EMBL de MultiBac Protein Complex Üretim Platformu

Bu prosedürün genel amacı, çok sırtlı baula virüsü böcek hücresi sistemini kullanarak protein kompleksleri üretmektir. Bu, ilk olarak, tercih edilen protein kompleksini kodlayan çoklu gen yapısının üretilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, bakteri hücrelerini dönüştürerek ve doğru arka ortaları tarayarak çok genli yapıyı içeren kompozit bir baula virüsü yapmaktır.

Daha sonra, baula viral genomunu izole edin ve protein üretimini test ettikten sonra altı oyuklu bir plakada küçük ölçekte böcek hücrelerini enfekte etmek için kullanın. Tercih edilen protein kompleksi daha büyük ölçekte eksprese edilir ve saflaştırılır. Sonuç olarak, saflaştırılmış protein kompleksi, yapısını ve işlevini keşfetmek ve potansiyel olarak ilaç keşfi için kullanılır.

Bu tekniğin mevcut ekovirüs sistemlerine göre başlıca avantajları iki yönlüdür. MultiPro kompleksleri benzeri görülmemiş bir şekilde üretilebilir. Ayrıca, üretilen malzeme çok daha yüksek kalitededir çünkü ekovirüsü optimum protein üretimi için tasarlıyoruz.

Bu tekniğin anlamı, temel biyolojik soruların çok ötesine uzanır. Çoklu torba platformumuz, çeşitli hastalıklar için umut verici yeni aşı adayları olan proteinleri üretmek ve tümör büyümesine neden olan anahtar protein düzenekleri üreterek kanser araştırmalarını katalize etmek için başarıyla kullanılmıştır. Genel olarak, bu yönteme yeni başlayan bireyler, süreçler ve sterilite ihtiyacı ile biraz mücadele edeceklerdir.

Bu nedenle, uzman olmayan kullanıcılar için çoklu banka uygulamasını mümkün olduğunca kolaylaştırmak için standart işletim prosedürleri oluşturmak için çok çalıştık. Bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritik öneme sahiptir, çünkü süreç hareket halinde gösterildiğinde robotik adımlar çok daha kolay anlaşılır. Bunu, ne kadar ayrıntılı olursa olsun, sadece yazılı protokollere bakarak çıkaramazsınız.

Bu prosedüre başlamadan önce, birlikte ifade stratejisini dikkatli bir şekilde planlamak önemlidir. Deneyin önce simüle edilmesi önerilir. In silico.

Genlerin alıcı ve verici plazmitlere dağıtılması gerekir. En iyi işe yarayan şey, fizyolojik alt modüller oluşturabilecek alt birimleri bir araya getirmektir. Büyük kompleksler birçok protein alt birimine sahip olduğundan, birçok genin aynı anda ifade edilmesi gerekir.

Çoklu sırt sistemi, genleri, Cree rekombinaz enzimi tarafından tanınan P kilitleri adı verilen kısa bir DNA dizisi içeren küçük DNA progenitör moleküllerine yerleştirmek için otomatik rutinler kullanarak genlerin klonlanmasını büyük ölçüde basitleştirir. Bu progenitörler daha sonra, bir lox P bölgesine sahip olan her şeyi tek bir büyük DNA plazmidinde birleştiren pre rekombinaz eklenerek tek adımlı bir reaksiyonda birleştirilir. Bu çoklu gen yapısı daha sonra çoklu arka bula virüsü genomuna eklenir.

Çok sayıda yapı oluşturulacaksa, robotik komut dosyalarının ve bir sıvı işleme iş istasyonunun kullanılması önerilir. İş istasyonu, mini hazırlıklar ve PCR temizliği için bir vakum, PCR numunelerinin otomatik olarak yüklenmesi için bir EEL ile donatılmıştır. PCR ve inkübasyon adımları için bir termodöngüleyici, hücreleri ve soğuk blokları yeniden askıya almak için bir çalkalayıcı.

Enzimler için, ilgili genler, restriksiyon enzimleri ve ligaz kullanılarak seçilen donörlere ve alıcılara yerleştirilir veya alternatif olarak, ligasyondan bağımsız yöntemler kullanılarak, restriksiyon haritalaması ve dizileme ile klonlanan tüm donör ve alıcı yapılarını doğrular. Tercih edilen çok genli ekspresyon yapılarını oluşturmak için CRE LAX P rekombinasyonu ile diffüz donör alıcı kombinasyonlarına devam edin. Birleştirilen çoklu gen yapıları, özel olarak tasarlanmış primer setleri ile analitik PCR reaksiyonları ile doğrulanır.

Robot destekli TR işleminin anlık görüntüleri burada gösterilmektedir. Bunlar, çok kuyucuklu plakalarda PCR reaksiyonlarının hazırlanmasını, şablon DNA ve primerlerin sağlanmasını, DNA'ların PCR amplifikasyonunu ve çok kuyulu plakalarda alkalin lizizi ile bakteri kültüründe büyütülen çok genli yapıların hazırlanmasını içerir. Bu prosedüre başlamak için, viral genomu ve TN yedi transpozisyonu için gerekli işlevleri barındıran DH 10 hücrelerine dönüşerek çoklu gen transfer vektörlerini multi bula viral genomuna entegre edin.

TN'den sonra, ilgilenilen genleri içeren kompozit baula virüsü ile yedi transpozisyon hücresi mavi beyaz tarama ile seçilir, başarılı TN yedi transpozisyonu, beta galakto'nun alfa tamamlama kaybına neden olur. Bu nedenle, doğru TN yedi transpozisyonuna sahip koloniler, xal içeren seçici APL'lerde beyaz kalır. Beyaz kolonilerden bakteri kültürleri hazırlayın ve geri kısmı alkali lizis ve etanol izopropanol çökeltme ile izole edin.

Daha sonra, altı kuyucuklu bir doku kültürü plakasında steril bir başlık tohum SF 21 böcek hücrelerinin tohum alikotlarında çalışan saflaştırılmış bao viral genomu ile böcek hücrelerini transfekte edin. Her birine, saflaştırılmış bao viral genomunu ve kültür ortamında karıştırılmış bir transfeksiyon reaktifini ekleyin. Transfekte edilen hücreleri 48 ila 60 saat boyunca hareketsiz olarak 27 santigrat derecede inkübe edin.

48 ila 60 saat sonra, ortamı çıkararak ilk virüsü veya V sıfırı hasat edin, taze ortamla doldurun ve plakayı iki ila üç gün sonra inkübatöre geri koyun, protein üretimini test edin. Ve bir YFP markörü varsa, virüs amplifikasyonu için floresan testi yapın. Yörüngesel bir platform üzerinde çalkalanmış küçük erlenmeyer çalkalayıcı şişelerinde log fazında 25 ila 50 mililitre hücreyi enfekte etmek için ilk virüs olan V zero'yu kullanın.

Çalkalayıcı hücreleri sayın ve hücreleri ikiye katlanmayı bırakana kadar her 24 saatte bir bölün. Düşük sayıda enfeksiyon veya MOI rejimi izleyin, hücreler en az bir kez iki katına çıkmalıdır, aksi takdirde deneyi daha küçük bir hacimde V sıfır eklenerek tekrarlayın. Soldaki resim, çoklu sırt baula virüsü ile enfeksiyonu takiben enfekte olmamış böcek hücrelerini göstermektedir.

Enfekte böcek hücreleri çoğalmayı durdurdu ve sağdaki resimde gösterildiği gibi boyutları arttı. 48 ila 60 saat sonra, hücreleri peletleyerek V bir virüsü hasat edin. Virüs içeren medyayı çıkarın ve saklayın.

Resus, hücreleri taze besiyeri ile askıya alır ve bunları erlenmeyer şişesine geri aktarır. Peletleme ile her 12 veya 24 saatte bir altı hücreye 10 kez çıkarın ve daha büyük ekspresyon hacimleri isteniyorsa protein üretimini ve işaretleyici protein sinyalini test edin. İki litrelik çalkalayıcı şişelerde 400 mililitreye kadar hücreyi V bir virüs ile enfekte ederek virüsü daha da çoğaltın.

Düşük MOI rejimini takiben, rekombinant virüsün modifikasyonlarını önlemek ve yüksek ekspresyon seviyelerini korumak için ular virüs ile enfekte böcek hücreleri veya VIC yöntemleri kullanılarak V one virüsünün üretim virüsü olarak saklanmasını şiddetle tavsiye ederiz. Proliferasyondan 24 saat sonra pelet ile enfekte olmuş hücrelerde arrest gözlenir. Bu aşamada, hücreler ortama salınmadan hemen önce tam viral parçacıklar içerir.

Ortamı çıkarın, hücre peletini dondurma çözeltisinde yeniden süspanse edin ve protein üretim çalışmaları için kriyo tüplerinde BIIC'nin dondurulmasını gerçekleştirin. Daha büyük hücre kültürlerini enfekte etmek için V bir, V iki veya donmuş BIC alikotları kullanın. Tipik olarak, iki litrelik şişelerde 400 mililitre, düşük MOI rejimine uyar.

Enfeksiyon için kullanılan virüs hacmini, enfekte kültür en az bir kez iki katına çıkacak şekilde ayarlamak. Bir YFP işaretleyici proteini mevcutsa, belirli aralıklarla altı hücreye 10 kez geri çekin, hücreleri sonikat ve santrifüjleyin ve floresan sinyalleri kaydedebilen standart bir 96 kuyulu plaka okuyucuda 96 oyuklu bir plakaya aktarın, YFP sinyallerinin gelişimini izleyin bir platoya ulaşılana kadar YFP sinyalinin gelişimini izleyin, maksimum rekombinant protein üretimini gösterir. Bu aşamada hücreleri hasat edin, hücre peletlerini kısa vadede eksi 20 santigrat derecede veya uzun vadede eksi 80 santigrat derecede saklayın, hücreler proteinin ve ardından sitozol ve çekirdeğin gereksinimlerine göre uyarlanmış bir yöntemle yatırılmalıdır.

Parçalanmış nükleer proteinler tipik olarak nükleer pelette bulunur. Sitozolik proteinler sitozolde kalırken. Protein saflaştırması, fraksiyonlama ile büyük ölçüde basitleştirilir.

Tek bir santrifüjleme adımında çok sayıda kirletici madde çıkarılabildiğinden. Protein kompleksleri, çok kuyulu veya mikro uç bazlı saflaştırma gibi minyatür saflaştırma yöntemleri kullanılarak küçük ölçekli başlangıç hücre kültürlerinden uygun şekilde saflaştırılabilir. ACTA micro gibi küçük hacimli kromatografi sistemleriyle bağlantılı olarak, gelecekteki bir adım, tüm deney kurulumunu klonlama iş istasyonu ile arayüzlenmiş küçük bir masa üstü uygulamasına minyatürleştirmek ve entegre etmek olacaktır.

Burada, şu anda geliştirilmekte olan ve bu amaç için kullanılacak olan mikro ölçekli toplu robot gösterilmektedir. Heterolog proteinlerin güçlü birlikte ekspresyonu, burada gösterildiği gibi çoklu sırt sistemi ile elde edilir. Aşırı eksprese edilen protein yasakları, tüm hücre ekstraktı, WCE ve temizlenmiş lizatta açıkça fark edilebilir.

Sn. Üretilen protein materyalinin kalitesi ve miktarı çoğu zaman yeterlidir. Bu diyagramda gösterilen mitotik kontrol noktası kompleksi MCC gibi protein komplekslerinin yapılandırılmış belirlenmesini sağlayın. Çoğu zaman, bu analitik saflaştırma işlemlerinin verimi, saflaştırılmış kompleksin yapısını ve işlevini elektron mikroskobu da dahil olmak üzere çeşitli yollarla analiz etmek için yeterlidir.

Geliştirdiğimiz standart işletim prosedürleri, uzman olmayan kullanıcıların yaklaşımımızı kolaylıkla uygulamasına olanak tanır ve teknolojimiz, bugün Nikola'daki küçük proteinler için olduğu gibi, büyük protein kompleksleriyle ilgilenen birçok laboratuvarda kullanılabilir. Bu videoyu izledikten sonra, iddialı araştırma hedefleriniz için eşsiz miktar ve kalitede ilgilendiğiniz protein komplekslerini üretmek için çoklu torbayı nasıl kullanacağınızı iyi anlamış olmalısınız. Sistemlerimizle çalışmak özel güvenlik koşulları gerektirmez.

Bununla birlikte, hücrelerinizde çoğalmayacak olsa bile, özensiz davranırsanız, virüsün sizi enfekte edeceğini unutmayın. Bu nedenle, bu prosedürü gerçekleştirirken steroid koşullarınızı dikkatli bir şekilde ele almak bir zorunluluktur. Yöntemimiz dünya çapında 600'den fazla laboratuvarda oldukça popüler hale geldi.

Tekniğimizi kullanın. Gelecekte, yöntemimizin insan karmaşık bölgesini ele alan büyük ölçekli yapısal genomik çabaların ayrılmaz bir parçası olacağına inanıyoruz. Bu, hastalıkların temelini ortaya çıkarmaya ve uzun vadede yeni ve daha iyi ilaçlara ve tedavilere yol açmaya yardımcı olabilir.