Name: Tanımlanması Sleeping Beauty Transposon Eklemeler (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 34 s
Description: Keşfedin Sleeping Beauty transposon eklemelerini haritalandırarak fare modelinde yeni onkogen ve tümör baskılayıcı genleri tanımlama yöntemini. Bu yaklaşım kanserin genetik sürücülerini tarafsız bir şekilde ortaya çıkarır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar protokolü yukarıda açıklanan geliştirme konusundaki yardım için Iowa Üniversitesi Minnesota Üniversitesi&#39;nde Branden Moriarty, David Largaespada ve Vincent Keng teşekkür, ve Adam Dupuy olurdu.

1. Yetiştirme ve Transgenik Hayvan Yaşlanma <ol><li> Denemeniz için uygun transgenik farelerin suşları seçin. İstenen kanser için kökenli hücreler olduğu düşünülmektedir hücrelerde Cre rekombinaz eksprese eden bir koşullu transposase fare, transpozonlar bir concatamer barındıran, bir fare, bir fare, bir Tipik bir deneyde üç transjenik çizgileri kullanırlar. Modellenen kanser hastalarının büyük bir kısmı bilinen bir mutasyon olması halinde, başlangıcında bu mutasyon dahil etmek tercih edilebilir. Bu &quot;hazırlayıcı&quot; mutasyon örnekleri aktive Kras, dominant negatif TP53 veya floxed PTEN allel içerir. Predispozan bir mutasyon ekleyerek model daha iyi (1.3) insan kanser temsil edebilir. Çeşitli Sleeping Beauty transposase ve transpozonlar fareler Ulusal Kanser Enstitüsü Fare Deposu (edinilebilir <a href="http://mouse.ncifcrf.gov/" target="_blank">http://mouse.ncifcrf.gov/</a> ). </li><li> Sonunda eğer mümkünse her iki allel için homozigot fareler elde etmek transpozonlar yataklık farelerle Breed koşullu transposase fareler. Sizin üçlü transgenik deney farelerinin (Şekil 2) oluşturmak için Cre Rekombinaz ifade farelere Breed homozigot yavrular. Not: Elde homozigot fareler her zaman mümkün veya ideal değildir. Örneğin, homozigot p53 dominant negatif farelerde çok daha zor heterozigot farelerde daha doğurmak için vardır. Buna ek olarak, ibrelerin ıslahı başarılı olduğunu onaylamak için Mendel genetiği izleyin emin olmanıza yardımcı olur. </li><li> Bir yatkınlık arka kullanıyorsanız, predispozan alleli ile farelere transposase ile ilk cins fareler. Aynı zamanda, ırkı fareler transpozonlar taşıyan farelere Cre Rekombinaz ifade. Her allel mümkünse için homozigot fareler oluşturun. Son olarak, dörtlü transgenik deneysel anim oluşturmak için önceki iki yetiştirme düzenleri homozigot yavrular doğurmakals. </li><li> Deney hayvanları ek olarak, fareler kontrol Kusaklara oluşturur. Kontrol grubuna normal olarak sadece üç allel (Şekil 2) arasında iki devralan deneysel ıslah littermates oluşur. Bir arka plan yatkın olması durumunda, dört allel üçü de dahil olmak üzere fareler de gerekli olacaktır. </li><li> Tümör gelişimi ve / veya can çekişme için günlük deney ve kontrol farelerde izleyin. Sizin kurumsal hayvan bakımı ve hayvancılık için kullanımı komitesi (IACUC) gereksinimleri izleyin. Ayrıca, henüz can çekişmekte olmamıştır eğer bir hayvan kurban edeceği bir yaş belirlemek için tipiktir. Onsekiz ay fareler ötenazi hangi tipik bir yaştır. </li></ol> 2. Transgenik Hayvanlar nekropsi <table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td></tr><tr><td> Sure-Seal induction Odası </td><td> Beyin Ağacı Bilimsel </td><td> EZ-177 </td></tr><tr><td> Cryovial </td><td> Bioexpress </td><td> C-3355-2 </td></tr><tr><td> % 10 tamponlu formalin </td><td> Sigma Aldrich </td><td> HT501128-4L </td></tr></tbody></table> Tablo 1. Reaktifler gereklidir. <ol><li> Bir fare can çekişen veya belirlenen ömrünün sonuna geldiğinde, sizin IACUC yönergeleri izleyerek bir CO 2 odalarını kullanarak hayvan ötenazi. Genellikle, temiz bir gaz odasında hayvan yerleştirin gaz tankı açmak ve inç kare başına en yüksek 5 daha kilo okumak için regülatörü ayarlayın. CO 2 nazal ve oküler irritasyon ve kaçınma en aza indirmek için yavaş doldurun. Hayvan kalbi artık atıyor ve göz dokunduğu zaman yanıt vermiyor emin olun. </li><li> % 70 etanol ile kurban fare Sprey dış. </li><li> Sıra bir otopsi gemide fare ve diseksiyon iğne ile sabitleyin. Makas bir kullanınd cımbız fare açın ve organları kaldırmak. Toplanan hangi organların belirlenmesi proje bağlıdır. Ancak, bu organlar genellikle fare işlemez hale gelmişti neden çok önemli ipuçları verir her zaman olduğu gibi dalak ve karaciğer toplamak için tavsiye edilir. Ayrıca kemik iliği potansiyeli analizi için sternum toplamak. Buna ek olarak, her zaman anormal görünür herhangi bir organ ya da doku toplamak için faydalıdır. </li><li> Toplanan Dokular ve tümörler dört bölüme ayrılmıştır olmalıdır. % 10% 70 etanol, ardından 18 saat süreyle tamponlu formalin içinde bir kısım düzeltilmiştir. Bu bölüm, H &amp; E boyama ve / veya IHC için de kullanılabilir. Genellikle boyut olarak 50 ila 100 mg olup geri kalan üç bölüm, sıvı nitrojen içinde dondurulur ek bulunmaktadır. Bu DNA, RNA ve protein izolasyonu için de kullanılabilir. </li><li> IACUC kurallarına göre karkas ve kalan dokuların atın. </li></ol> 3. Tümörler genomik DNA İzolasyon <table border="1"><tbody><tr><td> &lt;reaktif strong&gt; adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td></tr><tr><td> Protein Yağış çözümü </td><td> Qiagen </td><td> 158910 </td></tr><tr><td> Hücre lizis tamponu </td><td> Qiagen </td><td> 158906 </td></tr><tr><td> Proteinaz K </td><td> Qiagen </td><td> 158920 </td></tr><tr><td> RNaz A </td><td> Qiagen </td><td> 158924 </td></tr><tr><td> TE Tampon </td><td> Promega </td><td> V6232 </td></tr></tbody></table> Tablo 2. Reaktifler gereklidir. <ol><li> İnce temiz bir jilet ile dondurulmuş tümör numunesi (50 ila 100 mg) kıyma. </li><li> Sıra bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içinde kıyılmış ve doku 5 ul Proteinaz K çözeltisi (20 mg / ml) içeren bir hücre parçalama tamponu 1 ml ekleyin. </li><li> Iyice vorteksleyin. </li><li> ° C çalkalayıcı tercihen gecede en az 4 saat, 250 rpm olarak ayarlanan bir 55 inkübe edin. </li><li> 1 ul RNaz bir çözeltisi (10 mg / ml) eklenir ve boru 25 kez ters. </li><li> 30 dakika süre ile 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> 3 dakika için buz üzerine yerleştirilmesi ile oda sıcaklığına soğutun. </li><li> 333 ul Protein yağış çözüm ve şiddetle vorteks ekleyin. </li><li> 14.000 rpm 10 dakika santrifüjleyin. Proteinler pelet gerekir. Pelet tekrar çok küçük, girdap ise, daha sonra 5 dakika, ve yeniden santrifüj boyunca buz üzerinde inkübe edilir. </li><li> Temiz bir 15 ml santrifüj tüp içine supernatant DNA içeren kapalı dökün. </li><li> 100% izopropanol eşit hacmi ekleyin ve yavaşça tersine 50 kat karıştırın. </li><li> 3 dk süreyle 3500 rpm&#39;de santrifüj. </li><li> Süpernatantı atın. </li><li> % 70 etanol 1 ml ekleyin ve pelet yıkamak için tüp birkaç kez ters. </li><li> Bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpüne etanol ile yıkanmış topak aktarın. </li><li> 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 14,000 rpm&#39;de santrifüje </li><li> Etanol kapalı dökün ve hava kuru (yaklaşık 5 ila 30 dakika) için tüp ters. </li><li> Süspanse DNA pellet TE 50 ila 500 ul DNA pelet boyutuna bağlı olarak. </li><li> 37 İsteğe inkübasyon ° C DNA süspansiyonu. </li><li> Uzun süreli depolama boyunca 4 ° C veya -20 ° C&#39;de depolayın. </li></ol> 4. Tümörler dan Linker Aracılı-PCR kullanarak genomik DNA <table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td></tr><tr><td> BfaI </td><td> New England Biolabs </td><td> R0568S </td></tr><tr><td> NlaIII </td><td> New England Biolabs </td><td> R0125S </td></tr><tr><td> 96 oyuklu plakalar MinElute </td><td> Qiagen </td><td> 28051 </td></tr><tr><td> QIAvac 96 Vakum manifoldu </td><td> Qiagen </td><td> 19504 </td></tr><tr><td> Multi-mikroplak Genie, 120V </td><td> Scientific Industries, Inc </td><td> SI-4000 </td></tr><tr><td> 5x ligasyon tampon ile T4 DNA ligaz </td><td> Invitrogen </td><html><td> 15224-041 </td></tr><tr><td> BamHI </td><td> New England Biolabs </td><td> R0136S </td></tr><tr><td> 25 mM dNTP </td><td> Bioexpress </td><td> C-5014-200 </td></tr><tr><td> Platinum Taq </td><td> Invitrogen </td><td> 10966-034 </td></tr><tr><td> FastStart Taq DNA Polimeraz </td><td> Roche </td><td> 12032929001 </td></tr><tr><td> Agaroz </td><td> Promega </td><td> V3121 </td></tr><tr><td> TAE Tampon </td><td> Promega </td><td> V4271 </td></tr><tr><td> TE Tampon </td><td> Promega </td><td> V6232 </td></tr><tr><td> Etidyum bromür </td><td> Promega </td><td> H5041 </td></tr></tbody></table> Tablo 3. Reaktifler gereklidir. Linker Diziler BfaI bağlayıcının + 5 &#39;GTAATACGACTCACTATAGGGCTCCGCTTAAGGGAC 3&#39; BfaI linker-5 &#39;Phos-TAGTCCCTTAAGCGGAG 3&#39;NH2 &quot;&gt; NlaIII bağlayıcı + 5&#39;GTAATACGACTCACTATAGGGCTCCGCTTAAGGGACCATG 3 &#39; NlaIII linker-5 &#39;-Phos GTCCCTTAAGCGGAGCC 3&#39; Astar Diziler İleri Primer PCR sağ tarafında (NlaIII): Spl IRDR R1 1 GCTTGTGGAAGGCTACTCGAAATGTTTGACCC Spl IRDR L1 1 CTGGAATTTTCCAAGCTGTTTAAAGGCACAGTCAAC: Primer PCR ön taraftır (BfaI) sol Sağ ve sol her iki taraf için Birincil PCR ters: Spl Link1 1 GTAATACGACTCACTATAGGGC İkincil PCR sağ ön tarafa: Bir Illumina barkodlu ikincil astar 5 &#39;AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNNNNNaGgtgtatgtaaacttccgacttcaa Örneği (N adlı 12 bp barkod temsil, büyük harf sırası Illumina platformu için gereklidir, ve küçük harf sırası transpozon bağlanacaktır.) Bir Illumina barkodlu secon Örnek: İkincil PCR ileri sol tarafdary astar 5&#39;AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNNNNNaAgtgtatgtaaacttccgacttcaa (N adlı 12 bp barkod temsil, büyük harf sırası Illumina platformu için gereklidir, ve küçük harf sırası transpozon bağlanacaktır.) Sağ ve sol her iki taraf için İkincil PCR ters: bağlayıcının iç içe ters primerler 5 &#39;CAAGCAGAAGACGGCATACGAGCTCTTCCGATCTAGGGCTCCGCTTAAGGGAC <ol><li> + Tavlama ve - BfaI bağlayıcılara ve NlaII bağlayıcılar her ikisi için bağlayıcı bir ilintileyici (100 uM), 50 ul bağlayıcı ile 50 ul + (100 uM) karıştırılarak ve bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içinde 2 ul NaCl (5 M) ilave edilir. 95 5 dak ° C ısıya blok yerleştirin. Isıtma bloğu kapatın ve (bu bir saat veya daha fazla sürer) yavaş yavaş oda sıcaklığına soğumaya bırakın. Gerekinceye kadar soğutulduktan sonra, tavlanmış linkerler bir dondurucuda -20 ° C&#39;de muhafaza edilebilir. </li><li> DNA tümör iki kısım, 1 ug DNA ihtiva eden her bir tablet hazırlanır. Bir kısım zekâ sindirilir olacaktransposonun &quot;doğru&quot; sonuna yakın kesecek ha restriksiyon enzim. İkinci kısım transposonun &quot;sol&quot; sonuna yakın kesen bir kısıtlama enzimi ile sindirilmiş olacaktır. Bu her transpozon insersiyon yükselterek şansını maksimize etmek için yapılır. </li><li> &quot;Sağ&quot; tarafında enzim NlaII kullanarak bir kısım ise tümör DNA sindirimi ve &quot;sol&quot; tarafında enzim BfaI kullanarak diğer kısım ise tümör DNA sindirimi: enzim 1 ul, 5 ul 10x NEB Tampon 4. DNA (birleştir 1 ug) ve 50 ul toplam hacim için GKD 2 O. 37 gecede Digest DNA ° su banyosu veya kuvöz C. </li><li> Enzimleri inaktive ısıtın (BfaI = 80 ° C 20 dakika, NlaIII = 65 ° C, 20 dakika). </li><li> MinElute 96 plaka örnekleri koyarak sindirilmiş örnekler temizleyin, kuyular kadar yaklaşık 15 dakika süreyle vakum manifoldu ve vakum yer plaka kuru gözükmelidir. </li><li> Tüm Liqui çıkarmak için vakum manifoldu ve kağıt havlu ile 96 plaka blot alt plakasını çıkarınd </li><li> Her bir kuyunun 30 ul GKD 2 O ekleyin ve 2 dakika boyunca yüksek orbital çalkalayıcı seti sallamak veya 20 ila 40 kez aşağı yukarı pipetle ve. </li><li> Temiz 96 kuyucuğu içine MinElute 96 plaka kuyularda tüm hacmi (30 ul) aktarın. </li><li> Adım 4.8 ve adım 4,1 linkers gelen sindirilmiş DNA bağlayıcı ligasyon reaksiyonları gerçekleştirin. 10 ul sindirilmiş DNA, 4 ul 5x ligasyon tamponu, 5.5 ul tavlanmış bağlayıcı (950 ug / ul), 0.5 mikrolitre T4 ligaz (5 U / ul) karıştırılır. </li><li> 16 gece boyunca ile 4 saat için inkübe ° C. </li><li> 10 dakika boyunca 65 ° C&#39;de T4 DNA ligaz inaktive ısıtın. </li><li> 4.6 - MinElute 96 kuyucuğu ve gibi adımlar 4,5 açıklandığı bir vakum manifoldu kullanılarak ligasyonu temizleyin. </li><li> 30 ul H 2 O süspanse edin ve temiz bir 96 plaka transfer. </li><li> Concatamer transpozonlar kalan yok etmek için ikinci bir DNA sindirimi gerçekleştirin. Bu plazmid v kesen bir enzimi kullanılarak DNA bir ikinci kesme işlemi ile elde edilirtranspozon concatamer ihtiva eden transjenik farelerin oluşturmak için kullanılan Ector DNA. </li><li> Digest DNA BamHI (hem sağ hem sol tarafında) kullanarak: Mix adım 4.13, 5 ul 10x NEB tampon # 3, 0.5 ul BamHI (20 U / ul), 0.5 ul BSA (den ilintileyiciniz bağlanan DNA 25 ul 10 mg / ml ) ve 19 ul GKD 2 O. </li><li> 37 Digest 3-6 saat veya gece boyunca ° C. </li><li> Linker için transpozon ve astar özel için özel bir astar kullanılarak primer PCR gerçekleştirin. Bunlar kullandığınız ne transpozon ve linker bağlı olarak değişiklik gösterecektir. Primerler T2/Onc ve T2/Onc2 transpozonlar çalışma yukarıdaki astar tabloda listelenmiştir. </li><li> Birincil PCR: 5 ul 10x tampon, 2.0 ul MgCl2 (50 mM), 4 ul dNTP (2.5 nM), 1 ul Primer 1 (20 uM), 1 ul Primer 2 (20 uM), 0.25 ul Taq Platin (5 U / ) ul, linkers 3 ul Sindirilmiş DNA (miktarı değişebilir), en fazla 50 ul GKD 2 O. </li><li> PCR Programı: 94 ° C de 5 dakika, 94 30 döngüleri ° C için 30 sn, 60 ve dörneğin, 30 saniye için C, 90 sn için 72 ° C&#39;dir. 72 Final uzantısı ° C de 5 dakika. </li><li> MinElute 96 oyuklu plakalar ve yukarıda tarif edildiği gibi bir vakum manifoldu kullanılarak PCR ürünü temizleyin. </li><li> 30 ul H 2 O süspanse edin ve temiz bir 96 plaka transfer. </li><li> 148 ul GKD 2 O içine adım 4.21 DNA 2 ul seyreltilmesi ile 1 bir 1:75 seyreltme ° PCR Yap </li><li> Ayrıca Illumina GAIIx makine hem de (bu primerler ile ilgili örnekler için yukarıda astar tabloya bakınız) işlenmiş her bir tümör numune için eşsiz olan bir 12 baz çifti barkod için gerekli dizisine sahip primerlerin iç içe versiyonları ile ikincil PCR gerçekleştirin. </li><li> İkincil PCR: MgCl2 10 ul 10x Tampon, 8 ul dNTP (2.5 mM), 1 ul Illumina ikincil astar (20 uM), 1 ul Illumina Nest 1 ikincil astar (20 uM), 0.25 ul FastStart Taq (barkodlu 5 U / ul ), primer PCR seyreltilmiş 1:75 2 ul DNA, 100 ul GKD 2 O. </li><li> PCR Programı: 94 °, 2 dakika için C, 90 sn için 45 saniye, 72 ° C&#39;de 30 saniye, 53 ° C de 94 ° C arasında 30 devir. 72 Final uzantısı ° C de 5 dakika. </li><li> Etidiyum bromid (0.5 ug / ml) ihtiva eden bir% 1 agaroz jeli üzerinde Bu PCR reaksiyonu 45 ul çalıştırın. Tümör içinde birçok farklı transpozon ekleme (Şekil 3) arasında amplikonlar temsil eden PCR ürünleri bir &quot;smear&quot; olmalıdır. </li><li> MinElute 96 oyuklu plakalar ve yukarıda tarif edildiği gibi bir vakum manifoldu kullanılarak PCR ürünü kalan 50 ul temizleyin. Kuyularda 50 ul GKD 2 O yerleştirerek tekrar vakumlama tarafından bir kez yıkayın. </li><li> 30 ul TE süspanse edin ve temiz bir 96 plaka transfer. </li><li> Her örnek DNA&#39;nın konsantrasyonu tayin edilir. Tek bir 1.5 ml mikrofuge&#39;de tüp DNA eşit miktarda karıştırın. Bu, bir Illumina HiSeq 2000 makine, tek bir şerit halinde sıralı kütüphane olacaktır. Bir Illumina çalışma tek bir şeritte sıra birkaç yüz tümörlerin mümkündür. </li><li> Sunmaksıralama için tüm tümörlerin DNA eşit miktarlarda içeren tek tüp. Bu, kurum ya da ticari olarak yapılabilir. </li></ol> 5. Eklemeler Transposon analizi <ol><li> Transpozon ekleme verileri analiz etmek için yazılım SourceForge (üzerinden ücretsiz indirmek için kullanılabilir <a href="http://sourceforge.net/projects/tapdancebio/" target="_blank">http://sourceforge.net/projects/tapdancebio/</a> ). TapDance adlandırılan program, Illumina platformu ve kütüphane haritası metin dosyasına bir barkod gelen sıra dosyası gerektirir. </li></ol>

<ol><li>Fearon, E. R., Vogelstein, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+model+for+colorectal+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A genetic model for colorectal tumorigenesis.</a> Cell. 61, 759-767 (1990).</li>
<li>Wood, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Genomic+Landscapes+of+Human+Breast+and+Colorectal+Cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The Genomic Landscapes of Human Breast and Colorectal Cancers.</a> Science. 318, 1108-1113 (2007).</li>
<li>Ivics, Z., Hackett, P. B., Plasterk, R. H., Izsvák, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Reconstruction+of+Sleeping+Beauty%2C+a+Tc1-like+Transposon+from+Fish%2C+and+Its+Transposition+in+Human+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular Reconstruction of Sleeping Beauty, a Tc1-like Transposon from Fish, and Its Transposition in Human Cells.</a> Cell. 91, 501-510 (1997).</li>
<li>Starr, T. K., Largaespada, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+gene+discovery+using+the+Sleeping+Beauty+transposon%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Cancer gene discovery using the Sleeping Beauty transposon.</a> Cell Cycle. 4, 1744-1748 (2005).</li>
<li>Mueller, P. R., Wold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+Footprinting+of+a+Muscle+Specific+Enhancer+by+Ligation+Mediated+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">In Vivo Footprinting of a Muscle Specific Enhancer by Ligation Mediated PCR.</a> Science. 246, 780-786 (1989).</li>
<li>Bergemann, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+methods+for+finding+common+insertion+sites+and+co-occurring+common+insertion+sites+in+transposon-+and+virus-based+genetic+screens%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">New methods for finding common insertion sites and co-occurring common insertion sites in transposon- and virus-based genetic screens.</a> Nucleic acids research. 40, 3822-3833 (2012).</li>
<li>Copeland, N. G., Jenkins, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harnessing+transposons+for+cancer+gene+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Harnessing transposons for cancer gene discovery.</a> Nature Reviews Cancer. 10, 696-706 (2010).</li>
<li>Collier, L. S., Carlson, C. M., Ravimohan, S., Dupuy, A. J., Largaespada, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+gene+discovery+in+solid+tumours+using+transposon-based+somatic+mutagenesis+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cancer gene discovery in solid tumours using transposon-based somatic mutagenesis in the mouse.</a> Nature. 436, 272-276 (2005).</li>
<li>Starr, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transposon-based+genetic+screen+in+mice+identifies+genes+altered+in+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A transposon-based genetic screen in mice identifies genes altered in colorectal cancer.</a> Science. 323, 1747-1750 (2009).</li>
<li>Keng, V. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conditional+transposon-based+insertional+mutagenesis+screen+for+genes+associated+with+mouse+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A conditional transposon-based insertional mutagenesis screen for genes associated with mouse hepatocellular carcinoma.</a> Nature. 27, 264-274 (2009).</li>
<li>Dupuy, A. J., Akagi, K., Largaespada, D. A., Copeland, N. G., Jenkins, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+mutagenesis+using+a+highly+mobile+somatic+Sleeping+Beauty+transposon+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mammalian mutagenesis using a highly mobile somatic Sleeping Beauty transposon system.</a> Nature. 436, 221-226 (2005).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa etmek başka bir şey var.

Uyuyan güzel transpozon sistemi kullanan bir ileri genetik ekran neden olan kanser mutasyonları tanımlamak için bir yöntem sağlar. Herhangi hazırlayıcı mutasyon ek olarak Cre rekombinaz kontrol etmek için uygun bir promotörün seçerek, SB ekran bilinen belirlemek ve yeni aday genleri kanser olacaktır. Bir SB ekranının başarısı ekranı yaratmak için seçilen fareler üzerinde büyük ölçüde bağlıdır. Transpozon için, farklı kromozomlar 7 onkojenik transpozonlar concatam...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar (isteğe bağlı) </td></tr><tr><td> Sure-Seal İndüksiyon Odası </td><td> Beyin Ağacı Bilimsel </td><td> EZ-177 </td><td></td></tr><tr><td> Cryovial </td><td> Bioexpress </td><td> C-3355-2 </td><td></td></tr><tr><td> % 10 tamponlu formalin </td><td> Sigma Aldrich </td><td> HT501128-4L </td><td></td></tr><tr><td> Protein Yağış çözümü </td><td> Qiagen </td><td> 158910 </td><td></td></tr><tr><td> Hücre lizis tamponu </td><td> Qiagen </td><td> 158906 </td><td></td></tr><tr><td> Proteinaz K </td><td> Qiagen </td><td> 158920 </td><td></td></tr><tr><td> RNaz A </td><td> Qiagen </td><td> 158924 </td><td></td></tr><tr><td> TE Tampon </td> &lt;td&gt; Promega </td><td> V6232 </td><td></td></tr><tr><td> BfaI </td><td> New England Biolabs </td><td> R0568S </td><td></td></tr><tr><td> NlaIII </td><td> New England Biolabs </td><td> R0125S </td><td></td></tr><tr><td> 96 oyuklu plakalar MinElute </td><td> Qiagen </td><td> 28051 </td><td></td></tr><tr><td> QIAvac 96 Vakum manifoldu </td><td> Qiagen </td><td> 19504 </td><td></td></tr><tr><td> Multi-mikroplak Genie, 120V </td><td> Scientific Industries, Inc </td><td> SI-4000 </td><td></td></tr><tr><td> 5x ligasyon tampon ile T4 DNA ligaz </td><td> Invitrogen </td><td> 15224-041 </td><td></td></tr><tr><td> BamHI </td><td> New England Biolabs </td><td> R0136S </td><td></td></tr><tr><td> 25mM dNTP </td><td> Bioexpress </td><td> C-5014-200 </td><td></td></tr><tr><td> Platinum Taq </td><td> Invitrogen </td><td&gt; 10966-034 </td><td></td></tr><tr><td> FastStart Taq DNA Polimeraz </td><td> Roche </td><td> 12032929001 </td><td></td></tr><tr><td> Agaroz </td><td> Promega </td><td> V3121 </td><td></td></tr><tr><td> TAE Tampon </td><td> Promega </td><td> V4271 </td><td></td></tr><tr><td> TE Tampon </td><td> Promega </td><td> V6232 </td><td></td></tr><tr><td> Etidyum bromür </td><td> Promega </td><td> H5041 </td><td></td></tr></tbody></table>

tanımlanması<em&gt; sleeping beauty</emlinker-aracılı pcr kullanarak solid tümörlerde&gt; transposon eklemeler

Identification of Sleeping Beauty Transposon Insertions in Solid Tumors using Linker-mediated PCR

Insan tümörlerinin genomik, proteomik Transkriptomik ve epigenomic analizler eşleştirilmiş normal dokuya göre her kanser genom içerisindeki anomalilerin binlerce olduğunu göstermektedir. Bu analizlere dayanarak kansere 1 keşfedilmeyen birçok genetik sürücü olmadığını açıktır. Ne yazık ki bu sürücüler doğrudan tümör oluşumuna katkıda bulunmayan genomundaki yolcu anomalilerin çok daha fazla sayıda içinde gizlidir. Kanser genomun bir başka yönü de benzer tümör tipleri içinde hatırı sayılır genetik heterojenlik olmasıdır. Her tümör tümör oluşumu 2 bir selektif avantaj sağlayan farklı mutasyon barındırabilir. Yolcu mutasyonlar arka azaltırken farelerde tarafsız bir ileri genetik ekran Sahne, tümörler oluşturmak ve kendi genetik kompozisyon analiz etmek için araçlar sağlar. Sleeping Beauty (SB) transpozon sistemi böyle bir yöntem 3&#39;tür. SB sistemi mobil v kullanırtransposase enzim tarafından genomu boyunca yerleştirilebilir ectors (transpozonlar). Mutasyonlar, Cre rekombinaz tarafından aktive olan bir koşullu transposase alelinin kullanımı ile belirli bir hücre tipi ile sınırlıdır. Birçok fare hatları belli dokularda bulunduğunu ifade Cre Rekombinaz var. Koşullu transposase alleli (örn. Lox-stop-Lox-SB11) şu satırları birini geçerek, SB sistem sadece ifade Cre Rekombinaz hücreleri aktive edilir. Cre Rekombinaz ÖTV durak kaset olacak ki böylece belirlenmiş hücre tipi olan transpozon mutajenez aktive transposase allel blok ifadesi. Deneysel fareler bir şartlı transposase alel, transpozonlar bir concatamer, ve bir doku-spesifik Cre rekombinaz alleli böylece bir SB ekran transgenik farelerde üç cins üreme ile başlatılır. Bu fareler tümörler şeklinde yaşına kadar izin ve can çekişen hale gelir. Daha sonra fareler bulunmaktadırnekropsi ve genomik DNA tümör izole edilmiştir. Daha sonra, genomik DNA bağlayıcı aracılı-PCR ile yapılmıştır (LM-PCR) bir SB transpozon içeren genomik bir lokus amplifikasyon olarak sonuçlanır. LM-PCR, tek bir tümör 4 transpozon eklemeler içeren genomik lokus yüzlerce temsil farklı amplikonlarının yüzlerce neden olacaktır tek bir tümör üzerinde gerçekleştirildi. Tüm tümörlerde transpozon eklemeleri analiz edilir ve ortak ekleme siteleri (CISs) uygun istatistiksel metodun 5 kullanılarak tanımlanır. BDT içindeki genler onkogenler ve tümör baskılayıcı genler olması kuvvetle muhtemeldir, ve aday kanser genleri kabul edilir. Kanser aday genlerin tanımlanması için SB sistemini kullanmanın avantajları şunlardır: kendi dizisi, 2 bilindiğinden, 1) transpozon kolaylıkla aktarılması hemen hemen herhangi bir hücre tipi yönlendirilir ve 3) transpozon yeteneğine sahip olabilir) genomuna yerleştirilebilir tanıtan hem kazanç ve kayıp fonksiyon-mutasyonlar 6. Following protokolü aday kanser genleri (Şekil 1) tanımlamak için SB transpozon sistemini kullanan bir ileri genetik ekran hazırlamak ve yürütmek açıklamaktadır.

Yetiştirme programı kurulduktan sonra, yetiştiriciler her 19-21 günde bir çöp üretmek gerekir. Çöp boyutu yetiştiriciler ve genetik arka plan yaşına bağlı olarak, 5 ila 12 yavru değişecektir. Ayrıca, çöp genotip ıslahı doğru ve başarılı olduğunu teyit etmek için bir yol olarak Mendel genetiği aşağıda olduğundan emin olun. Deney başarılı olması için, deney hayvanlarında tümör oluşumunda kontrol hayvanlarında tümör oluşumunda önemli ölçüde daha büyük olması gerekir. Hayır &quot;hazırlayıcı&quo...

Tarafsız bir yaklaşım kullanarak karsinogenez bilinmeyen sürücüsü tespit için bir yöntem tarif edilmektedir. Yöntem kullanır<em&gt; Sleeping Beauty</emBelirli dokulara yönelik rastgele bir mutajen olarak&gt; transpozon. Tümör oluşumunu tahrik transpozon insersiyon Genomik haritalama roman onkogenler ve tümör baskılayıcı genler belirler

Tanımlanması<em&gt; Sleeping Beauty</emLinker-aracılı PCR kullanarak Solid Tümörlerde&gt; Transposon Eklemeler

Genomic, proteomic, transcriptomic, and epigenomic analyses of human tumors indicate that there are thousands of anomalies within each cancer genome ...

Bu prosedür, farede tümör oluşumunu yönlendiren eklemeler üzerinde transpoze haritalayarak yeni onkogenlerin ve tümör baskılayıcı genlerin nasıl tanımlanacağını gösterir. Bu, önce transgenik fare modelinden tümörlerin üretilmesi ve toplanmasıyla gerçekleştirilir. Prosedürün sonraki adımları, tümör DNA'sını izole etmek, bağlayıcı aracılı PCR gerçekleştirmek, daha sonra amplifiye DNA örneklerini sıralamak ve eklemelerdeki transpozeyi analiz etmektir.Sonuç olarak, prosedür aday tümör sürücü genlerini tanımlar. Uyuyan güzel transpozonları kullanılarak genetik tarama için tarafsız bir bağlayıcı aracılı PCR kullanmanın temel avantajı, kanserin yeni genetik itici güçlerini kolayca tanımlayabilmemizdir. Diseksiyona her zaman kurban edilen farenin dışına% 70 etanol püskürterek başlayın.Toplanan dokular ve tümörler 50 ila 100 miligram büyüklüğünde dört bölüme ayrılmalıdır. Bir bölümü 18 saat boyunca %10 tamponlu formin içinde sabitleyin, ardından %70 etanol ekleyin. Bu bölüm h ve e boyaması ve/veya immünohistokimya için kullanılabilir.Kalan bölümleri sıvı nitrojen içinde dondurun. Bunlar bir dondurucuda saklanabilir ve donmuş bir tümör örneğinden DNA toplamak için D-N-A-R-N-A ve protein izol

identification-sleeping-beauty-transposon-insertions-solid-tumors

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

NGS dizilimi için gDNA zenginleştirme, yapısal mutasyonların incelenmesi için kolay ve güçlü bir araçtır. Bu makalede, DNA hasarının onarımında yer alan 11 genin tam dizisini basitçe analiz etme prosedürünü sunuyoruz.

Whole Sırasının NGS Analiz için bir transpozaz tabanlı Technology tarafından gDNA Zenginleştirme BRCA1 BRCA2 ve 9 Genler

Burada, yenidoğan farelerin ventriküllerine enjekte edilen transpozon DNA'yı kullanarak yeni glioblastomları (GBM) indüklemek, izlemek ve analiz etmek için verimli ve çok yönlü bir protokolü açıklıyoruz. Plazmidi alan subventriküler bölgenin hücreleri, insan GBM'sinin histo-patolojik özelliklerine sahip tümörleri dönüştürür, çoğalır ve oluşturur.

Yenidoğan Fareler subventricular Bölgesi içine Plazmid DNA Transpozon Aracılı Entegrasyon Glioblastoma&#39;nın Roman modelleri oluşturmak için

Burada, fare embriyonik kök Southern blot ve/veya PCR kullanarak hücre Homolog rekombinasyon olayları tanımlamak için detaylı bir iletişim kuralı mevcut. Bu yöntem ile nonmuscle myosin II genetik değiştirme fare modelleri geleneksel embriyonik kök hücre tabanlı Homolog rekombinasyon aracılı hedefleme teknolojisi kullanarak oluşturma tarafından örneklenir.

Fare embriyonik kök hücre kullanarak Southern blot ve polimeraz zincir reaksiyonu Homolog rekombinasyon olaylar tanımlaması

Burada, tek bir subtelomere bir MS2 sıra etiketi içeren kanser hücre klonlar oluşturmak için bir protokol mevcut. Bu yaklaşım MS2 GFP sistemde güvenerek, endojen tutanaklar, telomeric tekrar içeren RNA (canlı hücreler içinde tek bir telomer üzerinden ifade TERRA) görselleştirme sağlar.

Canlı hücreler içinde tek bir telomer üzerinden ifade Telomeric tekrar içeren RNA TERRA görselleştirmek için kanser hücre klonlar nesil

Bu makalede, belirli bir hastadan farklı örnekler arasında klonal ve subklonal değişiklikleri tanımlamak için bir yöntem açıklanmaktadır. Burada açıklanan deneyler belirli bir tümör tipine odaklansa da, yaklaşım diğer solid tümörler için genel olarak uygulanabilir.

Hedefe Yönelik Sıralama Yaklaşımı ile Karşılaştırmalı Lezyonlar Analizi

Bu makalede, aktif bir hat-1 retrotransposon aktivitesini izlemek ve belirli bir genom de Novo retrotranspositions eşlemek için basit bir PCR tabanlı tahlil özetlenmektedir. MCF7 hücre hattını kullanarak, burada bu yöntemin 22q 12.1 'de bulunan bir satır 1 ' in aktivitesini algılamak için nasıl uygulanacağını gösteriyoruz.

Uzun mesafe ters PCR tarafından sıcak hat-1s Retrotransposition aktivitesinin tespiti

Bu çalışma, yeşil floresan protein ve biyolüminesans sinyallerinin yanı sıra kantitatif moleküler algılama tekniğinin entegrasyonu ile tümör yüklemesini doğru bir şekilde değerlendirmek için gelişmiş bir protokol hazırlaştır.

Ortotopik Meme Kanseri Modeli Kullanarak Üçlü Negatif Meme Kanseri Eğitimi

Burada bir tümörün genomik yapısına dayalı olarak seçilen hedefe yönelik tedavilerin etkinliğini test etmek için bir protokol sayılacağız. Protokol, yapısal DNA düzenlemelerinin tanımlanması ve doğrulanması, hastaların tümörlerinin farelere engraftasyonu ve ilgili ilaçlara verilen yanıtların test edilmesi olarak tanımlanmaktadır.

Yapısal DNA Alterasyon Analizi ve Hasta Kaynaklı Ksenogreftler Kullanılarak Kanserde Hedefli Tedavilerin Test Edilmesi

Lazer mikrodisesi ( LMD) glioma heterojenite ve invazyon aracılık yolları ortaya çıkarmak için kullanılabilecek hassas ve son derece tekrarlanabilir bir tekniktir. Burada lazer LMD kullanarak glioma dokusundan ayrık alanları izole etmek ve ardından transkripsiyonanalizi yapmak için optimize edilmiş bir protokol tanımlıyoruz.

İntratümöral Heterojenite, Oncostreams ve Invasion'ın Mekansal ve Moleküler Karakterizasyonu için Glioma Alt Bölgelerinin Lazer Yakalama Mikrodizması

Klinik öncesi testler için yaygın hasta mutasyonları tarafından yönlendirilen immün yetmez, otokton bir tümör modelinin kullanılması, immünoterapötik testler için kritik öneme sahiptir. Bu protokol, yaygın hasta mutasyonlarını temsil eden plazmit DNA'nın elektroporasyona dayalı dağıtımını kullanarak beyin tümörü fare modelleri oluşturmak için bir yöntemi açıklar, böylece doğru, tekrarlanabilir ve tutarlı bir fare modeli sağlar.

Hasta Mutasyon İmzalarını Temsil Eden Plazmid DNA'nın Elektroporasyona Dayalı İletimi Kullanılarak Beyin Tümörlerinin İn Vivo Modellenmesi

Keşfedin Sleeping Beauty transposon eklemelerini haritalandırarak fare modelinde yeni onkogen ve tümör baskılayıcı genleri tanımlama yöntemini. Bu yaklaşım kanserin genetik sürücülerini tarafsız bir şekilde ortaya çıkarır.

Tanımlanması

Daha fazla video keşfet