Tanımlanması Sleeping Beauty Transposon Eklemeler

Bu prosedür, farede tümör oluşumunu yönlendiren eklemeler üzerinde transpoze haritalayarak yeni onkogenlerin ve tümör baskılayıcı genlerin nasıl tanımlanacağını gösterir. Bu, önce transgenik fare modelinden tümörlerin üretilmesi ve toplanmasıyla gerçekleştirilir. Prosedürün sonraki adımları, tümör DNA'sını izole etmek, bağlayıcı aracılı PCR gerçekleştirmek, daha sonra amplifiye DNA örneklerini sıralamak ve eklemelerdeki transpozeyi analiz etmektir.

Sonuç olarak, prosedür aday tümör sürücü genlerini tanımlar. Uyuyan güzel transpozonları kullanılarak genetik tarama için tarafsız bir bağlayıcı aracılı PCR kullanmanın temel avantajı, kanserin yeni genetik itici güçlerini kolayca tanımlayabilmemizdir. Diseksiyona her zaman kurban edilen farenin dışına% 70 etanol püskürterek başlayın.

Toplanan dokular ve tümörler 50 ila 100 miligram büyüklüğünde dört bölüme ayrılmalıdır. Bir bölümü 18 saat boyunca %10 tamponlu formin içinde sabitleyin, ardından %70 etanol ekleyin. Bu bölüm h ve e boyaması ve/veya immünohistokimya için kullanılabilir.

Kalan bölümleri sıvı nitrojen içinde dondurun. Bunlar bir dondurucuda saklanabilir ve donmuş bir tümör örneğinden DNA toplamak için D-N-A-R-N-A ve protein izolasyonu için kullanılabilir. İlk olarak, dokuyu bir tıraş bıçağıyla ince bir şekilde kıyın.

Daha sonra, dokuyu bir mililitre hücre lizis tamponu ve mililitre başına 20 miligram beş mikrolitre ile 1.5 mililitrelik bir tüpte sindirin. Proteaz K çözeltisi karışımı iyice vorteksleyin ve standart bir izopropanol bazlı DNA ekstraksiyonu ile devam edin. Bağlayıcıları 1,5 mililitrelik bir tüpte tavlayarak bu protokole başlayın.

Her bağlayıcı çözeltinin 50 mikrolitresini iki mikrolitre konsantre sodyum klorür ile karıştırın. Ardından tüpü 95 derecelik bir ısı bloğuna yerleştirin. Beş dakika sonra, ısıyı kapatın ve yavaşça oda sıcaklığına soğumaya bırakın, bu soğuduktan sonra bir saat veya daha fazla sürebilir.

Anal bağlayıcılar, ihtiyaç duyulana kadar dondurucuda saklanabilir. Ali'nin her numuneden bir mikrogram DNA alıntı yaparak her iki 96 kuyucuklu plakadaki karşılık gelen oyuklara 2 96 kuyulu plaka hazırlayın. Örneğin, birinci numuneden bir mikrogram DNA'yı her iki kuyucuk plakasından biri olan A kuyusuna yerleştirin.

96 oyuklu plakadan birindeki DNA, sağ taraf enzimi NLA üç kullanılarak sindirilecek ve diğer 96 oyuklu plakadaki DNA örnekleri, sol taraf enzimi BFA biri kullanılarak sindirilecektir. DNA'nın gece boyunca 37 santigrat derecede sindirilmesine izin verin. Ertesi gün, enzimleri 20 dakika boyunca etkisiz hale getirerek sindirimi ısı ile bitirin.

Şimdi mini bir ganimet 96 kuyulu plaka kullanarak sindirim reaksiyonlarını temizleyin. Çok kanallı pipeti kullanarak her numuneyi mini ganimete aktarın. 96 kuyulu plaka.

Mini ganimet 96 kuyulu plakayı bir vakum manifolduna yerleştirin. Kuyucuklar kuru görünene kadar plakaya bir vakum uygulayın. Tipik olarak, bu protokol boyunca 15 dakika.

Numunelerinizi kontamine etmemek için büyük özen gösterilmelidir. 96 ile çalışırken, kuyu plakaları kuyuları mümkün olduğunca kapaklarla kapalı tutar ve pipetinizi açık kuyuların üzerinden geçirmekten kaçının çünkü herhangi bir istenmeyen sıvı damlası numuneyi mahvedebilir. Mini ganimet plakasını vakum manifoldundan çıkarın ve plakanın altını tamamen kuruyana kadar kağıt havluyla bloke edin.

Mini ganimetteki DNA'yı yeniden askıya alın. Her birine 30 mikrolitre çift damıtılmış su ekleyerek 96 kuyulu plaka. Mini ganimet plakasını iki dakika boyunca yükseğe ayarlanmış bir orbital çalkalayıcıya yerleştirin.

Ardından, mini ganimet plakası içeriğini temiz bir 96 kuyulu plakaya aktarın. Bağlayıcı ligasyon reaksiyonlarını gerçekleştirmek için. Yeterli miktarda ligasyon tamponu, adım 3.2 T'den diz çökmüş bir bağlayıcı dört DNA ligaz ve bir reaktif rezervuarında suyu karıştırarak ligasyon reaksiyonunu hazırlayın.

Önceki adımdan 10 mikrolitre sindirilmiş DNA'yı yeni bir 96 oyuklu plakaya aktarmak için çok kanallı bir pipet kullanın. Ardından, 96 oyuklu plakanın tüm kuyucuklarına 10 mikrolitre ligasyon reaksiyonunu Eloqua etmek için çok kanallı bir pipet kullanın. Sonuçta, kuyular DNA ve ligasyon reaktifleri ile yüklendi.

Plakayı dört saat boyunca gece boyunca 16 santigrat derecede inkübe edin. Ertesi sabah. T four Ligase'ı 65 santigrat derecede 10 dakika boyunca etkisiz hale getirerek ligasyonu sonlandırın.

Daha önce olduğu gibi, plakayı kurutmak için mini ganimet plakaları ve bir vakum manifoldu kullanarak ligasyon reaksiyonunu temizleyin ve ardından plakanın altını tamamen kuruyana kadar kurulayın. DNA'yı 30 mikrolitre çift damıtılmış suda yeniden süspanse edin. İki dakika boyunca bir orbital çalkalayıcı üzerine yerleştirin ve ardından mini ganimet plakası içeriğini temiz bir plakaya aktarın.

Daha sonra, kalan concat transpozonlarını yok etmek için bam H one ile ikinci bir DNA sindirimi gerçekleştirin. DNA'yı 37 santigrat derecede üç ila altı saat veya gece boyunca sindirin ve ardından sindirim, daha önce olduğu gibi aynı prosedürü izleyerek mini ganimet plakaları kullanılarak temizlenir. Transpoze için spesifik bir astar ve bağlayıcı için özel bir astar kullanarak 30 döngülü bir PCR gerçekleştirin.

Reaksiyon, bağlayıcılarla sindirilmiş DNA'nın üç mikrolitresini içermelidir. Ardından, mini ganimet kullanarak PCR reaksiyonunu temizleyin. Daha önce gerçekleştirildiği gibi 96 kuyulu plaka ve bir vakum manifoldu.

DNA'yı 30 mikrolitre suda yeniden süspanse edin ve süspansiyonları temiz bir 96'ya aktarın. İyi oynanmış, PCR reaksiyon ürünlerinin iki mikrolitresini, seyreltilmiş ürünlerden sadece iki mikrolitre kullanarak 148 mikrolitre çift damıtılmış suya seyrelterek devam edin. 100 mikrolitrelik hacimlerde primerlerin iç içe geçmiş versiyonlarını kullanarak 30 döngü PCR gerçekleştirin.

Bu astarlar Illumina GA two X makinesi içindir. Her numune, PCR çalışmasından elde edilen benzersiz bir 12 baz çifti barkoduna, AUM bromür içeren %1'lik bir jel üzerinde her üründen 45 mikrolitreye sahip olacaktır. Tümördeki birçok farklı transpozon eklemesinin amplikonlarını temsil eden bir PCR ürünleri smear olmalıdır.

Kalan 50 mikrolitre PCR'yi temizlemek için daha önce açıklanan vakumlu yıkama yöntemini kullanın, ardından DNA'yı 50 mikrolitre suda yeniden süspanse edin ve vakumlu yıkamayı tekrar gerçekleştirin. Şimdi Resus, DNA'yı 30 mikrolitre TE'de askıya alın ve temiz bir 96 oyuklu plakaya aktarın. Her numunedeki DNA konsantrasyonunu belirleyin.

Daha sonra her numuneden eşit miktarda DNA'yı tek bir tüpte birleştirin. Her bir numune, protokol kullanılarak ayrı bir barkodlu primer kullanılarak oluşturulduğu sürece, bir Illumina çalışmasının tek bir şeridinde birkaç yüz DNA örneğini sıralamak mümkündür. Başarılı bir LMPCR, ikincil PCR ürününün yarısını %1'lik bir jel üzerinde çalıştırdıktan sonra tek bir tümördeki yerleştirmelerde yüzlerce transpoze amplifiye etmelidir, bir DNA smear bu amplifikasyonu temsil eder.

LM PCR başarısız olursa, DNA smear eksikliği olacaktır. Bunun yerine, Illumina GA two X platformunun tek bir şeridinde bir ila 200 tümörü dizileyen kesin DNA dizilimi bantlarını göreceksiniz, bu prosedürü denerken her biri 100 baz çiftinden oluşan 30 milyondan fazla dizi üretmelidir. Bu prosedürü takiben herhangi bir kontaminasyon oluşmamasını sağlamak için yavaş ve dikkatli çalışmayı unutmamak önemlidir.

Kanserin yeni keşfedilen genetik itici güçlerinin analizi, bu faktörlerden hangilerinin tedavi için hedeflenebileceği gibi ek soruları yanıtlamak için yapılabilir.