyon Kapilerde </td><td> Science Products </td><td> TR 100 TF 8P </td><td></td></tr><tr><td> Mikromanipülatör R </td><td> Leica </td><td></td><td> labelings gerçekleştirmek </td></tr><tr><td> Model P-97 </td><td> Sutter Aletleri </td><td></td><td> kılcal çekme </td></tr><tr><td> Nesne Slaytlar </td><td> <a href="http://www.marienfeld-superior.com/" target="_blank">Marienfeld Superior</a> </td><td> 1000000 </td><td></td></tr><tr><td> Bilimsel Mikroskop </td><td> Zeiss </td><td> Axioskop 2 mot </td><td> photoconversion sonra labelings görüntülemek için </td></tr><tr><td> Bilimsel Mikroskop </td><td> Olimpos </td><td> BX50 </td><td> labelings gerçekleştirmek </td></tr><tr><td> Sony MC3255 Video Kamera </td><td> Sony / AVT Horn </td><td> Sony MC3255 </td><td> photoconversion sonra labelings kayıt </td></tr></tbody></table> Tablo 1.

merkez sinir sistemi tek hücreler etiketleme<em&gt; drosophila melanogaster</em

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

Bu yazıda tek lipofilik floresan membran işaretleyici DII arasında juxtacellular enjeksiyonu ile Drosophila melanogaster embriyonik MSS nöronları etiketlemek nasıl açıklar. Bu yöntem çok detaylı nöronal hücre morfolojisi görselleştirme sağlar. Bu CNS herhangi bir hücreyi etiketlemek mümkündür: Hedef nöronların hücre gövdeleri DIC optik altında veya GFP gibi bir floresan genetik marker ekspresyonu ile görüntülenmiştir. Etiketleme sonra, Dii iletilen ışık ve DIC optik ile hücre morfolojisi görselleştirme izin photoconversion tarafından kalıcı kahverengi leke dönüşebilir. Alternatif olarak, DII-işaretli hücrelerin genetik olarak ortaya flüoresan raportör proteinlerin colocalised alınabilecek şekilde, konfokal mikroskopi ile doğrudan izlenebilir. Bu teknik, mümkün tek bir hücre çözünürlükte mutant fenotipleri analiz etmek için yapım genotip bağımsız olarak, herhangi bir hayvan da kullanılabilir.

Şekil 4, bu teknik tipik sonuçları göstermektedir, burada açıklandığı. Şekil 4A temiz bir şekilde photoconverted bir uçucu, dolu tek interneuron bir örneğini göstermektedir. Bu güzel ayrıntı miktarını bu hazırlıkların teklif göstermektedir. Non-etiketli çevreleyen doku içinde etiketli hücre mekansal bağlamda görünür hale DIC optik altında bakıldığında, korteksinde ve neuropile içinde lif projeksiyon hücre gövdesinin konumunu, örn. Şekil 4B</...

Biz, merkezi sinir sistemi içinde tek nöron etiketlenmesine yönelik bir yöntem (CNS) sunmak<em&gt; Drosophila</em&gt; Geçen ışık veya konfokal mikroskopi ya tarafından nöronal morfoloji analizi sağlar embriyolar,.

Merkez Sinir Sistemi Tek Hücreler Etiketleme<em&gt; Drosophila melanogaster</em

In this  article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the ...

Bu prosedürün genel amacı, erken evre 17 drosophila embriyolarının merkezi sinir sistemindeki tek nöronları etiketlemektir. Bu, yumurtaları toplayarak ve doğru aşamaya gelmelerine izin vererek gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, yumurtaları manuel olarak klorlamak ve hizalamaktır.Bu divayı takiben embriyoların kolonizasyonu ve törpülenmesi sinir kordonunu erişilebilir hale getirir. Son adım, lipofilik kalıp kalıbı gözünün İyono retik uygulaması ile tek hücreleri etiketlemektir. Sonuç olarak, sonuçlar, bilinen GFP ekspresyon paternleri bağlamında ve/veya mutant arka planda istenirse tek nöron morfolojisinin görselleştirilmesine izin verir.Bu tekniğin markum gibi mevcut tek hücre etiketleme yöntemlerine göre en büyük avantajı, embriyoda çalışması ve tanımlanmış hücrelerin kasıtlı olarak görselleştirilmesine izin vermesidir. Bu yöntemin görsel gösterimi, birçok adımın hassas olması ve bu nedenle öğrenilmesi zor olması nedeniyle son derece yararlıdır. Sağlıklı sineklerin embriyoları agar plakalarına bırakmasına izin verin.Plakayı her bir buçuk saatte bir 25 santigrat derecede değiştirin ve embriyoları saklayın. Embriyoları, gerekli gelişim aşamasına ulaşana kadar 25 veya 18 santigrat derecede plakalarında kuluçkaya yatırın. Hazır olduğunda, embriyoları çift taraflı yapışkan bantla kaplı bir slayta aktarın.Embriyolarla herhangi bir agar transfer etmekten kaçının çünkü bu, bantlara yapışmalarını engelleyecektir. Kasetin üzerinde. Beklerken embriyoların beş ila 10 dakika kurumasını bekleyin.24 milimetreye 60 milimetrelik bir kapak kızağını heptan yapıştırıcısı ile kaplayın. Sürgünün ortasına küçük bir damla yapıştırıcı yerleştirin ve 18 milimetre karelik bir kapak fişi kullanarak çok ince bir film halinde yayın. Embriyolar kuruduktan sonra, bir iğne ile hafifçe dokunun.Koryon açılacak ve embriyo iğneye yapışacaktır. Klorsuz embriyoları kurumasını önlemek için hemen bir agar bloğuna aktarın. Onları orada arka arkaya 10 hizalayın, ventral tarafları yukarı bakacak şekilde.Fazla agarı bloktan bir neşter ile kesin. Daha sonra heptan tutkal kaplı kapak fişi ile embriyolara hafifçe dokunun. Ventral tarafları aşağı bakacak şekilde kapak kızağına yapışmalıdırlar.Kapak kaymasının etrafına bir çerçeve yapışkan bant uygulayın ve bir mikroskop lamına yapıştırın. Embriyoları kapak fişinin üstünde tutmak. Embriyoları, her embriyonun arka ucuna yakın dorsal tarafında bol miktarda PBS ile örtün.Bir cam iğne ile vitel zarına nüfuz edin, zarı dorsal orta hat boyunca yırtın ve embriyoyu zardan dışarı sürükleyin. Şimdi embriyo ventral tarafını heptan yapıştırıcı substratı üzerinde başka bir yere yeniden yönlendirin. Vücut duvarını nazikçe delerek ve sırt orta hattı boyunca yırtarak embriyoyu bir cam iğne ile törpüleyin.İğneyi kullanarak, slayta yapışması için vücut duvarını aşağı doğru itin. Bağırsağı ön ve arka uçlarından yırtın ve bağırsağı kaldırın. Aynı slaytta birkaç embriyo dosyalanacağından, oryantasyonları konusunda çok doğru olmak veya oryantasyonlarının bir çizimini yapmak faydalı olacaktır.Daha sonra, embriyolar PBS'de% 7.4 formaldehit içinde 10 ila 15 dakika boyunca hafifçe sabitlenebilir, ardından PBS'de dört yıkama yapılır, embriyoların çözeltinin yüzeyine dokunmasını önlemek için çok dikkatli olun. Yüzey gerilimi kuvvetleri onları 10 x hedef altında yok edecektir. Hazırlanmış bir embriyo üzerindeki görüş alanını ortalayın, büyütmeyi artırın ve ilgilenilen hücreyi DIC optiği veya floresan altında bulun.Hedef hücre GFP'yi ifade ediyorsa, mikroskobun alan diyaframının dar bir aydınlatmanın ötesine değil, görüş alanının hemen kenarına kadar açıldığından emin olun. Işın, mikro pipetin konumlandırılmasına, 10 x objektife geri dönmesine yardımcı olacak ve DC amplifikatörü için banyo elektrodunu embriyodan ve mikro pipetin yolundan uzaktaki çözeltiye yerleştirecektir. Lityum klorür çözeltisi ile doldurulmuş enjeksiyon mikro pipetini tutucuya monte edin ve mikro manipülatöre takın.Kurs kontrollerini kullanarak mikropipeti objektifin altına ve embriyonun çok üzerine yerleştirin. Mikro peppe'nin açısı çok dikse, uç odak alanına girmeyecektir. Çok sığsa, şaft banyo duvarına çarpacak ve ucu görüş alanında ortalayacaktır.Şimdi mikro pipeti indirin ve pipet PBS'ye girene ve embriyonun çok üzerinde olmayana kadar dönüşümlü olarak odaklanın. Şimdi yüksek güç hedefine geçin ve pipeti görüş alanı içinde ortalayın. Şaft odaktayken, mikro pipeti, ucu görüş alanının ortasına gelene kadar X ekseninde hareket ettirin.Mikro pipet ucu embriyo seviyesinin çok üzerinde olmalıdır. Floresan aydınlatmaya geçin ve ucu inceleyin. Boya gözünde sızıntı olup olmadığını kontrol edin.DC akımını, boya gözü kristali uçta birikmeyecek şekilde ayarlayın. Şimdi mikro pipeti Z ekseninde embriyoya doğru indirin. Embriyo odak noktasına geldikçe odağı aşamalı olarak ayarlamak.İnce kontrolü kullanmaya geçin. Enjekte edilecek hücreyi alanın merkezine odaklayın ve ardından mikro pipet ucuna yeniden odaklanın. Bu noktadan sonra, embriyoyu mikro pipete göre hareket ettirmek için mikroskobun aşama kontrolünü kullanmak daha uygun olabilir.Mikro pipet ucunu hücre ile temas ettirin ve yüzeyinde bir çöküntü yapın. Birkaç saniye boyunca birkaç nano amper depolarize edici akım geçirin. Hücrenin etiketlendiğini doğrulamak için hücre üzerinde küçük bir boya gözü kristali oluşacaktır.Alanı floresan ışıkla aydınlatmak için deklanşörü kısa bir süre açın. Hücrenin gövdesi etiketleme belirtileri gösteriyorsa, birkaç saniye daha akım uygulayın. Ardından akımı kapatın ve aşama kontrollerini kullanarak embriyoyu mikro pipetten hızlı bir şekilde çekin.D göz etiketlemesi belirgin değilse, mikro pipet tıkanmış olabilir ve değiştirilmesi gerekebilir. Pipetin ucu kökteki diğer dokuları hücreye dolaştırır ve bu dokuyu lekelerse, mikro pipeti hafifçe geri çekmeyi deneyin ve gerektiğinde mikro pipeti değiştirmeye başvurmadan önce hücreye yeniden yaklaşın. Aynı embriyodaki veya aynı slayttaki diğer embriyolardaki diğer hücreleri etiketlemeye devam edin.Ucu görüş alanının kenarına getirin ve işlemi tekrarlayın. Enjeksiyon odasındaki çözeltinin çoğunu çıkarın. Daha sonra 10 dakika boyunca% 7.4 formaldehit PBS ekleyerek embriyoları sabitleyin, ardından PBS ile dört yıkama yapın.Preparat artık belirtilen protokol kullanılarak konfokal mikroskopi için fotoğrafa dönüştürülebilir veya monte edilebilir. Dai dolgulu bir inter nöron, DIC optiği altında kusursuz bir şekilde foto dönüştürüldü. Etiketli hücrenin etiketlenmemiş çevre doku içindeki uzamsal bağlamı iyi bir şekilde çözüldü.Örneğin, hücre gövdesinin korteks içindeki pozisyonları ve nöro hap içindeki lif projeksiyonunun her ikisi de bu hazırlıkta görülebilir. Boya damlası biraz fazla büyüktü. Birkaç komşu hücre aynı anda etiketlendi, bu da bireysel projeksiyonları farklı hücre gövdeleriyle ilişkilendirmeyi zorlaştırıyor.Ayrıca, floresan mikroskobu altında, fotoğraf dönüştürme olmadan arka plan çözünürlüğünün çok daha düşük olduğuna dikkat edin. Bu preparatta komşu segmentlerdeki birden fazla hücre de enjekte edilebilir, bu da nöro haptaki hızlı iki fales lekesine karşı bir antikordur. Berrak hücre gövdelerine rağmen, preparasyon, uzun süreli foto dönüşüm sürelerinin olası bir yan etkisini göstermektedir.Daha yoğun bir şekilde etiketlenmiş hücreler, tek bir hücreyi konfokal optiklerle etiketlemeye kıyasla aşırı lekelenme ve şişmeye başlama eğilimindedir. GFP raportör yapılarını taşıyan embriyolardaki boya gözü etiketlemesi, GFP pozitif nöronal veya glial hücre tiplerinin belirli popülasyonları içinde D dolgulu hücrenin mekansal bağlamını ve kimliğini sağlayabilir. Bu videoyu izledikten sonra, oph sonrası embriyonik CNS'deki tek nöronların etiketlemelerinin nasıl hazırlanacağını ve gerçekleştirileceğini iyi anlamış olmalısınız.Ancak bu prosedürü denerken, lütfen her adımın zorlu olduğunu unutmayın, bu nedenle tüm prosedür sorunsuz bir şekilde çalışana kadar birkaç tekrar bekleyin.

labeling-single-cells-central-nervous-system-drosophila

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bu yazıda, merkezi sinir sistemi incelemek için nasıl üçüncü instar Drosophila larvaları göstermektedir.

Drosophila melanogaster Larvaların MSS diseksiyonu

Biz sahnelenen hazırlamak için prosedürü...

Tüm montaj Embriyonik Sinir Sistemi Görselleştirme Drosophila Embriyolar

Nöron dendritler gibi karmaşık hücre şekilleri, geliştirme sırasında nasıl elde edilir anlamak için, bu, doğru tahlil mikrotübül organizasyonu edebilmek için önemlidir. Burada dendritik arborization duyusal nöron dendritler mikrotübül organizasyonu, trakea, kas incelemek için sağlam bir immünohistolojik bir etiketleme yöntemi açıklamak ve...

Immünohistolojik Duyusal Nöron Dendritler Mikrotübüller Etiketleme, trakea ve kaslar Drosophila Larva Vücut Duvar

Bu video, glial hücrelerin tek hücreli görüntülenmesi için transgenik bir Drosophila beyninin immünofloresan boyamasını göstermektedir. Beyin, glial spesifik bir rekombinaz sisteminin kontrolü altında farklı antijenik epitop kombinasyonları ile kaynaşmış zar hedefli proteinleri eksprese eder. İzole ve sabit beyinler, antijenik epitoplara özgü primer antikorlarla boyanır, ardından florofor konjuge sekonder antikorlar gelir. Bu etiketleme, çeşitli beyin bölgelerinde farklı glial hücre alt...

Glial Hücrelerin Tek Hücreli Görüntülenmesi için Drosophila Beyinlerinin İmmünofloresan Boyaması

Kaynak: İnal, M. A. et. al., Lipofilik Floresan Boyalar Kullanılarak Drosophila Embriyonik Motor Nöronlarının Retrograd İzlemesi. J. Vis. Uzm.  (2020)Bu video, lipofilik boyalar kullanılarak Drosophila motor nöronlarının geriye dönük etiketleme yöntemini göstermektedir. Boya aksona girer, geriye doğru hareket eder ve nöronları yeşil olarak etiketleyerek morfolojilerinin ve projeksiyonlarının konfokal bir mikroskop altında ayrıntılı olarak görselleştirilmesini sağlar.

Floresan lipofilik boyalar kullanılarak Drosophila motor nöronlarının retrograd etiketlenmesi

Bu protokol, dokunulmamış larva beyin bağlamında canlı hücre görüntüleme yapmak için kullanılan akıcı bir yöntem göstermektedir. Canlı hücre görüntüleme yaklaşımları sürekli daha önce gözardı mekanizmaları ortaya çıkarılması, asimetrik nöral kök hücre bölünmeleri çalışmanın yanı sıra diğer nörolojik ve gelişimsel süreçleri için paha biçilmezdir.

Canlı Görüntüleme<em&gt; Drosophila</em&gt; Larva nöroblastomun

Bu iletişim kuralı diseksiyon ve yetişkin Drosophila melanogaster immunostaining açıklar beyin dokuları. Özellikle, bu iletişim kuralı doğru nöronal gelişim birçok yönlerini temel genel prensipler ortaya çıkarmak için kullanılabilecek örnek nöronal alt kümeleri olarak Drosophila mantar beden ve photoreceptor nöronlar kullanımı vurgulamaktadır.

Diseksiyon ve mantar vücut immünfloresan boyama ve yetişkin Drosophila melanogaster beynindeki nöronlar Photoreceptor

Hücre türleri farklı morfoloji görüntülemek ve a değişiklik-in onların komşuları ile etkileşim kurmak. Bu iletişim kuralı tek hücre morfolojisi açıklamaya ve hücre-hücre etkileşim köklü Gal4/UAS ifade sistemi kullanılarak incelemek için açıklar.

Yüksek çözünürlüklü tek hücre türleri morfoloji ve Glia Drosophila içinde etkileşimlerin hücre çalışmaya uygulama çok renkli FlpOut tekniği

Bu iletişim kuralı maliyet-etkin ve uygun farmakolojik ajanları, sinirsel proteinlerin genetik mutasyonlar test etkinleştirmek için Drosophila melanogaster merkezi sinir sistemi azalan elektriksel aktivitesinin kaydetmek için bir yöntem açıklar, ve/veya keşfedilmemiş fizyolojik yolları rolü.

Üçüncü-biçim Drosophila Melanogaster merkezi sinir sisteminin etkinliğinin elektrofizyolojik kayıt

5-etil-2'-deoksiyridin (EdU) ve fosfo-histon H3 (pH3) etiketlemeli hücre döngüsü analizi, kapsamlı optimizasyon gerektirebilecek çok adımlı bir prosedürdür. Burada, farklı hücre döngüsü aşamalarındaki hücreleri ayırt etmek için görüntü analizi ve niceleme dahil olmak üzere bu prosedür için tüm adımları açıklayan ayrıntılı bir protokol sunuyoruz.

5-Etil-2'-Deoksiroridin/Fosfo-Histon H3 Drosophila Nöral Kök Hücrelerde Hücre Döngüsü İlerleme Analizi için Çift Etiketleme Protokolü

Bu makale, reaktiflerle ekonomik olan ve az sayıda hayali disklerin işlenmesini kolaylaştıran verimli bir imaginal disk diseksiyon ve antikor boyama protokolünü tanımlar.

Drosophila melanogaster'den Göz-Antenli ve Kanat Hayali Disklerinin Küçük Ölçekli Diseksiyonu ve Antikor Boyama

Öğrenin, Drosophila melanogaster embriyolarında merkez sinir sistemindeki tek nöronları lipofilik boya ile etiketleme yöntemini. Bu teknik, konfokal mikroskopi ile nöronal morfoloji analizini mümkün kılar.

Merkez Sinir Sistemi Tek Hücreler Etiketleme

Daha fazla video keşfet