Name: Apoptotik hücresi Temizliği görüntülenmesi sırasında Canlı Drosophila Embriyo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: Keşfedin canlı görüntüleme yöntemiyle Drosophila embriyolarında apoptotik hücre temizliği dinamiklerini. Konfokal mikroskopi ve spesifik belirteçlerle fagositoz süreçlerini gerçek zamanlı izleyin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Marie Curie (IRG249084) tarafından desteklenmiştir. Biz Kurant laboratuar tüm üyeleri teşekkür ederiz.

Fagositik hücreler ve apoptotik hücre: hücre iki nüfus etiketlenmelidir in vivo apoptotik hücre boşluk dinamiklerini takip etmek. Makrofajlar, glia ve ektoderm 8: biz simu-cytGFP embriyo sadece fagositik hücreleri etiketler işaretleyici içeren bir Drosophila satırını kullanın fagositik hücre popülasyonlarının işaretlemek için. Biri hemocyte özel Gal4 sürücü (CRQ-Gal4) içeren satırları veya glia özel Gal4 sürücü (repo-Gal4) ve UAS kontrol (UAS-GFP) altında genetik olarak kodlanmış floresan muhabiri de dahil olmak üzere fagositik hücreler, farklı işaretleri kullanabilirsiniz. Apoptotik hücre temizleme sırasında apoptotik hücreleri izlemek için farklı apoptoz / fagositoz işaretleri kullanın. Annexin V (Molecular Probes) 10 apoptotik hücreler için erken bir göstergesi olarak hizmet eder; Phiphilux (OncoImmunin) daha sonra apo olarak kullanılan florojenik substrat, kaspaz-3, olduğusis işaretleyici ve Lysotracker (Molecular Probes) bir phagosome göstergesi olarak çalışır. Biz mikroenjeksiyon sistemi picopump PV 820 kullanarak bu reaktifler enjekte. 1. Hazırlanmak <ol><li> Heptan tutkal: Çift taraflı bant göz önüne sermek ve bir sintilasyon flakon, 24 saat Parafilm ile flakon ve kaya mühür, heptan ile doldurabilirsiniz kadar koydu. Tutkal çok kalın ise heptan ekleyin. </li><li> Biz sinekler önceden ısıtılmış üzüm suyu agar plaka + maya 2 saat yapıştırmak bırakmaya izin ve sonra 25 plaka aktarmak ° C 10-12 saat (istenilen evresine bağlıdır) için önce mikroenjeksiyon ve zaman atlamalı kayıtları enjekte edilen embriyoların. Böylece sahne 15 veya gelişme 16 embriyo sağlayan, 25 ° C &#39;de muhafaza agar plakaları embriyolar toplamak. </li><li> İğne hazırlanması: Enjeksiyon için iğne hazırlamak için, bir &#39;Sutter aracı&#39; iğne çektirmesi ve ince duvarlı cam filamentler (FHC Kılcal boru) kullanın. Toplanmış kılcal ucu kırdı0.5-2 mikron arasında bir çapa n. </li><li> Yapıştırıcı ile lamel: Bir pipet kullanarak lamel ortasında bir satırda heptan tutkal bir damla dağıtmak. Birkaç saniye kurumasını bekleyin. Bu lamelleri birkaç hazırlayın. </li></ol> 2. Embriyo Hazırlık <ol><li> Agar embriyolar toplayın ve temiz bir boya fırçası ve su kullanarak bir hücre süzgeç (SPL Yaşam Bilimleri) aktarabilirsiniz. Süzgeç atık su toplamak için bir beher üzerinde tutulur. </li><li> Tüm maya hamur kaldırılır gelene kadar su kullanılarak hücre süzgecinden embriyolar yıkayın. </li><li> Kimwipes kullanarak süzgeç dış silerek aşırı su kurur. </li><li> Temiz bir Petri kabındaki hücre süzgeç yerleştirin ve hücre süzgecinden içinde embriyo karşılamak için yeterli% 50 çamaşır suyu ekleyin. Bazen 2 dakika (2-3 kez) karıştırarak için embriyo Dechorionate. </li><li> Embriyolar çamaşır suyu kokusu gevşek kadar yoğun su ile durulayın. </li><li> , Temiz bir hücre süzgecinden yerleştirinPetri kadar kurumasını önlemek için su ile embriyo çanak ve kapsamaktadır. </li><li> Embriyo ayar başlamadan önce, iki iğne (bazen bir iğne tıkanmış olabilir) içine istenen reaktif 1 ul yükleyin. Bu iğne ucu ulaşmak için sıvı için yaklaşık 5 dakika sürer. </li><li> Üzüm suyu agar dikdörtgen bir parça kesin ve bir mikroskop lamı üzerine yerleştirin. Petri kabı temiz bir boya fırçası kullanarak agar parça dechorionated embriyolar transfer. </li><li> Bir floresan diseksiyon mikroskop altında düzgün seçin ıslak bir boya fırçası kullanarak GFP işaretleyici ifade embriyo sahnelenen ve yakın başka bir (Şekil 1A) sonra arka arkaya birinde agar parçasının kenarına her embriyo yerleştirin. Embriyolar Santral Sinir Sistemi (SSS) glia tarafından görüntüleme fagositozu için kendi ventral yüzü ile yerleştirilmelidir. </li><li> Bir satır yaklaşık 10 embriyo ayarlayın. </li><li> Heptan bir tutkal şeridi (Şekil 1B, C orta kaplanmış bir lamel embriyolar takın </strong&gt;). </li><li> Yaklaşık 5 dakika (bu odanın nem ve enjekte edilecek miktarına bağlıdır) için dehidrasyon odasına lamel yerleştirin. </li><li> Kuruyor sonra daha dehidratasyonu önlemek için halokarbon petrol 700 (Sigma) ile embriyoların kapsamaktadır. </li><li> Yukarı bakacak şekilde embriyolar ile bir mikroskop lamı üzerine lamel yerleştirin. Bu lamel hareket önlemek için slayt üzerinde bir damla su koymak olabilir. Embriyolar artık enjeksiyon için hazır. Enjeksiyon yer embriyo ortasında yan tarafında tipik olarak. </li></ol> 3. Embriyo Enjeksiyon <ol><li> Bir micromanipulator için iğne takın. </li><li> Iğne ucu görüş alanı içinde lamel kenarına koymak ve aynı odak düzlemine iğne ayarlamak kırmak için. Bu iğne ucu vurur ve tatili kadar çok dikkatli bir şekilde lamel hareket ettirin. </li><li> Embriyoların odaklanarak, yağ içine iğne yerleştirin ve iğne bir sıvı damla olsun emin olun. Bu iğne ucu olmuştur anlamına gelirde kırık. </li><li> Dokunmadan iğne tutucu iğne içine embriyo hareket ve embriyo içine bir damla enjekte. Uzak embriyo hareket ettirin ve tüm embriyolar enjekte kadar bir sonrakine geçin. </li></ol> 4. Görüntüleme 40X veya 100X amacı ile ters bir konfokal mikroskop Biz görüntü embriyolar. Biz güçlü GFP ifade ve enjeksiyonu takiben apoptotik hücrelerin iyi bir etiketleme gösterir ortasında, merkezi sinir sistemi ile bir güzel konumlandırılmış embriyo arayın. Canlı embriyoların zaman atlamalı kayıtları için biz genellikle 5 veya 6 konfokal dilim (kalın 2 mikron her) seçin. Daha sonra, biz bütün hücreleri gözlemlemek için 3 dilim (6 mikron kalınlığında) bir projeksiyon yapmak. Biz istikrarlı ve kolayca çamaşır suyu yok apoptotik hücreler için işaretleri kullanın. Biz 60 sn aralıklarla kayıt yapmak beyazlatma GFP önlemek için. Bazı durumlarda embriyo haddeleme başlayabilirvideo kayıt döneminde. Bu nedenle, durdurmak ve gerekirse yeniden başlamak için kayıt bir arada bir göz atın.

<ol><li>Kinchen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+to+die+for%3A+signaling+to+apoptotic+cell+removal+in+worm%2C+fly+and+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Apoptosis%22%5BJournal%5D)">A model to die for: signaling to apoptotic cell removal in worm, fly and mouse.</a> Apoptosis. 15, 998-1006 (2010).</li>
<li>Kinchen, J. M., Ravichandran, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagosome+maturation%3A+going+through+the+acid+test%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Phagosome maturation: going through the acid test.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9, 781-795 (2008).</li>
<li>Kinchen, J. M., Ravichandran, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytic+signaling%3A+you+can+touch%2C+but+you+can%27t+eat%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Phagocytic signaling: you can touch, but you can't eat.</a> Curr. Biol. 18, 521-524 (2008).</li>
<li>Stuart, L. M., Ezekowitz, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytosis%3A+elegant+complexity%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Phagocytosis: elegant complexity.</a> Immunity. 22, 539-550 (2005).</li>
<li>Lauber, K., Blumenthal, S. G., Waibel, M., Wesselborg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clearance+of+apoptotic+cells%3A+getting+rid+of+the+corpses%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Clearance of apoptotic cells: getting rid of the corpses.</a> Mol. Cell. 14, 277-287 (2004).</li>
<li>Henson, P. M., Hume, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptotic+cell+removal+in+development+and+tissue+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">Apoptotic cell removal in development and tissue homeostasis.</a> Trends Immunol. 27, 244-250 (2006).</li>
<li>Kurant, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keeping+the+CNS+clear%3A+glial+phagocytic+functions+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Keeping the CNS clear: glial phagocytic functions in Drosophila.</a> Glia. 59, 1304-1311 (2011).</li>
<li>Kurant, E., Axelrod, S., Leaman, D., Gaul, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Six-microns-under+acts+upstream+of+Draper+in+the+glial+phagocytosis+of+apoptotic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Six-microns-under acts upstream of Draper in the glial phagocytosis of apoptotic neurons.</a> Cell. 133, 498-509 (2008).</li>
<li>Mergliano, J., Minden, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase-independent+cell+engulfment+mirrors+cell+death+pattern+in+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Caspase-independent cell engulfment mirrors cell death pattern in Drosophila embryos.</a> Development. 130, 5779-5789 (2003).</li>
<li>van den Eijnde, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+surface+exposure+of+phosphatidylserine+during+apoptosis+is+phylogenetically+conserved%5BTitle%5D)+AND+%22Apoptosis%22%5BJournal%5D)">Cell surface exposure of phosphatidylserine during apoptosis is phylogenetically conserved.</a> Apoptosis. 3, 9-16 (1998).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.

Apoptotik hücre boşluk son derece dinamik apoptoz, kritik bir son aşamadır. Bu nedenle işlem gerçek zamanlı çalışmalar büyük önem taşımaktadır. Burada gelişmekte olan Drosophila embriyolar canlı apoptotik hücre boşluk izlenmesi sağlayan bir protokol açıklar. Apoptotik hücreleri ve fagositler: Bu prosedürde, hücrelerin iki nüfus özel işaretleri kullanılarak işaretlenmiş olmalıdır. Simu-cytGFP raportör aynı embriyo eş zamanlı olarak fagositik makrofajlar, glia ve ektoderm izlenmesi için uygundur, W</...

Apoptoz ve sonraki fagositoz yoluyla istenmeyen veya anormal hücrelerin ortadan kaldırılması uygun embriyo gelişimi için hem de yetişkin doku homeostazında için çok önemlidir. Apoptotik hücreler veya apoptotik hücre boşluk fagositoz dört adımda ilerler son derece dinamik bir süreçtir: apoptotik hücreye fagositler (1) işe (&#39;bulmak-me&#39;), fagositoz için bir hedef olarak hücrenin (2) tanıma ( &#39;-Bana yemek&#39;) ve (3) yutulmasına, apoptotik parçacık 1-5 (4) phagosome olgunlaşma ve yıkımı izledi. &#39;Profesyonel&#39; makrofajlar ve olgunlaşmamış dendritik hücreler, ve &#39;profesyonel olmayan&#39; doku yerleşik komşu hücreleri, metazoan geliştirme 6,7 sırasında apoptotik hücre izni için önemli olan: fagositler iki türü vardır. Drosophila gelişimi apoptoz yoluyla gereksiz hücrelerin giderilmesi üç m oluşurgeç embriyo için orta ilk, sonra orta pupa ve yine erken yetişkin ain aşamaları,. Embriyogenez sırasında apoptotik parçacıklar &#39;profesyonel&#39; fagositler, makrofajlar, ve &#39;profesyonel olmayan&#39; ektoderm ve glia 8,9 ile çıkarılır. Daha önceki çalışmada biz embriyogenez sırasında fagositik hücrelerde sadece ifade bir fagositik reseptör, Altı mikron-altı (SIMU), belirledik. Simu organizatörü kullanarak bize canlı bir gelişen embriyonun 8 eş zamanlı olarak makrofajlar, ektoderm ve glia izlemeniz için fagositik hücre popülasyonlarının (simu-cytGFP) için özel bir belirteç oluşturulur. Buna ek olarak, apoptoz farklı aşamalarında apoptotik hücreler için özel işaretleri kullanarak, in vivo apoptotik hücre boşluk dinamiklerini takip edebiliyoruz.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reagent</td></tr><tr><td>Annexin V </td><td>Moleküler Problar</td><td>A35108</td><td></td></tr><tr><td>PhiPhiLux G2D2</td><td>OncoImmunin</td><td>A304R2G-5</td><td></td></tr><tr><td>LysoTracker</td><td>Moleküler Problar</td><td>L-7528</td><td></td></tr><tr><td>Halokarbon yağı 700</td><td>Sigma</td><td>H8898</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">< güçlü > Malzeme< / güçlü ></td></tr> <tr><td>Kılcal boru</td><td>FHC</td><td>30-30-0</td><td></td></tr><tr><td>Hücre Süzgeci</td><td>SPL</td><td>93100</td><td></td></tr><tr><td>Boya Fırçası</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

apoptotik hücresi temizliği görüntülenmesi sırasında canlı<em&gt; drosophila</em&gt; embriyo

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Apoptoz ve sonraki fagositoz yoluyla istenmeyen veya anormal hücrelerin uygun ortadan kaldırılması (apoptotik hücre boşluk) Tüm metazoan organizmaların normal gelişimi için çok önemlidir. Apoptotik hücre boşluk yakından hücre ölümü ile ilgili son derece dinamik bir süreçtir; unengulfed apoptotik hücrelerin ancak normal şartlar altında in vivo olarak görülür. Apoptotik hücre boşluk farklı adımları anlamak için ve &#39;profesyonel&#39; fagositler karşılaştırmak için - için makrofajlar ve dendritik hücreler &#39;profesyonel olmayan&#39; - doku yerleşik komşu hücreler, sürecin in vivo canlı görüntüleme son derece değerlidir. Burada canlı Drosophila embriyolar apoptotik hücre boşluk eğitim için bir protokol açıklar. Biz apoptotik hücreleri ve fagositler için özel işaretleri kullanmak fagositoz farklı adımların dinamiklerini takip etmek. Ayrıca, paralel olarak iki fagosit sistemleri izleyebilirsiniz: &#39;profesyonel&#39; makrofajlar ve &#39;yarı-profeGelişmekte olan merkezi sinir sisteminde ssional &#39;glial (MSS). Burada anlatılan yöntemi apoptotik hücre boşluk gerçek zamanlı çalışmalar için mükemmel bir model olarak Drosophila embriyo kullanır.

Apoptotik hücre Annexin V ile etiketlenir ve glia ektoderm ve makrofajlar simu-cytGFP ile etiketlenmiş olan bir filmden Örnek çerçeve, Şekil 2&#39;de gösterilmiştir. Her kare 3 dilim 2 mikron her bir yansımasıdır. Sahne 15 embriyo düzgün şekilde etiketlenmiş glia (g) ile ortada embriyonik MSS gösteren konumlandırılmış. MSS dışında çoğunlukla makrofajlar (m), güçlü sitoplazmik GFP ifade gösterir. Ektodermal hücreler de sitoplazmik GFP (e) ile etiketlenir. Birçok Anne...

Burada apoptotik hücre boşluk dinamikleri eğitim için etkili bir yöntem tarif<em&gt; In vivo</em&gt;. Bu yöntem canlı istihdam<em&gt; Drosophila</em&gt; Apoptotik hücre ve fagositlerle belirli etiketleme ile apoptotik hücrelerin fagositoz izlenmesi için güçlü bir model olarak embriyolar.

Apoptotik hücresi Temizliği görüntülenmesi sırasında Canlı<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriyo

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Bu prosedürün genel amacı, drosophila embriyosunda apoptotik hücre temizliğinin dinamiğini takip etmektir. Bu işlem, fagositik hücre popülasyonlarını işaretleyen sitoplazmik bir GFP markörü içeren transgenik sineklerle gerçekleştirilir; Simio GFP markörlü embriyolar toplanır, yıkanır ve kaplanır. Ardından, embriyolar enjeksiyon için konumlandırılır ve ardından MSS izlenir.Üçüncü adım, embriyolara X in five gibi spesifik apoptoz fagositoz işaretleyicilerinin enjekte edilmesiyle apoptotik hücrelerin işaretlenmesidir; son adım ise konfokal mikroskopi kullanarak embriyonik MSS'nin zaman geçirmeli (time-lapse) kayıtlarının yapılmasıdır. Nihayetinde, floresan konfokal mikroskopi aracılığıyla, apoptotik hücre temizlenmesinin farklı aşamaları boyunca apoptotik hücrelerin ve fagositlerin lokalizasyonu ile davranışı gösterilebilir. Bu tekniğin, fikse edilmiş embriyolarda immünohistokimya gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, apoptotik hücre temizlenmesinin dinamiklerini takip edebilmemizdir.Apoptotik hücrelerin temizlenmesi, çeşitli aşamalardan oluşan oldukça dinamik bir süreçtir. Bu teknik, apoptotik hücreler ve fagositler için spesifik belirteçler kullanarak farklı aşamaları takip etmemize olanak tanır. Protokol, geleneksel reaktiflerle bir yapıştırıcı hazırlamakla başlar; ardından çift taraflı bandı çözün ve bir sintilasyon şişesine sığacak şekilde tekrar sarın.Flakonu heptan ile doldurun ve param ile mühürleyin. Ardından flakonu bir çalkalayıcıya takın ve 24 saat boyunca nazikçe sallayın. Ertesi gün, oda sıcaklığında hazırlanan yapıştırıcı yeni bir flakona aktarılır.Hazırlanan tutkalı yeni bir şişeye aktarmak için cam bir pastör pipeti kullanın. Hazırladıktan sonra, tutkalı lam camlarına uygulamak için bir pipet ucu kullanın. Heptan tutkalından bir damlayı, lam camının ortasına boyunca bir hat şeklinde dağıtın.Yapıştırıcının birkaç saniye boyunca kurumasını bekleyin. Kapak şeritleri, sinekler karbondioksit ile anestezi edildikten sonra kapalı bir kutuda oda sıcaklığında bir aya kadar saklanabilir. Yaklaşık 400 sineği, 25 °C'de iki saat boyunca bekletilmiş ısıtılmış üzüm suyu yumurtlama plakası bulunan bir toplama kabında toplayın. Üzüm suyu yumurtlama plakasını alın ve sineklerin refahını korumak için kabı yeni bir plaka ile kapatın.Toplanan plaka, sıfır ila iki saatlik embriyolar içerir. Embriyoların bulunduğu, üzüm suyu içeren yumurtlama plakası, istenen gelişim zaman noktasına ulaşana kadar 25 °C'lik bir inkübatöre yerleştirin. Bu örnekte embriyolar 10 ila 12 saat arasında inkübe edilir, böylece gelişimlerini tamamladıklarında evre 15 veya 16'ya ulaşırlar.Embriyoları plakalardan bir hücre süzgecine aktarmak için musluk suyu ve temiz bir resim fırçası kullanın. Dökülen embriyoların geri alınabilmesi için süzgeci bir kabın üzerinde tutun. Toplanan embriyoları, tüm maya macunu temizlenene kadar durulayın.Ardından, süzgecin dış kısmını silerek fazla suyu kurulayın. Koriyonu yeterince uzaklaştırmak için hücre süzgecini temiz bir Petri kabına yerleştirin. Hücre süzgecindeki embriyoları kaplayacak kadar %50'lik çamaşır suyu ekleyin ve iki üç kez karıştırarak iki dakika bekleyin.Ardından, embriyolar çamaşır suyu kokusu geçene kadar durulayın. Hücre kabındaki embriyoları temiz bir Petri kabına yerleştirin ve kurumalarını önlemek için üzerlerini suyla kapatın. Embriyoların enjeksiyonu için.Bir iğne çekici ve ince duvarlı cam filamentler kullanarak enjeksiyon iğnelerini önceden hazırlayın. İstenilen reajenden bir mikrolitreyi, biri yedek olarak kullanılmak üzere iki iğneye yükleyin. Beş içinde bir X gibi kolayca ağarmayan stabil bir markör, uygun bir reajendir.Şimdi, mikroskobun üzerine dikdörtgen şeklinde bir üzüm suyu agarı yerleştirin. Embriyoları süzgeçten agara kaydırarak aktarın. Floresan diseksiyon mikroskobu altında temiz bir resim fırçası kullanarak, GFP belirteci yardımıyla enjeksiyon için uygun evredeki embriyoları seçin.Islak bir resim fırçası kullanarak, seçilen embriyoları ventral tarafları yukarı bakacak şekilde 10'lu bir sıra halinde taşıyın. Sırayı agro bloğun kenarına yerleştirin. Embriyo merkezi sinir sisteminde GFP görülebilir.Şimdi embriyoları bir şerit heptan yapıştırıcısı ile lamel üzerine sabitleyin. Embriyoların doğru konumlandırılması, enjeksiyonun başarısı için oldukça önemlidir. Acele etmeyin ve embriyoların uygun yönelimde tam olarak hizalandığından emin olun.Ardından, lamelini yaklaşık beş dakika boyunca dehidrasyon kamarasına yerleştirin. Embriyoları kuruttuktan sonra, daha fazla su kaybını önlemek için üzerlerini Hello karbon yağı 700 ile kaplayın. Son olarak, bir mikroskop lamı üzerine bir damla su bırakın.Ardından, embriyolar yukarı bakacak şekilde kapak dudağını ıslatılmış mikroskop lamı üzerine yerleştirin. Embriyolar artık enjeksiyona hazırdır. Bir iğneyi mikro manipülatöre ve piko pompaya takarak işleme başlayın.Pompa, iğneye azot iterek enjekte edilen sıvı miktarını kontrol eder. Bir ayak pedalı, mikroskop altındaki azotun kapılı boşaltımını kontrol eder. İğne ucuna odaklanın ve iğne ucu ile lam örtü camı odak noktasındayken, iğne ucunu çok dikkatli bir şekilde örtü camının kenarına yaklaştırıp konumlandırın.Lamın üzerindeki örtü camını, iğne ucuna çarpıp onu kırana kadar hareket ettirin. Açıklık çapı yarım ile iki mikrometre arasında olmalıdır. Şimdi embriyolara odaklanın.İğneyi yağın içine getirin. İğne ucu doğru şekilde kırıldıysa, yağın içine sızan bir sıvı damlası olmalıdır. İğne tutucusuna dokunmadan pedala bastığınızda, embriyonun yan kenarının iğne tarafından delinmesi için sahneyi hareket ettirin.Embriyoya hızlıca bir damla solüsyon enjekte edin. Embriyoyu kenara çekin ve 10 embriyonun tamamı enjekte edilene kadar bir sonrakine geçin. Embriyoları, 40 x veya 100 x objektifli bir ters konfokal mikroskop ile görüntüleyin.MSS'nin merkezde olduğu, güçlü GFP ekspresyonu ve apoptotik hücrelerin işaretlenmesinin gözlemlendiği, uygun konumlanmış bir embriyo arayın. Time-lapse kayıtları yapmak için, bu konumlarda mikron çubukla işaretlenecek beş veya altı konfokal kesit seçin. GFP ağarmasının sorun teşkil etmeyeceği bir aralık olan her 60 saniyede bir tarama yapın.Ardından, tüm hücreleri gözlemlemek için altı mikron kalınlığında üç kesit projeksiyonu yapın. Bazı durumlarda, video kaydı sırasında embriyo dönmeye başlayabilir. Bu nedenle, hareket eden embriyolar nedeniyle zaman kaybı yaşanmaması için kaydı izleyin.Doğru konumlandırılmış evre 15 embriyoda, ortada embriyonik MSS görülür; burada glia hücreleri g ile işaretlenmiş olup, çoğunluğu MSS'nin dışında yer alan makrofajlar ise M ile işaretlenmiştir. Güçlü sitoplazmik GFP ekspresyonu gözlemlenir. Ektodermal hücreler E de sitoplazmik GFP ile işaretlenmiştir.Bu kareler, an ex in five ile işaretlenmiş apoptotik hücreleri ve cite GFP ile işaretlenmiş ektoderm ve makrofajları göstermektedir. Her kare üç kesitin projeksiyonudur ve her bir kesit iki mikron kalınlığındadır. Birçok an ex in five pozitif hücre, MSS'nin içinde ve dışındadır.Kutulu olay, apoptotik bir partikülü yutan bir glial hücreyi göstermektedir. Glial hücrenin sondama davranışına dikkat edin. Glial hücre, apoptotik hücrenin gelişiminden sonra onu yutmaya karar vermeden önce apoptotik partiküle birkaç kez dokunur.Bu teknik, apoptotik hücre temizlenmesi alanındaki araştırmacıların, gelişim sürecindeki apoptotik hücrelerin fagositozunu incelemelerine yol açmıştır. Bu tekniği kullanarak, apoptotik hücre temizlenmesinin oldukça dinamik davranışını araştırabiliriz.

live-imaging-apoptotic-cell-clearance-during-drosophila

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Drosophila hemocytes gelişmekte olan embriyonun bütünlüğü içinde dağılırlar . Bu protokol, floresan etiketli hemocytes embriyoları kullanılarak bu göçler montaj ve görüntü nasıl gösteriyor.

Uygulamalarda Canlı Görüntüleme Drosophila melanogaster Embriyonik Hemocyte Göçler

Bu video, Drosophila melanogaster'in homojenize embriyonik hücrelerinde apoptotik hücre yutulmasını görselleştirmek için bir immün boyama tekniğini göstermektedir. Bu yöntem, apoptotik hücre yutulmasının derecesini belirleyerek hücresel fizyoloji hakkında bilgi sağlar.

Fagositoz Testi: Drosophila melanogaster'in Embriyonik Hücrelerinde Apoptotik Hücre Yutulmasını Görselleştirmek İçin Bir İmmün Boyama Tekniği

Bu kağıdı doğrudan puparium aracılığıyla görüntü hücre davranışı hızlı bir tarama konfokal mikroskop kullanımını gösterir. Sağlam pupa davayı bırakarak, bu yöntem doğrudan çalışma zordur Drosophila bir gelişme aşamasında gözlem ve dinamik hücre süreçlerinin ölçülmesini sağlar.

Ve Pupa Durumunda sayesinde görüntüleme<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Bu protokol, dokunulmamış larva beyin bağlamında canlı hücre görüntüleme yapmak için kullanılan akıcı bir yöntem göstermektedir. Canlı hücre görüntüleme yaklaşımları sürekli daha önce gözardı mekanizmaları ortaya çıkarılması, asimetrik nöral kök hücre bölünmeleri çalışmanın yanı sıra diğer nörolojik ve gelişimsel süreçleri için paha biçilmezdir.

Canlı Görüntüleme<em&gt; Drosophila</em&gt; Larva nöroblastomun

Bu protokol, canlı Drosophila pupa göz nöroepitelini görüntülemek için etkili bir yöntem sunar. Bu yöntem, doku hareketini ve düzensiz topolojiyi telafi eder, birden fazla GFP etiketli bağlantı proteininin kullanılması yoluyla hücre sınırlarının görselleştirilmesini geliştirir ve kolayca monte edilebilen bir görüntüleme teçhizatı kullanır.

Canlı-görüntüleme Drosophila Pupa Göz

Kaspaz aktivitesi düşük seviyelerini ihtiva Tüm hayvanlarda sağlıklı hücreleri saptamak için, CaspaseTracker belirlenen son derece hassas biyosensör Drosophila için hazırlandı. Kaspaz bağımlı biyosensör aktivitesi ölüm uyarımının olmaması durumunda optimum koşullar altında yetiştirilen yetişkin hayvan iç organlar içinde uzun ömürlü, sağlıklı hücrelerde tespit edilir.

In Vivo Biyosensör Drosophila olmayan apoptotik Kaspaz Aktivite Tracks

Drosophila'nın dağıtılmış embriyonik hücrelerini kullanarak bir fagositoz tahlili burada tarif edilmektedir. Bu, in vivo fagositoz seviyelerini kolay ve kesin bir şekilde ölçmemize ve apoptotik hücrelerin fagositozu için gerekli olan yeni molekülleri belirlememize olanak tanır.

Apoptotik Hücreler İçin Fagositoz Testi Drosophila

Burada sunulan mikroenjekte etmek ve aynı anda görüntü birden fazla Drosophila embriyoembriyonik gelişim sırasında bir plaka tabanlı, yüksek içerik görüntüleyici kullanarak bir protokoldür.

Drosophila Embriyo Hazırlama ve Canlı Hücre Mikroskopisi Için Mikroenjeksiyon Otomatik Yüksek İçerik Analizörü Kullanılarak Gerçekleştirildi

Işık tabakası bazlı floresan mikroskopisi gelişim biyolojisinde en değerli araçtır. Karşılaştırmalı çalışmalarda önemli bir konu ortam değişkenliğidir. Protokolümüz, birden fazla örneğin eşzamanlı canlı görüntülenmesi için deneysel bir çerçeveyi açıklar ve bu nedenle bu sorunu pro-aktif olarak ele alıp gidermektedir.

Örnek Oda Bazlı Işık Tabakası Floresan Mikroskoplarında Birden Fazla Böcek Embriyosunun EşZamanlı Canlı Görüntülenmesi

Bu protokol, geleneksel GFP/mCherry etiketi yaklaşımları kullanılarak tespit edilmesi zor olan düşük bolluktaki proteinlerin veya translasyon sonrası modifikasyonların canlı görüntülenmesini sağlamak için özelleştirilmiş antikor bazlı floresan etiketlemeyi ve erken Drosophila embriyolarına enjeksiyonu açıklar.

Floresan Antikor Enjeksiyonu ile Canlı Drosophila Embriyolarında Düşük Bolluktaki Proteinlerin ve Translasyon Sonrası Modifikasyonların Görselleştirilmesi

Burada, Drosophila yumurtalık nişindeki germ hattı kök hücrelerinin (GSC'ler) asimetrik bölünmesinin canlı görüntülemesini gerçekleştirmek için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Spektrozom proteini Par-1'in yeşil floresan proteini (GFP) füzyonunu her yerde ifade eden bir transgenik çizgi kullanıyoruz.

Kadın Drosophila melanogaster Germline Kök Hücre Nişlerinin Genişletilmiş Canlı Görüntülenmesi

Keşfedin canlı görüntüleme yöntemiyle Drosophila embriyolarında apoptotik hücre temizliği dinamiklerini. Konfokal mikroskopi ve spesifik belirteçlerle fagositoz süreçlerini gerçek zamanlı izleyin.

Apoptotik hücresi Temizliği görüntülenmesi sırasında Canlı

Daha fazla video keşfet