Atomik Kuvvet Mikroskobu ile Endotelyal Glycocalyx Mekanik Özelliklerinin nicel

Aşağıdaki deneyin genel amacı, bir atomik kuvvet mikroskobu veya bir FM kullanarak endotelyal glikokaliksin mekanik özelliklerini ölçmektir. Bu, ikinci bir adım olarak glikokaliks tabakasını oluşturmak için bir biyoreaktörde fizyolojik bir akış altında bir endotel hücresi tek tabakası olan ilk kültürleme ile elde edilir. Mikron boyutlu boncuklar bir FM konsoluna tutturulur ve girinti sırasında hücre gövdesinin ve glikokaliksin direnç kuvvetini ölçmek için bir prob olarak kullanılır. Daha sonra, glikokaliks modülünü belirlemek için girinti eğrileri iki katmanlı bir modele uygun hale getirilir ve iki katmanlı analize dayalı olarak endotelyal glikokaliksin 0.7 kilo paskal modülüne ve 380 nanometre kalınlığa sahip olduğunu gösteren kalınlık sonuçları elde edilir.

Merhaba, ben Rick Wa.Rochester Üniversitesi'nde biyomedikal mühendisliği başkanıyım. Son yıllarda, endotelyal glikokaliksin inflamasyondaki olası rolü, özellikle de inflamasyon sırasında istenmeyen hücre yapışmasını önlemek için koruyucu bir bariyer görevi görüp göremeyeceğine dair çok fazla tartışma olmuştur. Bu sorunu çevreleyen soruları çözmenin anahtarlarından biri, hem normal koşullarda hem de enflamatuar yanıt sırasında bu tabakanın fiziksel özelliklerini, yani kalınlığını ve sertliğini ölçme yeteneğidir.

Adım Graham Marsh. Rochester Üniversitesi Biyomedikal Mühendisliği Bölümü'nde yüksek lisans öğrencisiyim. Endotelyal glikokaliksi karakterize etmedeki en büyük sorun, inanılmaz derecede yumuşak olmasıdır.

Bulduğumuz yaklaşım, ölçülen kuvvetlerin A ile çözülebilir olması için A ve A FM konsolunun ucuna büyük bir boncuk yapıştırmak FM.To bu işleme başlamak, burada gösterilene benzer, 1.0 Pascal'lık bir kesme gerilimi altında hücreleri büyütebilen bir akış odası inşa etmektir. Önce cam slaytları piranha solüsyonunda 15 dakika temizleyerek akış odasını deney için hazırlayın. Damıtılmış su ile üç kez durulayın ve 70 derecede 30 dakika kurutun.

Ardından, slaytları amino propil trixi, cy lane veya buhar biriktirme ile apte ile kaplayın. Numune ile birlikte vakum odasına tutturulmuş bir şişeye bir mililitre apte ekleyin. Ardından şişeyi kapatın ve bir saat boyunca 0,7 bar'lık bir vakum çekin.

Bu süre zarfında vakumu üç kez yenileyin. Ardından, bir siluet SD kesme aleti kullanarak 0,4 milimetre kalınlığındaki bir silikon levhadan yeni bir akış odası contası kesin. Kanal, 6,4 milimetre genişliğinde ve 19 milimetre uzunluğundadır ve dış çapı, iltica kültürü kabına sığması için 35 milimetreye kesilmiştir.

Bu boyutları kullanarak, burada gösterilen denklemle bir paskal'lık saf gerilim oluşturmak için gerekli akış hızını hesaplayın. Q akış hızını temsil eder. Tau tam bir strestir.

Mu, ortamın viskozitesidir. H, kanal yüksekliğidir ve W, akış odasının genişliğidir. Bir sonraki adım, akış odasının üst parçasını hücre kültürü kabındaki conta ile hizalamak ve manyetik bir halka ile sabitlemektir.

Hücre kültürü kabındaki akış portlarını, 30 mililitrelik şırıngalara giden hatları olan üç dalga valfine bağlayın. Ardından, beş dakika boyunca izopropil alkolle yıkayarak tüm düzeneği sterilize edin. Daha sonra alkolü çıkarın ve dokuda kurumaya bırakın.

Kültür davlumbazı %4 fetal buzağı serumunu McCoy'un ortamında 37 santigrat dereceye kadar önceden ısıtın. Beş ila 10 dakika kurumaya bırakıldıktan sonra, kalan alkolü 30 mililitre önceden ısıtılmış fetal buzağı serumu ile yıkayın. Daha sonra şırıngaları 20 mililitre veek MCDB 1 31 büyüme ortamı ile doldurun.

Ardından, kontaminasyonu önlemek için şırıngaları kapatın. Sistemi steril davlumbazdan çıkarırken, ortamı yukarı akış rezervuarına geri çekmek için sıvıya ulaşan iğne ile toplama haznesinin kapağını takın. Son olarak, 0.2 mikron steril filtreleri, bir sonraki hasat insan göbek damarı kapaklarındaki hava girişlerine takın.

Endotel hücreleri bir T 25 şişesinde birleşecek şekilde büyür. Peletlenmiş hücreleri ortamda mililitre başına 100.000 hücrede yeniden askıya alın ve çözeltiyi bir şırıngaya çekin. Daha sonra süspansiyonu üç vanadan akış odasına enjekte edin.

Hücrelerin iki saat boyunca cam alt tabakaya yerleşmesine ve yapışmasına izin verin. Akışa başlamadan önce, biyoreaktörü ve hücreleri, hücrelerin iki saat boyunca yerleşmesine ve yapışmasına izin verilen bir inkübatöre taşıyın. Rezervuarları peristaltik bir pompaya bağlayan boru, inkübatörün arkasından geçer Hücreler yapıştıktan sonra, peristaltik pompayı istenen akış hızına ayarlayın.

Ortam, rezervuarlar arasında hareket eder, bir basınç kafası ve biyoreaktör boyunca bir pascal'lık bir duvar kesme gerilimi üreten bir akış oluşturur. Hücrelerin, oda birleşene kadar bir ila beş gün boyunca 37 santigrat derecede sürekli akışla inkübe etmesine izin verin. Konsol hazırlamaya başlamak için, bir ucu ve bir FM konsolunu nitrik asit içinde beş dakika temizleyin ve ardından damıtılmış su ile durulayın.

Kuruduktan sonra, konsolu daha önce cam kızaklar için gösterildiği gibi bir buhar biriktirme odasında apdi ile işlevsel hale getirin. Daha sonra ağırlıkça mililitre başına beş miligram NHS Sulf O lc, Hank'in tamponlu tuz çözeltisinde biotin içeren bir çözelti hazırlayın. Konsolları 15 dakika boyunca çözeltiye batırın.

Bu reaksiyon, CY ve uç hidroksi oksidi konjuge eder ve konsolların yüzeyinde biyotin molekülleri sunar. Bir gün önce, %20 serum içeren 20 mililitre vexcel kültür ortamını 200 mikrolitre strept ENC kaplı boncuklarla birleştirerek biyotin içermeyen bir besiyeri çözeltisi hazırlamaya başlayın ve dönerken 12 saat inkübe edin. Deney gününde.

Manyetik boncukları iki dakika boyunca bir mıknatısla tüpün dibine çekin ve biyotin içermeyen süper natan ortamını yeni bir tüpe aktarın. Ortamı 0,22 mikrometrelik bir filtreden geçirerek sterilize edin ve yeni bir tüpe koyun. Bir sonraki adım, akış odasını hücre kültürü kabından çıkarmak ve daha sonra hücreleri iki mililitre 37 santigrat derece, biyotin içermeyen ortamla üç kez yıkamaktır.

Daha sonra 2.4 mikrometre çapında bir mikrogram, soyulmuş Aden kaplı boncuklar ekleyin. Hücre kültürü kabına mililitre başına 10 mikrogramlık bir konsantrasyon ekleyin ve yavaşça karıştırın. Ardından, A FM tib'yi bir strippin boncuğuna takarak ve düz bir cam yüzeye bastırarak kalibre edin.

Bunu gerçekleştirmek için, ucu bir boncuğun yanındaki cam yüzeye indirin, ucu geri çekin, ardından konsolun tepesini boncuğun üzerine yerleştirin ve birkaç saniye aşağı bastırın. Son olarak, numuneleri girintilemek için kalibre edilmiş konsolu kullanın. 2.4 mikrometre boncuklar, yumuşak glikokaliks tabakasının mekanik özelliklerinin daha kolay tespit edilebilmesi için hücre yüzeyi ile daha geniş bir temas alanı sunar.

Bu pozisyonu gerçekleştirmek için, hücre çekirdeğine yakın bir hücre üzerindeki konsol, konsol yüksekliğini hücre yüzeyinin yaklaşık üç mikrometre üzerine ayarlamak için ucun hücreye yumuşak bir yaklaşımını kullanın. Daha sonra yüzeyi saniyede bir mikrometre oranında 20 kez maksimum yedi kuvvete kadar girintileyin. Nano Newtonlar, ardışık temaslar arasında altı saniyelik bir sürenin geçmesine izin verir.

Hertz teorisi ile ilgili denklemleri kullanarak glikokaliks tabakasının kalınlığını hesaplayın. F girinti kuvveti, delta'nın girinti derinliği olduğu bu denklem ile tanımlanır. R, küre yarıçapıdır ve estar, stres altındaki malzemelerin birleşik modülüdür.

Kombine elastik modül estar'ı hücresel ve glikokaliks bileşenlerine ayırmak için, glikokaliks tabakasını hücre gövdesinin yüzeyinde düzgün, ince yumuşak bir film olarak ele alın ve Clifford'un iki katmanlı modelini kullanın ve bu denklemi C.In, PQ ve N, polimer uyumlarından ampirik olarak belirlenir. M, polimer modelinden bir sabittir ve Z, burada gösterilen denklemle ince film veya glikokaliks tabakasının kalınlığı ile ilişkilidir. Nano Newton cinsinden ölçülen A FM tarafından ölçülen kuvvet, yüzeyle temas ettikten sonra artmaya başlar ve başlangıçta glikokaliks tabakası bileşeni tarafından domine edilir.

Glikokaliks tabakası sıkıştırıldığında, hücre gövdesi deformasyonun ana bileşeni haline gelir. Mavi iki katmanlı uyum çizgisi, hücre modülü, glikokaliks, katman modülü ve glikokaliks katman kalınlığının tümü belirlenebilen, kullanılan denklemden kırmızı ile gösterilen girinti verileriyle eşleşmesini sağlamak için dört serbest parametrenin uydurulmasıyla hesaplandı. 25 hücrenin özellikleri burada gösterilen histogramda derlendi.

Ortalama glikokaliks tabaka modülü 0.7 artı veya eksi 0.5 kipacal, glikokaliks tabaka kalınlığı ise 380 artı veya eksi 50 nanometre olarak belirlendi. Bu yaklaşım bize, iltihaplanma sırasında hücre yapışmasını düzenlemede glikokaliksin rolü hakkındaki temel soruları yanıtlamak için ihtiyaç duyduğumuz aracı sağlar. Artık iltihaplanma sırasında glikokaliksin özelliklerinin nasıl değiştiğiyle ilgili soruları ele alabiliyoruz.

Bu değişiklikler hangi yollarla gerçekleştirilir. Bu yaklaşım çeşitli şekillerde genişletilebilir. Örneğin, glikokaliksin özelliklerinin yeni, daha karmaşık teorik açıklamalarını test etmek için kullanılabilir.

Ya da daha pratik bir düzeyde, bu, implante edilebilir cihazları konakçıdaki bağışıklık tepkisinden korumak için tasarlanmış biyo-esinlenmiş yüzey kaplamalarını test etmek için kullanılabilir. Çalışmalarımıza gösterdiğiniz ilgi için çok teşekkür ederiz.