Name: EMBL de MultiBac Protein Complex Üretim Platformu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-11T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 51 s
Description: Öğrenin, MultiBac bakulovirüs/böcek hücresi sistemiyle protein kompleksleri üretmeyi. Bu yöntem, yapısal biyoloji ve ilaç keşfi araştırmalarında yüksek kaliteli ökaryotik proteinler elde etmeyi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz Christoph Bieniossek, Simon Trowitzsch, Daniel Fitzgerald, Yuichiro Takagi, Christiane Schaffitzel, Yvonne Hunziker, Timothy Richmond ve yardım ve tavsiye için Berger laboratuar tüm geçmiş ve mevcut üyelerine teşekkür. MultiBac platformu ve gelişimi olmuştur ve cömertçe İsviçre Ulusal Bilim Vakfı (SNSF), Agence National de Recherche (ANR) ve Centre National de Recherche Scientifique (CNRS) ve Avrupa Komisyonu (AK) dahil olmak üzere finansman kurumları tarafından desteklenmektedir Çerçeve programlarına (FP) 6 ve 7. Uluslararası erişim desteği AB FP7 projeleri P-CUBE (tarafından sağlanan <a href="http://www.p-cube.eu" target="_blank">www.p-cube.eu</a> ) ve BioStruct-X ( <a href="http://www.biostruct-x.eu" target="_blank">www.biostruct-x.eu</a> ). Bilim Fransız Bakanlığı özellikle Investissement d&#39;Avenir projesi FRISBI yoluyla EMBL de MultiBac platformu desteklemek için kabul edilmektedir.

1. Multigen İfade Yapıları oluşturmak için tandem Recombineering (TR) <ol><li> Ortak ifade stratejisini planlama. Vericiler ve alıcılar içine ilgi genler eklemek için tasarım yaklaşımı. Lütfen kompleks potansiyel fizyolojik alt modüller özel alıcıları ve Bağış birlikte gruplandırılmalıdır. Bireysel Donör ve Alıcı plazmid üzerinde ifade kasetleri birleştirmek BstXI çift 7,8 siliko ilgili tüm yapıları oluşturma ve deneysel çalışma geçmeden önce iyice strateji doğrulamak - Homing endonükleaz (HE) oluşan Çarpma Modülü kullanın.. Örneğin, ilgili genleri, o ya da diğer sınırlama sitelerini ve doğru açık okuma çerçeveleri (ORF&#39;ler) varlığı teyit edilmesi gerekmektedir içeren değil kontrol edilmelidir. Protein üretimi seviyeleri hem de herhangi bir exi çıkarılmasını geliştirmek için böcek hücre kodon kullanımı ve mRNA ikincil yapısını optimize sentetik genler sipariş düşününHE ilgi genlerinden siteleri acı. Esnek veya maruz N-ya da seçtiğiniz proteinlerin C-Termini ile ilgili literatür verilerine dayanarak arıtma etiketleri yerleştirerek düşünün. Bireysel proteinlerin nispi miktarları karmaşık nedeniyle stokiyometri sorunları kontrol edilmesi gerekiyorsa karmaşık birçok protein alt üretmeyi hedefliyoruz poliprotein stratejileri uygulayarak düşünün. &quot;Nasıl Yapılır&quot; belge (elektronik laboratuar kitap tavsiye edilir) 4 ayrıntılı hazırlayın içeren projenin tüm öngörülen deneysel adımlar tam multigen yapı (lar) kadar lider. Berger grup ana sayfa (indirilebilir Cre-ACEMBLER yazılımı kullanarak örneğin Cre-LoxP erimiş plazmid elektronik dosyaları oluşturmak <a href="http://www.embl.fr/multibac/%20multiexpression_technologies/cre-acembler" target="_blank">www.embl.fr/multibac/ multiexpression_technologies / CRE-acembler</a> ). </li><li> Seçilen Bağış içine ilgi genler yerleştirin veRestriksiyon enzimleri ve ligaz kullanılarak, veya alternatif olarak, yayınlanan protokolleri takip ligasyon bağımsız yöntemler kullanarak alıcıları. 5,6,14 bir sıvı taşıma iş-istasyonuna erişimi varsa ve elde edilecek yapıları çok sayıda (planlıyorsanız kombinatoryal yaklaşımlar için örneğin) bir sıvı taşıma iş istasyonu mevcut değilse Berger grubu (Şekil 2). 14,15 tarafından geliştirilen ve uygulanan robotik komut dosyalarını kullanarak düşünün, mikrotitre plakaları kullanarak manuel kullanım moda gibi bir HT gen ekleme sağlar. </li><li> Ifade alt birimlerinin stokiyometri kontrol etmek için ihtiyaç dayattığı kısıtlamaları hayata olabilir. Bir protein kompleksinin tek tek alt birimlerinin stokiyometrik olarak dengesiz ekspresyon düzeylerinin durumunda, s aralıklı tek bir büyük ORF da kompleks birçok alt birimden ve belirli bir proteaz (örneğin tütün etch virüsü Nla proteaz) birleşmek için poliprotein stratejiler uygulayarak dikkatepecific proteolitik siteleri. 4,8 düşünün eş-ifade eden bir çok alt-birimleri ile çok büyük bir kompleks olan ve yaygın olarak tek tek alt biriminin moleküler ağırlığı arasında değişen eğer tek bir ekspresyon kasetleri, bir kez ya da birkaç poliproteinlerin. Göz önünde ko-ifade bu proteinin düşük üretim verimi ile karakterize edilir, bir poliprotein içinde, ya da daha fazla özdeş ekspresyon kasetleri ile aynı proteini kodlayan birçok gen. 4,13 </li><li> Kısıtlama haritalama (isteğe bağlı olarak yüksek verimli) ve sıralama ile klonlanmış tüm Donör ve Alıcı yapıları doğrulayın. Tercih multigen ifade yapıları oluşturmak için Cre-LoxP rekombinasyon tarafından Donör-Alıcı kombinasyonları sigorta geçin. Kısıtlama haritalama Alıcı-Verici füzyon plazmid arıtılmış doğrulamak, Cre-ACEMBLER veya bir referans olarak benzer programlar tarafından oluşturulan elektronik dizileri kullanın. </li><li> -20 ° C&#39;de saf ve doğrulanmış Bağış, alıcıları ve Donör-Alıcı füzyonlarını Mağaza veya -80 ° C Arşiv plasmids ve daha sonra kullanım için dikkatli dizileri (Microsoft Excel, Filemaker, diğerleri). </li></ol> 2. Kompozit multigen Baculovirus Üretimi, Amplifikasyon ve Depolama <ol><li> Viral genom ve Tn7 aktarılması için gerekli işlevleri barındıran DH10 hücrelere dönüştürerek multigen transferi vektörleri MultiBac bakuloviral genom entegre edin. Multibac bakuloviral genom Tn7 entegrasyon önceki vivo Cre reaksiyon bir tarafından kendi LoxP sitesinde ilgi belirli genler (YFP işaretleyici, chaperones, vb) (Tn7 eki siteye distal genomuna mühendislik) ile önceden yüklenmiş olabilir unutmayın. 13 Tn7 aktarılması sonra, ilgi genleri içeren kompozit bakülovirüs ile hücre beyaz / mavi tarama (β-galaktosidaz α-tamamlama kaybı başarılı Tn7 aktarılması sonuçları seçilir, bu nedenle, doğru Tn7 aktarılması ile koloniler seçici bir beyaz kalırgar X-gal içeren plakalar) ve genom alkalin lisizi ve etanol / izopropanol çökeltme ile hazırlanır. 5,6 </li><li> Transfeksiyon ve ilk virüs üretimi. Steril bir başlık içine yerleştirin 6-çukurlu bir doku kültür plakası. Geçmiş faz, Sf21 böcek hücre kültüründen, tarif edildiği gibi kültür ortamı içinde karıştırıldı saflaştırılmış baküloviral genomu ve bir transfeksiyon reaktifi ekleyerek kuyular ve transfekte hücrelerin alikotları üzerinden tohumu. Ortam kaldırarak 48-60 saat sonra hasat 6 ilk virüsü ( yüksek kalite, düşük titre virüs V 0, iyi başına tipik olarak 3 ml). Ilave 2-3 gün sonra, protein üretimi için taze ortam ve test (ve bir YFP işaretleyici mevcut ise, flüoresan) için ek. 6,7 </li><li> Virüs Amplifikasyon, düşük İçişleri Bakanlığı rejimi. Küçük (100-250 mL) çalkalama Erlenmeyer şişeleri içinde ajite log fazında hücrelerin 25-50 ml (mi başına hücre yoğunluğu &lt;1x10 6 hücre) enfekte etmek için virüs V 0 kullanınyörünge platform shakers üzerinde (Şekil 3). Hücre sayımı ve hücreler (çoğalması tutuklama) iki katına durana kadar her 24 saat ayrıldı. Bir (hücre başına virüs parçacıkları enfeksiyonu yani sayısı çokluğu) İçişleri Bakanlığı düşük rejimi takip edin: Hücreler bir kez (İçişleri Bakanlığı &lt;1), aksi V 0 daha küçük bir hacmi ile deneyi tekrar (en az) iki katına gerekir ekledi. Normal olarak, V, 0, 3 ml 0.5x10 6 hücre / ml &#39;lik bir yoğunlukta, Sf21 böcek hücreleri, 25 ml hastalık bulaştırmak için kullanılmıştır. Bu zararlı önlemek için şarttır ilgi heterolog genlerin kaybına neden olabilir virüs aşırı büyütmesi ve otomatik silme. Hücreleri peletleme ve virüs içeren medya kaldırarak 48-60 saat sonra hasat V 1 virüsü (25-50 ml). 6, 1x10 6 hücre her 12 veya 24 saat çıkarmadan peletleme ve protein üretimi ve işaretleyici protein (YFP) sinyali doğrulayarak. Tarafından YFP ve protein üretimi için taze medya ve test ile Ek, (virüs AmplifyV 2) daha büyük ifade hacimleri yukarıdaki düşük İçişleri Bakanlığı rejimi (hücreleri V 1 ile enfeksiyon sonrası en az bir kez çift gerekir) saygı V 1 virüsü ile 2 L Shaker şişeler 400 ml hücrelere kadar nüfuz ederek yöneliktir eğer. Sıkı artık ilgi genleri içeren kusurlu virüslerin birikmesini önlemek için amplifikasyon sırasında protein üretimi ve işaretleyici protein sinyal test edin. Her amplifikasyonlar de biriken 5-7 Kullanım hücre pelet ilgi ifade protein kompleksi için arıtma protokolü kurulması için zaten adım. </li><li> Üretim virüs BIIC depolama. Önemle kullanılarak üretim virüsü gibi V 2 virüs saklamak için tavsiye BIIC (B aculovirus-i C arşın nsect nfected) rekombinant virüs değişiklikler (ilgilenilen genin örneğin kayıp) önlemek ve yüksek ifade korumak için, yöntem seviyes çoğalması tutuklanmasının ardından 24 saat gözlenmektedir 16 Pelet enfekte hücreleri -. onlar medya içine (tomurcuklanma ile) serbest olacağını hemen önce bu aşamada hücre tam viral parçacıkların içerir. Sıvı nitrojen içinde ortam ve hücre taneciklerine dondurularak bölüntülerin ve süresiz saklayın. 7,16 </li></ol> 3. Protein Üretimi ve Aşağı İşleme <ol><li> Büyük (r) kültür ve izleme YFP enfekte. Üretim süreçleri (2 L şişeler içinde tipik olarak 400 ml) daha büyük hücre kültürleri bulaştırmak için V, 1, 2 veya dondurulmuş BIIC alikotları kullanın. Düşük İçişleri Bakanlığı rejimi (öyle ki enfekte kültürü en az bir kez iki katına enfeksiyon için kullanılan virüs ses seviyesini ayarlamak) uyun. Şişe sayısı çarpılarak gerekirse enfekte kültür hacimleri Büyüt. YFP işaretleyici protein varsa, belirli aralıklarla 1x10 6 hücre geri pelet ve hücreler lyse ve bir plato ind ulaşılana kadar YFP sinyal evrimi izlemekmaksimum yeniden birleştirici protein üretimi icating. YFP seviyeleri floresan sinyalleri (örneğin, Tecan SPECTRAFluor) kayıt kapasitesine sahip standart bir 96 çukurlu tabla okuyucusu ölçülebilir. Bu aşamada hücreler hasat. -20 ° C (kısa süreli) veya -80 mağaza hücre pelet ° C (uzun vadeli). </li><li> Hücre parçalama ve ayrıştırma. Protein gereksinimlerini (donma-çözülme, sonikasyon, Fransız basını, diğerleri) uygun seçtiğiniz favori yöntemi, hücreleri lyse. 5-7 damıtmak sitozol ve ilgi proteinlerin varlığı için çekirdek ve test. Protein saflaştırma basitleştirmek için sonuçlarına göre arıtma protokolü geliştirin. Sizin protein nükleus yerleşimli ise yüksek KCl koşullar altında nükleer fraksiyonu adresinin protein ayıklamak için nemlendirici yöntemler uygulanarak düşünün. 7,18 </li><li> Protein saflaştırma (mikro ölçekli, büyük ölçekli). Hücre kültürü genellikle küçük miktarlarda (10 ya da 25 mL) ile su olduğuna dikkatnedeniyle bakulovirüs / böcek hücre sistemleri (L kültür ve daha başına protein genellikle 10-100 mg), heterolog proteinlerin tipik olarak yüksek veya çok yüksek üretim seviyelerine ilgi proteinlerin önemli miktarda saflaştırılması için hücre pelletleri elde etmek için fficient. Mikro saflaştırma (yuvalı plakalarda, mikro tip yöntemler, GE Healthcare ÄKTAmicro sistemi, diğerleri) ile bağlantılı olarak bu biyokimyasal ve aktivitesi ile ilgili veriler ve genellikle de nanolitre ölçekli, yüksek verim kristalleştirme için istenilen proteinlerin ve kompleksleri yeterli miktarda (HTX elde etmek mümkündür .) Küçük iyon değişimi ve boyut dışlama kromatografisi ile bağlantılı olarak, saflaştırma kolaylaştırmak için kompleks, protein alt birimlerinin maruz metal afinite saflaştırma (Clonetech Takara Talon Qiagen NiNTA Metal kelat yapıcı reçineleri) ve bir oligo-histidin (6-10 kalıntıları) etiketi kullanılarak göz önünde Örneğin ÄKTAmicro veya benzer bir küçük hacimli arıtma makinesi (Şekil 4 ile hacimleri </stRong&gt;). Diğer yakınlık arıtma adımları ve oligo-histidin etiketleri veya diğer etiketleri ile yakınlık arıtma ek olarak iyon değişimi (IEX) adım (diğerleri GST, MBP, CBP, seçim) can ve düşünülmelidir, proteinlerin biyokimyasal özelliklerine göre ilgi ve bireysel tercihler. Arıtma verimi artırmak için afinite etiketleri ile etiketleme birden fazla altbirim düşünün. Sizin saflaştırılmış protein kompleksleri Konsantre ve gliserol olan veya olmayan dondurma gibi depolama protokolleri kurmak. Arıtılmış proteinlerin toplu-seri değişimi değerlendirmek için (etkinlik testleri, biyokimyasal ve biyofiziksel testler) standart olarak uygulanabilir kalite kontrol kriterleri geliştirin. </li></ol>

<ol><li>Nie, Y., Viola, C., Bieniossek, C., Trowitzsch, S., Vijay-Achandran, L. S., Chaillet, M., Garzoni, F., Berger, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Getting+a+Grip+on+Complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Genomics%22%5BJournal%5D)">Getting a Grip on Complexes.</a> Curr. Genomics. 10 (8), 558-572 (2009).</li>
<li>Robinson, C. V., Sali, A., Baumeister, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+sociology+of+the+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The molecular sociology of the cell.</a> Nature. 450 (7172), 973-982 (2007).</li>
<li>Kost, T. A., Condreay, J. P., Jarvis, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Baculovirus+as+versatile+vectors+for+protein+expression+in+insect+and+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells.</a> Nat. Biotechnol. 23 (5), 567-575 (2005).</li>
<li>Bieniossek, C., Imasaki, T., Takagi, Y., Berger, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MultiBac%3A+expanding+the+research+toolbox+for+multiprotein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem.+Sci%22%5BJournal%5D)">MultiBac: expanding the research toolbox for multiprotein complexes.</a> Trends Biochem. Sci. 37 (2), 49-57 (2012).</li>
<li>Fitzgerald, D. J., Berger, P., Schaffitzel, C., Yamada, K., Richmond, T. J., Berger, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+complex+expression+by+using+multigene+baculoviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Protein complex expression by using multigene baculoviral vectors.</a> Nat. Methods. 3 (12), 1021-1032 (2006).</li>
<li>Bieniossek, C., Richmond, T. J., Berger, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MultiBac%3A+multigene+baculovirus-based+eukaryotic+protein+complex+production%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">MultiBac: multigene baculovirus-based eukaryotic protein complex production.</a> Curr. Protoc. Protein Sci. Chapter 5, Unit 5.20(2008).</li>
<li>Trowitzsch, S., Bieniossek, C., Nie, Y., Garzoni, F., Berger, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+baculovirus+expression+tools+for+recombinant+protein+complex+production%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">New baculovirus expression tools for recombinant protein complex production.</a> J. Struct. Biol. 172 (1), 45-54 (2010).</li>
<li>Vijayachandran, L. S., Viola, C., Garzoni, F., Trowitzsch, S., Bieniossek, C., Chaillet, M., Schaffitzel, C., Busso, D., Romier, C., Poterszman, A., Richmond, T. J., Berger, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robots%2C+pipelines%2C+polyproteins%3A+enabling+multiprotein+expression+in+prokaryotic+and+eukaryotic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Robots, pipelines, polyproteins: enabling multiprotein expression in prokaryotic and eukaryotic cells.</a> J. Struct. Biol. 175 (2), 198-208 (2011).</li>
<li>Thomas, M. C., Chiang, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+general+transcription+machinery+and+general+cofactors%5BTitle%5D)+AND+%22Crit.+Rev.+Biochem.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The general transcription machinery and general cofactors.</a> Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 41 (3), 105-178 (2006).</li>
<li>Klinge, S., Voigts-Hoffmann, F., Leibundgut, M., Ban, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+structures+of+the+eukaryotic+ribosome%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem.+Sci%22%5BJournal%5D)">Atomic structures of the eukaryotic ribosome.</a> Trends Biochem. Sci. 37 (5), 189-198 (2012).</li>
<li>Melnikov, S., Ben-Shem, A., Garreau de Loubresse, N., Jenner, L., Yusupova, G., Yusupov, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One+core%2C+two+shells%3A+bacterial+and+eukaryotic+ribosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">One core, two shells: bacterial and eukaryotic ribosomes.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 19 (6), 560-567 (2012).</li>
<li>Cramer, P., Bushnell, D. A., Fu, J., Gnatt, A. L., Maier-Davis, B., Thompson, N. E., Burgess, R. R., Edwards, A. M., David, P. R., Kornberg, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Architecture+of+RNA+polymerase+II+and+implications+for+the+transcription+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Architecture of RNA polymerase II and implications for the transcription mechanism.</a> Science. 288 (5466), 640-649 (2000).</li>
<li>Berger, I., Fitzgerald, D. J., Richmond, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Baculovirus+expression+system+for+heterologous+multiprotein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Baculovirus expression system for heterologous multiprotein complexes.</a> Nat. Biotechnol. 22 (12), 1583-1587 (2004).</li>
<li>Bieniossek, C., Nie, Y., Frey, D., Olieric, N., Schaffitzel, C., Collinson, I., Romier, C., Berger, P., Richmond, T. J., Steinmetz, M. O., Berger, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+unrestricted+multigene+recombineering+for+multiprotein+complex+production%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Automated unrestricted multigene recombineering for multiprotein complex production.</a> Nat. Methods. 6 (6), 447-450 (2009).</li>
<li>Nie, Y., Bieniossek, C., Frey, D., Olieric, N., Schaffitzel, C., Steinmetz, M. O., Berger, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ACEMBLing+multigene+expression+constructs+by+recombineering%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protocols%22%5BJournal%5D)">ACEMBLing multigene expression constructs by recombineering.</a> Nat. Protocols. , (2009).</li>
<li>Wasilko, D. J., Lee, S. E., Stutzman-Engwall, K. J., Reitz, B. A., Emmons, T. L., Mathis, K. J., Bienkowski, M. J., Tomasselli, A. G., Fischer, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H.D.+titerless+infected-cells+preservation+and+scale-up+%28TIPS%29+method+for+large-scale+production+of+NO-sensitive+human+soluble+guanylate+cyclase+%28sGC%29+from+insect+cells+infected+with+recombinant+baculovirus%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expr.+Purif%22%5BJournal%5D)">H.D. titerless infected-cells preservation and scale-up (TIPS) method for large-scale production of NO-sensitive human soluble guanylate cyclase (sGC) from insect cells infected with recombinant baculovirus.</a> Protein Expr. Purif. 65 (2), 122-132 (2009).</li>
<li>Chao, W. C., Kulkarni, K., Zhang, Z., Kong, E. H., Barford, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+mitotic+checkpoint+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of the mitotic checkpoint complex.</a> Nature. 484 (7393), 208-213 (2012).</li>
<li>Yamada, K., Frouws, T. D., Angst, B., Fitzgerald, D. J., DeLuca, C., Schimmele, K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+mechanism+of+the+chromatin+remodelling+factor+ISW1a%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure and mechanism of the chromatin remodelling factor ISW1a.</a> Nature. 472 (7344), 448-453 (2011).</li>
</ol>

IB, burada açıklanan teknoloji parçaları ayrıntılı patent ve patent uygulamaları mucit.

Şekiller 2 ve 3&#39;te ek video görüntüleri çoklu gen ifade cDNA&#39;dan robot yardımıyla kuşaktan tüm süreci gösteren protein üretimi için bir böcek hücresi kültürlerinin enfeksiyon tüm yol oluşturur. Yeni reaktifler (plazmid ve virüs) ve sağlam protokolleri SOPler dayanarak bir boru hattı sağlamak için geliştirilmiştir. Tüm boru hattı Grenoble EMBL bir platform teknolojisi olarak uygulamaya konmuştur. MultiBac platformu multiprotein araştırma yapan akademik ve sanayi birçok bilim adam...

Biyolojik aktivite protein ve hücresel fonksiyonları katalize uyum içinde hareket diğer biyomoleküllerin meclisleri tarafından kontrol edilir. Önemli örnekler mesajcı RNA DNA bulunan kalıtsal bilgi transkripsiyonun makine içerir. İnsanlarda, 100&#39;den fazla protein olan RNA polimeraz II ve bu TFIID, ve diğerleri gibi TFIIH genel transkripsiyon faktörlerini içerir. 9 Diğer örnekler de dahil olmak üzere 10 ve daha fazla alt-birimleri ile büyük multiprotein kompleksleri oluşturarak, gen transkripsiyonu için bir tanımlanmış ve regülasyonuyla bir araya gelip ribozom, protein sentezi, ya da ökaryotlarda çekirdek zarı yoluyla biyomoleküllerin mekik sorumludur nükleer gözenek kompleks katalize birçok protein ve RNA molekülleri arasında oluşur. Hücrede aslında tüm bileşenli makineleri ayrıntılı bir mimari ve biyokimyasal diseksiyon işlevlerini anlamak için çok önemlidir. Prokaryotik ve eukar yapısı aydınlatılmasıyotic ribozomlar, örneğin, bu makromoleküler makineleri hücre n belirlenen işlevlerini yerine nasıl içine görülmemiş fikir veren damgasını olaylar oluşturmuştur. 10,11 Ribozomlar hücre kütlesinin% 30&#39;u ribozomların oluşması nedeniyle, kültürlenmiş hücrelerden endojen malzeme saflaştırılmasıyla detaylı bir çalışma için yeterli kalitede ve miktarda elde edilebilir. RNA polimeraz II diğer önemli kompleksler ezici çoğunluğu ancak mevcut zaten maya kültürü daha az büyüklükte siparişleri ile bol ve birçok bin litredir transkripsiyon merkezi bu temel karmaşık ayrıntılı bir atom görünümü elde etmek için işlenecek vardı. 12 böylece yerli hücrelerinde olmuş, ve çok daha düşük miktarda yerel kaynak malzemeden yeterli saflaştırılmış edilemez. Ayrıntılı yapısal ve fonksiyonel analiz için erişilebilir bu tür kompleksleri işlemek için rekombinant te kullanarak heterolog üretim gerektirirchniques. Rekombinant protein üretimi yaşam bilim araştırma üzerinde önemli bir etkisi vardı. Birçok protein yeniden birleştirilerek üretilen ve kendi yapısı ve işlevi yüksek çözünürlükte disseke edildi. Yapısal genomik programları yüksek verimli (HT) modda tüm organizmaların gen ürünü repertuar yönelik birçok organizmaların genomları en aydınlatılması yararlanmaktadır. Protein yapılarının Binlerce böylece belirlenmiştir. Bugüne kadar, yeniden birleştirici protein üretimi için en çok üretken kullanılan sistem E. olmuştur coli ve birçok ekspresyon sistemleri bu ev sahibi heterolog üretimi için yılda gelişmiş ve rafine edilmiştir. E. protein üretimini sağlamak için işlevleri bir bolluk barındıran plazmid coli ticari sağlayıcılarının tüm katalogları doldurun. Bununla birlikte, E. coli birçok ökaryotik protein üretmek için uygun yapmak bazı sınırlamaları vardır ve pçok sayıda alt-birimleri ile eklem protein kompleksleri. Bu nedenle, ökaryotik ana protein üretimi giderek son yıllarda tercih edilen yöntem haline gelmiştir. Ökaryotik proteinler üretmek için özellikle çok uygun sistem laboratuarda yetiştirilir böcek hücresi kültürleri bulaştırmak için, heterolog genleri taşıyan bir rekombinan bakulovirüs dayanır bakulovirüs ekspresyon vektörü sistemine (BEVs) &#39;dir. MultiBac sistem özellikle birçok alt birimden (Şekil 1) ile ökaryotik protein komplekslerinin üretimi için uygun olan, daha yakın zamanda geliştirilmiş BEVs olup. MultiBac ilk olarak 2004 yılında tanıtıldı. 13 tanıtılmasından bu yana, MultiBac sürekli geliştirildi ve kullanımı kolaylaştırmak hedef protein kalitesini artırmak ve genel olarak verimli standart operasyon prosedürleri (SOP) tasarlayarak uzman olmayan kullanıcılar için sistem erişilebilir hale getirmek için dere-astarlı. 4 MultiBac ac içinde, dünya çapında birçok laboratuvarda uygulamaya konmuşturademia ve sanayi. Grenoble EMBL de, uluslararası erişim programları araştırma ilerleyen bu üretim sistemi kullanmak isteyen bilim adamları için MultiBac platformda uzman eğitim vermek için Avrupa Komisyonu tarafından uygulamaya konuldu. Onlar EMBL Grenoble de MultiBac tesisinde operasyonda olduğu gibi şimdiye kadar erişilebilir değildi birçok protein komplekslerinin yapısı ve fonksiyonu MultiBac ile üretilen numuneler kullanılarak aydınlatıldı. 4 Aşağıda, MultiBac üretim önemli adımlar protokolleri özetlenmiştir.

<table><tbody><tr><td>Bluo-Gal</td><td>Invitrogen</td><td>15519-028 (1 g)</td><td></td></tr> <tr><td>Tetrasiklin</td><td>Euromedex</td><td>UT2965-B (25 g)</td> <td>10 mg / ml'de 1.000X</td></tr><tr><td>Kanamisin</td><td>Euromedex</td><td>EU0420 (25 g)</td> <td>50 mg / ml'de 1.000X</td></tr><tr><td>Gentamisin</td><td>SIGMA</td><td>G3632 (5 g)</td> <td>10 mg / ml'de 1.000X</td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Euromedex</td><td>EU0008-B (5 g)</td> <td>1M'de 1.000X</td></tr><tr><td>Cre-rekombinaz</td><td>New England BioLabs</td><td>M0298</td><td></td></tr><tr><td>X-Treme GENE HP transfeksiyon reaktifi</td><td>Roche</td><td>06 366 236 001</td><td></td></tr><tr><td>Hyclone SFM4 Böcek</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH 30913.02</td><td></td></tr><tr><td>6 oyuklu plaka Falcon</td><td>Dominique Dutscher</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>2 ml pipet Falcon</td><td>Dominique Dutscher</td><td>357507</td><td></td></tr><tr><td>5 ml pipet Falcon</td><td>Dominique Dutscher</td><td>357543</td><td></td></tr><tr><td>10 ml pipet Falcon</td><td>Dominique Dutscher</td><td>357551</td><td></td></tr><tr><td>25 ml pipet Falcon</td><td>Dominique Dutscher</td><td>357535</td><td></td></tr><tr><td>50 ml pipet Falcon</td><td>Dominique Dutscher</td><td>357550</td><td></td></tr><tr><td>50 ml tüp Falcon</td><td>Dominique Dutscher</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>15 ml tüp Falcon</td><td>Dominique Dutscher</td><td></td><td></td>352096</tr><tr><td>1.8 ml kriyotüp Nunc</td><td>Dominique Dutscher</td><td>55005</td><td></td></tr><tr><td>100 ml çalkalayıcı şişeler Pyrex</td><td>Dominique Dutscher</td><td>211917</td><td></td></tr><tr><td>250 ml çalkalayıcı şişeler Pyrex</td><td>Dominique Dutscher</td><td>211918</td><td></td></tr><tr><td>500 ml çalkalayıcı şişeler Pyrex</td><td>Dominique Dutscher</td><td>211919</td><td></td></tr><tr><td>2 L çalkalayıcı şişeler Pyrex</td><td>Dominique Dutscher</td><td></td><td></td>211921</tr><tr><td>Certomat Orbital Çalkalayıcı + plato</td><td>Sartorius</td><td>4445110, 4445233</td><td></td></tr><tr><td>Sıvı nitrojen tankı dewar 35 L</td><td>Fisher Scientific</td><td>M76801</td><td></td></tr><tr><td>Biyolojik Güvenlik Kabini Daha Hızlı</td><td>Sodipro</td><td>FASV20000606</td><td></td></tr><tr><td>Optik Mikroskop</td><td>Zeiss</td><td>451207</td><td></td></tr><tr><td>Sf21 Böcek hücreleri</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hi5 Böcek hücreleri</td><td>Invitrogen</td><td>B855-02</td><td></td></tr><tr><td>Tecan freedom EVO, Evoware plus</td><td>TECAN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 &mu çalıştırıyor; l iletken uçlar (siyah),</td> <td>TECAN</td><td>10 612 516</td><td></td></tr><tr><td>200 &mu; l iletken uçlar (siyah)</td><td>TECAN</td><td>10 612 510</td><td></td></tr><tr><td>reaktifler için tek kullanımlık oluk, 100 ml</td><td>TECAN</td><td>10 613 049</td><td></td></tr><tr><td>twin.tec PCR plakası 96, etekli</td><td>Eppendorf</td><td>0030 128.648</td><td></td></tr><tr><td>96 kuyulu V alt, steril olmayan</td><td>BD şahin</td><td>353263</td><td></td></tr><tr><td>96 derin kuyu plakası rengi doğal, PP)</td><td>Fisher</td><td>M3752M</td><td></td></tr><tr><td>PS mikroplaka, 96 kuyu düz tabanlı</td><td>Greiner</td><td>655101</td><td></td></tr><tr><td>96 derin kuyu plakası</td><td>Thermo scientific</td><td>AB-0932</td><td></td></tr><tr><td>24 kuyu bloğu RB</td><td>Qiagen</td><td>19583</td><td></td></tr><tr><td>DpnI kısıtlama enzimi</td><td>NEB</td><td>R0176L</td><td>20 U/uL</td></tr><tr><td>NEBuffer 4 10X</td><td>NEB</td><td>B7004S</td><td></td></tr><tr><td>2X phusion mastermix HF</td><td>Finnzyme</td><td>ref F-531L</td><td></td></tr><tr><td>2X phusion mastermix GC</td><td>Finnzyme</td><td>ref F-532L</td><td></td></tr><tr><td>DGLB 1.5X</td><td>ev yapımı</td><td></td><td>%7.5 gliserol, %0.031 Bromofenol mavisi, %0.031 Ksilen siyanol FF</td></tr><tr><td>e-jel Yaşam Teknolojileri için Yüksek DNA Kütle Merdiveni</td><td></td><td>10496-016</td><td></td></tr><tr><td>E-jel Yaşam Teknolojileri için Düşük DNA Kütle Merdiveni</td><td></td><td>10068-013</td><td></td></tr><tr><td>E-jel 48 %1 agaroz GP</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>G8008-01</td><td></td></tr><tr><td>Nucleo Spin- robot-96 plazmid kiti</td><td>Macherey Nagel</td><td>740 708.24</td><td></td></tr><tr><td>PCR temizleme kiti, Nucleospin Robot-96 Özü</td><td>Macherey Nagel</td><td>740 707.2</td><td></td></tr><tr><td>Gotaq yeşil ana karışımı</td><td>Promega</td><td>M7113</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA polimeraz, LIC nitelikli</td><td>Novagen</td><td>70099-3</td><td></td></tr><tr><td>DTT 100 mM</td><td>ev yapımı</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Üre 2 M</td><td>ev yapımı</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EDTA 500 mM pH 8.0</td><td>Ev yapımı</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LB suyu (Miller) 500 g</td><td>Athena ES</td><td>103</td><td></td></tr></tbody></table>

embl de multibac protein complex Üretim platformu

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

Proteomics araştırmalar benzeri görülmemiş ayrıntılı olarak ökaryot proteomlarda etkileyici karmaşıklığı ortaya çıkardı. Şimdi hücrelerdeki protein soyutlanan varlıklar olarak değil var ama çoğu değilse tüm hayati fonksiyonları için hücrede montaj hatları oluşturan, insanlar on veya daha fazla, pek çok diğer proteinler ile birlikte biyolojik aktivite uygulamayın bir genel kabul gören bir kavramdır. 1 , bu multiprotein meclislerin işlevi ve mimarisi 2 Bilgi detaylı analiz için üstün kalite ve yeterli miktarda kendi ayrılmasını gerektiren. Hücreleri içinde birçok protein kompleksleri yetersizliği, ökaryotlarda, özellikle doğal kaynaklardan ekstraksiyon yasaklar, ve rekombinant üretim gerektirir. Bakulovirüs ekspresyon vektör sistemi (BEVs) ökaryotik proteinler üretmek için özellikle yararlı olduğu kanıtlanmıştır, ve aktivite genellikle translasyon sonrası işleme dayanan yaygın olarak kullanılan diğer ekspresyon sistemleri genellikle mümkün olduğudesteklemez. 3 BEVs ilgilenilen genin da tercih edilen bir proteini üretmek böcek hücresi kültürleri enfekte içine eklenmiş bir rekombinan bakulovirüs kullanın. MultiBac özellikle birçok alt birimleri içeren ökaryotik protein kompleksleri üretimi için özel olan bir BEVs olduğunu. 4 verimli proteinlerin üretimi ve kompleksleri için hayati bir ön koşul ideal olarak uygulanabilir bir ifade deneyde ilgili tüm adımlar için sağlam protokolleri standart operasyon prosedürleri (SOP) ve karşılaştırmalı kolaylıkla uzman olmayan kullanıcılar tarafından da takip. Avrupa Moleküler Biyoloji Laboratuarı (EMBL) de platformun MultiBac proteinin küçük ölçekli analizlerine heterolog protein üretimi özellikleri için optimize edilmiş bir mühendislik bakuloviral genlerin genomun içine sokulmasını başlayarak, bir multiprotein karmaşık ifade deney ile ilgili tüm adımlar için SOP kullanır üretilen numuneler. 5-8 platformuEMBL Grenoble bir açık erişim modunda yüklenir ve akademi ve protein kompleksi araştırma projeleri hızlandırmak için sanayiden birçok bilim adamı desteklemiştir.

MultiBac sistemiyle elde heterolog proteinlerin güçlü ortak ifade Şekil 1d (süspansiyonuna hücre kültürü bulaşmasını 48 saat sonra alınan probları) &#39;de gösterilmiştir. Aşırı ekspresyona uğramış protein bantları tüm hücre ekstresi (SNP) ve temizlenir lizat (SN) açıkça görülebilir. Üretilen protein malzeme kalitesi ve miktarı genellikle Şekil 1e gösterilen bu mitotik kontrol noktası karmaşık MM gibi protein kompleksleri, yapısı tespitine imkan vermek yeterlidir. 17 <p c...

Protein kompleksleri önemli hücre fonksiyonlarını katalize eder. Birçok temel komplekslerinin detaylı fonksiyonel ve yapısal karakterizasyonu rekombinant üretimi gerektirir. MultiBac özellikle ökaryotik protein ve kompleksleri ifade etmek için özel bir bakülovirüs / böcek hücre sistemidir. MultiBac açık erişim platformu ve faydayı maksimize için geliştirilmiş standart çalışma prosedürleri olarak uygulanmıştır.

EMBL de MultiBac Protein Complex Üretim Platformu

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

Bu prosedürün genel amacı, multi baculovirus böcek hücresi sistemini kullanarak protein kompleksleri üretmektir. Bu işlem, öncelikle seçilen protein kompleksini kodlayan çoklu gen konstrüktünün oluşturulmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, bakteriyel hücrelerin transforme edilmesi ve doğru bacmidlerin taranması yoluyla çoklu gen konstrüktünü içeren kompozit bir baculovirus üretmektir.Ardından, baula viral genomunu izole edin ve protein üretimini test ettikten sonra, bunu altı kuyucuklu bir plakada küçük ölçekte böcek hücrelerini enfekte etmek için kullanın. Seçilen protein kompleksi daha büyük ölçekte eksprese edilir ve saflaştırılır. Son olarak, saflaştırılmış protein kompleksi, yapısını ve işlevini keşfetmek ve potansiyel olarak ilaç keşfi yapmak için kullanılır.Bu tekniğin mevcut ekovirus sistemlerine göre temel avantajları iki yönlüdür. MultiPro kompleksleri benzeri görülmemiş bir kapasiteyle üretilebilir. Ayrıca, ekovirusu optimal protein üretimi için geliştirdiğimizden, üretilen materyal çok daha yüksek kalitededir.Bu tekniğin etkileri, temel biyolojik soruların çok ötesine uzanmaktadır. Çok torbalı platformumuz, çeşitli hastalıklar için gelecek vaat eden yeni aşı adayları olan proteinlerin üretilmesinde ve tümör büyümesine neden olan temel protein komplekslerini üreterek kanser araştırmalarını hızlandırmada başarıyla kullanılmıştır. Genel olarak, bu yöntemde yeni olan kişiler, süreçlerle ve sterilite gerekliliğiyle ilgili biraz zorluk yaşayabilirler.Uzman olmayan kullanıcılar için multi-bank uygulamasını mümkün olduğunca kolaylaştırmak amacıyla standart çalışma prosedürlerini oluşturmak için çok yoğun çalıştık. Süreç hareket halindeyken gösterildiğinde robotik adımlar çok daha kolay anlaşıldığından, bu yöntemin görsel olarak gösterimi kritik öneme sahiptir. Bunu, ne kadar ayrıntılı yazılmış olursa olsun, sadece yazılı protokollere bakarak elde edemezsiniz.Bu prosedüre başlamadan önce, ko-ekspresyon stratejisinin dikkatle planlanması önemlidir. Deneyin öncelikle in silico olarak simüle edilmesi önerilir.Genlerin akseptör ve donör plazmidlere dağıtılması gerekir. Fizyolojik alt modüller oluşturabilecek alt birimlerin birlikte gruplandırılması en iyi sonucu verir. Büyük kompleksler çok sayıda protein alt birimine sahip olduğundan, birçok genin eş zamanlı olarak eksprese edilmesi gerekir.MultiBac sistemi, Cre rekombinaz enzimi tarafından tanınan lox P adlı kısa bir DNA dizisi içeren küçük DNA öncül moleküllerine genleri yerleştirmek için otomatik rutinler kullanarak gen klonlamayı büyük ölçüde kolaylaştırır. Bu öncüller daha sonra, lox P bölgesine sahip olan her şeyi tek bir büyük DNA plazmidi şeklinde birbirine ekleyen Cre rekombinaz eklenerek tek adımlı bir reaksiyonda birleştirilir. Bu çoklu gen konstrütü daha sonra MultiBac baculovirus genomuna yerleştirilir.Çok sayıda konstrükt üretilecekse, robotik scriptlerin ve bir sıvı transfer istasyonunun kullanımı önerilir. İstasyon; mini preparatlar ve PCR temizleme işlemleri için bir vakum sistemine, PCR örneklerinin otomatik yüklenmesi için bir EEL'e, PCR ve inkübasyon adımları için bir termosikletöre, hücreleri resüspand etmek için bir çalkalayıcıya ve soğutma bloklarına sahiptir.Enzimler için, ilgi duyulan genler, restriksiyon enzimleri ve ligaz kullanılarak veya alternatif olarak ligasyon bağımsız yöntemler kullanılarak seçili donör ve akseptörlere aktarılır; tüm donör ve akseptör konstrüktları restriksiyon haritalama ve dizileme ile klonlanarak doğrulanır. Seçilen çoklu gen ekspresyon konstrüktlarını oluşturmak için CRE LAX P rekombinasyonu ile donör akseptör kombinasyonları yürütülür. Birleştirilen çoklu gen konstrüktları, özel olarak tasarlanmış primer setleri ile analitik PCR reaksiyonları kullanılarak doğrulanır.Robot destekli TR sürecinin anlık görüntüleri burada gösterilmektedir. Bunlar arasında çok kuyucuklu plakalarda PCR reaksiyonlarının hazırlanması, kalıp DNA ve primerlerin sağlanması, DNA'ların PCR amplifikasyonu ve bakteriyel kültürde büyütülen çok genli konstrüktların çok kuyucuklu plakalarda alkali lizis ile hazırlanması yer almaktadır. Bu prosedüre başlamak için, viral genomu ve TN seven transpozisyonu için gerekli işlevselliği barındıran DH 10 hücrelerine transformasyon yaparak çok genli transfer vektörlerini çok bula viral genomuna entegre edin.İlgi duyulan genleri içeren kompozit baula virüsüne sahip TN seven transpozisyon hücreleri, mavi-beyaz tarama ile seçildikten sonra, başarılı TN seven transpozisyonu beta galaktosidazın alfa komplementasyonunun kaybıyla sonuçlanır. Bu nedenle, doğru TN seven transpozisyonuna sahip koloniler, xal içeren seçici APL'lerde beyaz kalır. Beyaz kolonilerden bakteri kültürleri hazırlayın ve alkali lizis ile etanol isopropanol çöktürmesi yoluyla backin'i izole edin.Ardından, saflaştırılmış bao viral genomu ile böcek hücrelerini transfekte etmek için steril bir kabin içinde çalışarak, log fazındaki SF 21 böcek hücrelerinden alikotları altı kuyucuklu bir doku kültürü plağına ekleyin. Her bir kuyucuğa, kültür ortamında karıştırılmış saflaştırılmış bao viral genomu ve bir transfeksiyon reaktifi ekleyin. Transfekte edilen hücreleri 27 °C'de, sarsmadan 48 ila 60 saat boyunca inkübe edin.48 ila 60 saat sonra, besiyerini uzaklaştırıp taze besiyeri ile yenileyerek başlangıç virüsünü veya V sıfırı hasat edin ve plakayı inkübatöre geri yerleştirin; iki ila üç gün sonra protein üretimi için test yapın. Eğer bir YFP markörü mevcutsa, virüs amplifikasyonu için floresans testi yapın. Orbital bir platformda sallanan küçük erlenmeyer çalkalayıcı flasklarda log fazındaki 25 ila 50 mililitre hücreyi enfekte etmek için başlangıç virüsü olan V sıfırı kullanın.Çalkalayıcı kullanarak hücreleri sayın ve hücreler ikiye katlanmayı bırakana kadar her 24 saatte bir bölünmelerini sağlayın. Düşük bir enfeksiyon çokluğu veya MOI rejimini takip edin; hücreler en az bir kez ikiye katlanmalıdır, aksi takdirde deneyi daha küçük bir V sıfır hacmi ekleyerek tekrarlayın. Soldaki görüntü, multi back baula virus ile enfekte edildikten sonraki enfekte olmamış böcek hücrelerini göstermektedir.Sağdaki görüntüde gösterildiği üzere, enfekte olmuş böcek hücreleri çoğalmayı durdurmuş ve boyutları artmıştır. 48 ila 60 saat sonra, hücreleri çöktürerek V1 virüsünü hasat edin. Virüs içeren medyumu uzaklaştırın ve saklayın.Süspandeki hücreleri taze medya ile yeniden süspanse edin ve erlenmeyer flaskına geri aktarın. Daha yüksek ekspresyon hacimleri isteniyorsa, her 12 veya 24 saatte bir pelletleme yoluyla 1x10⁶ hücre alarak protein üretimi ve marker protein sinyali için test edin. İki litrelik çalkalamalı flasklardaki 400 mL'ye kadar olan hücreleri V1 virüsü ile enfekte ederek virüsü daha fazla amplifiye edin.Düşük MOI rejimi sonrası, rekombinant virüsün modifikasyonlarını önlemek ve yüksek ekspresyon seviyelerini korumak için V1 virüsünün, ular virüsle enfekte edilmiş böcek hücreleri veya VIC yöntemleri kullanılarak üretim virüsü olarak saklanmasını şiddetle öneririz. Proliferasyon durması gözlemlendikten 24 saat sonra enfekte hücreleri pelitleyin. Bu aşamada hücreler, medyuma salınmadan hemen önceki tam viral partikülleri içermektedir.Besiyerini uzaklaştırın, hücre peletini dondurma çözeltisi içinde yeniden süspande edin ve protein üretim süreçleri için BIIC'nin kriyotüplerde dondurma işlemini gerçekleştirin. Daha büyük hücre kültürlerini enfekte etmek için V bir V iki veya dondurulmuş BIC alikotlarını kullanın. Genellikle iki litrelik flasklarda bulunan 400 mililitre için düşük MOI rejimine bağlı kalınır.Enfekte kültürün en az bir kez iki katına çıkmasını sağlayacak şekilde enfeksiyon için kullanılan virüs hacmi ayarlanır. Eğer bir YFP marker proteini mevcutsa, belirlenmiş aralıklarla 1x10⁶ hücre çekilir, hücreler sonikasyon işlemine tabi tutulup santrifüj edilir ve 96 kuyucuklu bir plakaya aktarılır; floresan sinyalleri kaydedebilen standart bir 96 kuyucuklu plaka okuyucu ile YFP seviyeleri ölçülür. Maksimum rekombinant protein üretimine işaret eden bir plato seviyesine ulaşılana kadar YFP sinyalinin seyri izlenir. Hücreler bu aşamada hasat edilir; hücre peletleri kısa süreli saklama için -20 °C'de veya uzun süreli saklama için -80 °C'de depolanır. Hücreler, proteinin gereksinimlerine göre özelleştirilmiş bir yöntemle lize edilmeli ve ardındanlele sitozol ve çekirdekler ayrıştırılmalıdır.Fraksiyonlanmış nükleer proteinler tipik olarak nükleer pelet içinde bulunur. Sitosolik proteinler ise sitozolde kalır. Protein saflaştırma işlemi, fraksiyonlama ile büyük ölçüde kolaylaşır.Çoğu kontaminant tek bir santrifüjlemede uzaklaştırılabildiği için, çok kuyucuklu veya mikro uç tabanlı saflaştırma gibi minyatürize edilmiş yöntemler kullanılarak protein kompleksleri küçük ölçekli başlangıç hücre kültürlerinden kolaylıkla saflaştırılabilir. ACTA micro gibi küçük hacimli kromatografi sistemleri ile birlikte, bir sonraki adım, tüm deneysel düzeneği klonlama iş istasyonu ile etkileşimli çalışan, masaüstü boyutunda küçük bir uygulamaya indirgemek ve entegre etmek olacaktır.Burada, bu amaçla kullanılacak olan ve şu anda geliştirilme aşamasında olan mikro ölçekli batch robotu gösterilmektedir. Heterolog proteinlerin güçlü ko-ekspresyonu, burada gösterildiği gibi çoklu geri besleme sistemi ile sağlanmaktadır. Aşırı eksprese edilen protein bantları, tüm hücre ekstraktında (WCE) ve temizlenmiş lizatta net bir şekilde seçilebilmektedir.Üretilen protein materyalinin kalitesi ve miktarı genellikle yeterlidir. Bu diyagramda gösterilen mitotik kontrol noktası kompleksi (MCC) gibi protein komplekslerinin yapısal olarak belirlenmesine olanak tanır. Bu analitik saflaştırma işlemlerinden elde edilen verim, saflaştırılmış kompleksin yapısının ve işlevinin elektron mikroskobu da dahil olmak üzere çeşitli yöntemlerle analiz edilmesi için genellikle yeterlidir.Geliştirdiğimiz standart uygulama prosedürleri, uzman olmayan kullanıcıların yaklaşımımızı kolaylıkla uygulamasına olanak tanır ve teknolojimiz, tıpkı günümüzde Nikola'da küçük proteinler için olduğu gibi, büyük protein kompleksleriyle ilgilenen birçok laboratuvarda kullanılabilir. Bu videoyu izledikten sonra, iddialı araştırma hedefleriniz için ilgilendiğiniz protein komplekslerini eşsiz miktarda ve kalitede üretmek amacıyla multi bag sistemini nasıl kullanacağınız konusunda iyi bir anlayış kazanmış olmalısınız. Sistemlerimizle çalışmak özel güvenlik koşulları gerektirmez.Bununla birlikte, virüs hücrelerinizde replike olmayacak olsa bile, dikkatsiz davranmanız durumunda sizi enfekte edebileceğini unutmayın. Bu nedenle, bu prosedürü gerçekleştirirken steril koşullara dikkat etmek zorunludur. Yöntemimiz, dünya çapında 600'den fazla laboratuvarda halihazırda oldukça popüler hale gelmiştir.Tekniğimizi kullanın. Gelecekte, yöntemimizin insan kompleks bölgesini ele alan geniş ölçekli yapısal genomik çalışmaların ayrılmaz bir parçası haline geleceğine inanıyoruz. Bu, hastalıkların temelini ortaya çıkarmaya yardımcı olabilir ve uzun vadede yeni ve daha iyi ilaçlar ile tedavilere yol açabilir.

the-multibac-protein-complex-production-platform-at-the-embl

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Protein terapötikler üretmek için hücre hattı geliştirme, üretim, yüksek verimlilik, otomatik bir platform açıklanmıştır. Uygulama, BD FACS Aria Hücre Sıralayıcısı CloneSelect Imager ve Tecan Özgürlük EVO sıvı taşıma sistemi, gelişmiş hücre hattı kalite ve yüksek tekrarlanabilirlik hücre hattı geliştirme işleme kapasitesi önemli ölçüde artış göstermiştir.

Protein Therapeutics İmalat Hücre Hatları Kalkınma Yüksek throughput Otomatik Platformu

Post-insan genomik dönemde, yerli konformasyonlar rekombinant protein durumu, yapısal, işlevsel ve tedavi araştırma ve geliştirme için çok önemlidir. Burada, bir test-ve rekombinant proteinlerin çeşitli üretmek için kullanılan insan embriyonik böbrek hücreleri 293T büyük ölçekli proteini ifade sistemi açıklamaktadır.

İnsan Hücrelerden salgılanan Proteinlerin Üretimi için Kullanışlı ve Genel Anlatım Platformu

Kütle spektrometrisi (antipersonel mayınları) ile kombinasyon halinde etiketli proteinlerin saflaştırılması Affinity protein etkileşimi ağların sistematik eşleme için ve biyolojik süreçlerin mekanistik temeli araştırmak için güçlü bir yöntem. Burada, bakteri için geliştirilmiş optimize edilmiş sıralı peptid afinite (SPA) antipersonel mayınları prosedürü...

Protein Kompleksi belirlenmesi<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Tandem Kütle Spektrometresi ile Kombine Sıralı Peptid Affinity Arıtma kullanarak

Yapı-esaslı ecza tasarımı ilaç gelişmesinde önemli bir rol oynar. Paralel olarak birden çok hedef edinerek büyük ölçüde kurşun keşfi için başarı şansını artırır. Aşağıdaki makale Enfeksiyon Hastalıkları için Seattle Yapısal Genomik Merkezi PB2 influenza A alt birimi gen-için-yapı tayini için bir çoklu hedef yaklaşım kullanır nasıl vurgulamaktadır.

Grip Polimeraz Gen-to-yapı belirlenmesi PB2 alt birimi için çoklu hedef Paralel İşleme Yaklaşımı

Protein ko-ekspresyonu, protein komplekslerinin in vitro olarak yeniden yapılandırılmasına güçlü bir alternatiftir ve in vivo biyokimyasal ve genetik testlerin gerçekleştirilmesinde yardımcı olur. Burada, protein kompleksleri elde etmek ve hücrelerin mutasyon frekansını ayarlamak için Escherichia coli'de protein ko-ekspresyonunun kullanımını rapor ediyoruz.

Protein birlikte-ifade edilme yönlü Faydalar<em&gt; Escherichia coli</em

Bu çalışma, pMGX plazmid sistemini kullanarak Escherichia coli'de tek bir plasmidden çoklu genlerin T7 aracılı co-ekspresyonu için yöntemleri açıklamaktadır.

İndüklenebilir T7 RNA Polimeraz aracılı Çok Boylu İfade Sistemi, pMGX

stabilize edici ve yeni bir iki boyutlu poliakrilamit jel elektroforez bağlanmış bir amin-reaktif protein çapraz bağlayıcı kullanılarak modifiye edilmemiş doku lizattan doğal protein kompleksleri ayırmak için bir yöntem olup (PAGE) sistemi sunulmuştur.

Multimer-PAGE: Biyolojik örnekler olarak yakalamak için bir yöntem ve özümleme protein kompleksleri

Bu el yazması Bimolecular uluslara benzeşme arıtma (BiCAP) protokolünü açıklar. BM complexed bireysel proteinler hem de konut projeleri hariç rakip bağlama ortaklarıyla oluşan iken bu roman yöntemi belirli yalıtım ve aşağı akım proteomik karakterizasyonu herhangi bir iki etkileşen proteinlerin kolaylaştırır.

Bimolecular tamamlayıcı benzeşme arıtma (BiCAP) tarafından parçalanmış çok protein sinyal kompleksleri

Bu iletişim kuralı adımları, maliyetleri ve ekipman E. colioluşturmak için gerekli ayrıntıları-hücre özleri dayalı ve 4 gün içinde veya daha az vitro protein sentez reaksiyonları uygulamak. Bu platformun geniş uygulamalar için esnek yapısı kullanabilmeniz için biz uyarlanmış ve en iyi duruma getirilmiş reaksiyon koşulları tartışıyorlar.

Escherichia coli-boş hücre Protein sentezi dayalı: sağlam, esnek ve erişilebilir platform teknolojisi için iletişim kuralları

Baculovirüs ekspresyon vektör sistemi (BEVS), biyokimyasal, biyofiziksel ve yapısal çalışmalarda kullanılacak protein arginin metiltransfenazlarının (PRMT) ekspresyon taraması ve üretimi için sağlam bir platformdur. Milligram miktarda malzeme, ökaryotik bir ifade platformu gerektiren PRMT'lerin ve diğer ilgi proteinlerinin çoğunluğu için üretilebilir.

Baculovirüs Ekspresyon Vektör Sistemi Kullanılarak Rekombinant PRMT Proteinlerinin Üretimi

Bu protokol, MultiBac Baculovirus sistemini kullanarak insan miyozin-7a holoenziminin rekombinant olarak üretilmesi ve özel bir in vitro filament kayma testi kullanılarak motilitesinin incelenmesi prosedürlerini detaylandırır.

İnsan Miyozin-7a'nın MultiBac Sistem Tabanlı Saflaştırılması ve Biyofiziksel Karakterizasyonu

Öğrenin, MultiBac bakulovirüs/böcek hücresi sistemiyle protein kompleksleri üretmeyi. Bu yöntem, yapısal biyoloji ve ilaç keşfi araştırmalarında yüksek kaliteli ökaryotik proteinler elde etmeyi sağlar.

EMBL de MultiBac Protein Complex Üretim Platformu

Daha fazla video keşfet