Name: Atomik Kuvvet Mikroskobu ile Endotelyal Glycocalyx Mekanik Özelliklerinin nicel (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: Keşfedin, atomik kuvvet mikroskobu ile endotelyal glikokaliks mekanik özelliklerini doğrudan ölçme yöntemini. Bu teknik, canlı hücrelerde glikokaliks modülü ve kalınlığını nicel olarak belirlemeyi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, bu proje ile birlikte yardım için Elena Lomakina, Richard Bauserman, Margaret Youngman, Shay Vaknin, Jessica Snyder, Chris Striemer, Nakul Nataraj, Hung Li Chung, Tejas Khire, ve Eric Lam teşekkür etmek istiyorum. Bu proje NIH # PO1 HL 018208 tarafından finanse edildi.

1. Yöntemler 1.1 Hücre Akış Odası Hücreler 1.0 Pa (10 dyn / cm 2) bir makaslama altında yetiştirilir ve daha sonra bir Sı MFP3D AFM (Santa Barbara, CA) ile doğrudan transfer edilebilir böylece Şekil 1&#39;de gösterildiği gibi, akış bölme, inşa edildi. <ol><li> 15 dakika boyunca ve daha sonra damıtılmış su ile yıkama: akış bölme birinci pirana çözeltisi (H2O 03:01 2 H 2 SO 4) cam slaytlar temizleme ile deney için hazırlanmıştır. Daha sonra pişmiş edildi kuru ve bir vakum biriktirme odasında silan aminopropil triethoxy (APTES) ile kaplı. </li><li> Bir silikon conta bir Silhouette SD kesici alet kullanılarak kesildi. Bu bize ince hücre büyümesi sırasında akış hızı ve makaslama stres kontrolü için akış odasının boyutlarını denetlemek için izin verdi. Tipik olarak, bir kanal 0,4 mm silikon bir tabaka, uzun 19 mm genişliğinde 6,4 mm kesildi. Cins için gerekli olan akış hızıte 1,0 Pa (10 dyn / cm 2) bir kayma gerilmesi denklemi ile dikdörtgen bir kanalda laminer akış olduğu varsayılarak hesaplanır: </li></ol><img alt="Denklem 1" fo:content-width="0.737in" fo:src="/files/ftp_upload/50163/50163eq1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50163/50163eq1.jpg" /> Q akış hızıdır, τ makaslama gerilmesi, μ, ortamın viskozitesi olan 1.0 MPa (0.01 * sn dyn / cm 2) olduğu kabul burada, h yükseklik ve w akış odasının genişliği . <ol start="3"><li> Akış odasının üst parça hücre kültürü çanağı içinde conta ile hizalanmış ve bir manyetik halka ile tespit edildi. Montaj sterilizasyon için izopropil alkol (IPA) ile doluydu. </li><li> Tam akış sistemi monte edildi. Hücre kültürü çanak akış portu üç yollu vanalar bağlanmıştır. Vanalar 30 ml şırınga açmak bağlanmıştırs. IPA sonra% 4 Fetal Buzağı Serumu (FCS) ile McCoy ortam, 30 ml ile yıkandı sistemi yoluyla yıkandı. Sistem daha sonra Vec Technologies hücre büyüme ortamı 20 ml ile dolduruldu. Kapaklar şırınga üstleri üzerine yerleştirildi. Catch rezervuar şırınga kapağını yem deposuna geri orta taşımak yerine bir iğne vardı. Steril 0.2 um filtre sisteminin kirlenmesini önlemek için kapak içinde hava girişleri bağlanmıştır. Akış odasının sonra hücre ekimi için hazır. </li></ol> 1.2 Hücre Kültürü <ol><li> İnsan umbilikal ven endotel hücreleri (HUVEC) &#39;ın ve büyüme orta Vec Technologies satın (Rensselaer, NY) ve T25 Flask izdiham yetiştirilmiştir. </li><li> Büyüme ortamı şişeye% 2.5 tripsin ve 2 ml ile serbest hücrelerin tek tabaka çıkarıldı. Hücrelerin çözelti içinde sağlandıktan sonra tripsinizasyonla şişeye hücre kültür ortamı 10 ml ilavesi ile söndürülmüştür. </li><li> ThE hücre süspansiyonu 5 dakika boyunca santrifüj edildi ve süpernatan ayrılmıştır. Hücreler, akış bölme içine enjeksiyon için hücre kültürü ortamı (serum içeren) 1 ml içinde tekrar süspanse edildi. </li><li> Hücre süspansiyonu (0.5 ml, ~ 50.000 hücre) bir şırınga içine yüklenmiş ve bir üç yollu valf içinden akış bölmesi içine enjekte edildi. </li><li> Hücreler akış başlatılmasından önce 2 saat için yerleşmek ve cam substrat yapışma izin verildi. Hücreler 37 küvözde akışı altında yetiştirilen ° 1 ile 5 gün boyunca C konfluent kadar. </li></ol> 1.3 Cantilever Hazırlama ve Hücre Girinti <ol><li> Tipless AFM konsol (NanoWorld, İsviçre) 5 dk için nitrik asit temizliği ve buhar biriktirme odasında silan aminopropil triethoxy (APTES) ile fonksiyonelleştirilmiş edildi. </li><li> 5 Hank Tamponlu Tuz Çözeltisi içinde (HBSS) hazırlandı ağırlık NHS-sülfo-LC-biotin ile mg / ml &#39;lik bir çözelti. Çıkma konjuge etmek için 15 dakika için çözelti içine daldırılmış edildikapı N-hidroksisüksinimid (NHS) kimya ile silan. </li><li> Biotin içermeyen aracı madde içindeki bir çözeltisi, 12 saat boyunca streptavadin boncuk 200 ul ile Vec Technologies hücre kültür ortamı (serum içeren) 20 ml inkübe edilerek yapıldı. Boncuklar bir mıknatıs ile ortamdan uzaklaştırılmış ve ortam bir 0.22 um steril filtre içinden süzülmüştür. </li><li> Akış bölme hücre kültürü çanağı çıkartılmış ve hücreler 37 ° C de biyotin içermeyen aracı madde içinde yıkanmıştır. </li><li> Biotin içermeyen aracı madde 1 ml streptavidin ile kaplanmış 2.4 mikron boncuk 1 ul bir stok çözeltisi hazırlanmış ve stok 100 ul hücre kültür kabına ilave edildi. </li><li> Streptavidin boncuk, bir boncuk, geri çekme yanındaki cam yüzey üzerinde ucu iniş boncuk üzerinde konsolun apeks konumlandırma ve ardından boncuk ve dinlenme birkaç saniye üzerine konsol aşağı basarak konsol ile tutuklandılar. </li><li> Konsolun hassasiyeti tedbirçıplak cam bir bölge üzerine girinti ve voltajın bir fonksiyonu olarak uç sapma belirlemek için eğrisinin eğimi kullanılarak d. </li><li> Konsolun yay sabiti sonra MFP3D yazılım bir termal kalibrasyon hesaplandı. </li><li> Şekil 2&#39;de gösterildiği gibi kalibre konsol sonra, numuneler girinti için kullanılmıştır. Bunlar, 2.4 mikron boncuklar yumuşak glycocalyx tabakanın mekanik özelliklerini tespit edilebilmesi için hücre yüzeyi ile daha geniş bir temas alanına sahiptir. Konsol hücre çekirdeği ve hücre üzerine ucu yaklaşık 3 mikron hücre yüzeyi üzerinde konsol yüksekliğini ayarlamak için kullanılan yumuşak bir yaklaşım yakın bir hücre üzerine yerleştirildi. Yazılımı 7 nN bir maksimum kuvvet ile 1 um / sn bir hızda 20 tekrarlanan girintileri için belirlenmiştir. Yaklaşık 6 sn ardışık kişiler arasında geçen. Bu glycocalyx zamana bağlı özellikleri test etmek için girinti farklı oranlarda kullanmak mümkün olmasına rağmen bu ilk yılında<html> deneyler, sadece tek bir girinti oranı (1 um / saniye) kullanılmıştır. </li></ol> 2. Girinti Teorisi R yarıçaplı bir küre ile yarı-uzay elastik içine Girinti girinti kuvveti, F, denklem ile verilir Hertz teorisi kullanılarak tarif edilebilir: <img alt="Denklem 2" fo:content-width="1.157in" fo:src="/files/ftp_upload/50163/50163eq2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50163/50163eq2.jpg" /> Δ olduğu yerde girinti derinliği ve E * test edilen malzeme (Şekil 3) ve indirgenmiş modülü olduğunu. Üniform bir elastik yarı-uzay çarpan bir sonsuz sert ucu söz konusu olduğunda, E * denklem ile ifade edilir: 3/50163eq3.jpg &quot;/&gt; E burada elastik modül ile ν malzemenin Poisson oranıdır. Polimer film ile son çalışmaları ince filmlerin 1 modülü ve kalınlığı belirlemek için bir iki katmanlı modelin geliştirilmesi ilham kaynağı olmuştur. Bu hücre vücut yüzeyi üzerinde düzgün bir ince yumuşak bir film olarak glycocalyx muamele ile hücre biyolojisi, bu modelin uygulamaktadırlar. Bu modeli kullanarak, sistem indirgenmiş modülü olur: <img alt="Denklem 4" fo:content-width="2.85in" fo:src="/files/ftp_upload/50163/50163eq4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50163/50163eq4.jpg" /> E GC glycocalyx bir modül olduğu durumlarda, E bir hücre, vücut modülü, P, Q ve n, ampirik olarak uygun polimer esas alınarak tespit edilmiştir, ve z denklem ile verilmektedir sabitleridir: <p class="jove_content" fo:keep-Together.within-page = &quot;always&quot;&gt; <img alt="Denklem 5" fo:content-width="1.257in" fo:src="/files/ftp_upload/50163/50163eq5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50163/50163eq5.jpg" /> T glycocalyx katmanın kalınlığı olduğu. Bu parametrelerin bir şeması Şekil 3&#39;de gösterilmektedir. Bu model, katı substrat 1 üzerinde bir ince film modülü ve kalınlığı belirlemek doğru bir yol olduğu gösterilmiştir. Şekil 4&#39;te gösterildiği gibi bu denklem, endotel glycocalyx bir modül ve kalınlığı belirlemek için hücre içine girinti elde edilen eğrileri uyması için de kullanılabilir.

<ol><li>Clifford, C., Seah, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoindentation+measurement+of+young%27s+modulus+for+compliant+layers+on+stiffer+substrates+including+the+effect+of+poisson%27s+ratios%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Nanoindentation measurement of young's modulus for compliant layers on stiffer substrates including the effect of poisson's ratios.</a> Nanotechnology. , (2009).</li>
<li>Gouverneur, M., Spaan, J. A. E., Pannekoek, H., Fontijn, R. D., Vink, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluid+shear+stress+stimulates+incorporation+of+hyaluronan+into+endothelial+cell+glycocalyx%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart.+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Fluid shear stress stimulates incorporation of hyaluronan into endothelial cell glycocalyx.</a> Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 290 (1), 458-452 (2006).</li>
<li>Hocde, S. A., Hyrien, O., Waugh, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+adhesion+molecule+distribution+relative+to+neutrophil+surface+topography+assessed+by+tirfm%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Cell adhesion molecule distribution relative to neutrophil surface topography assessed by tirfm.</a> Biophysical Journal. 97 (1), 379-387 (2009).</li>
<li>Lipowski, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+endothelial+glycocalyx+as+a+barrier+to+leukocyte+adhesion+and+its+mediation+by+extracellular+proteases%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+biomedical+engineering%22%5BJournal%5D)">The endothelial glycocalyx as a barrier to leukocyte adhesion and its mediation by extracellular proteases.</a> Annals of biomedical engineering. 40 (4), 840-848 (2012).</li>
<li>Lu, L., Oswald, S. J., Ngu, H., Yin, F. C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+properties+of+actin+stress+fibers+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Mechanical properties of actin stress fibers in living cells.</a> Biophysical Journal. 95 (12), 6060-6071 (2008).</li>
<li>Pries, A. R., Secomb, T. W., Gaehtgens, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+endothelial+surface+layer%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Archiv.+European+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">The endothelial surface layer.</a> Pflugers Archiv. European Journal of Physiology. 440 (5), 653-666 (2000).</li>
<li>Spillmann, C. M., Lomakina, E., Waugh, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+adhesive+contact+dependence+on+impingement+force%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Neutrophil adhesive contact dependence on impingement force.</a> Biophysical Journal. 87 (6), 4237-4245 (2004).</li>
<li>vanden Berg, B. M., Vink, H., Spaan, J. A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+endothelial+glycocalyx+protects+against+myocardial+edema%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">The endothelial glycocalyx protects against myocardial edema.</a> Circulation Research. 92 (6), 592-594 (2003).</li>
<li>Williams, T. E., Nagarajan, S., Selvaraj, P., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+the+impact+of+membrane+microtopology+on+effective+two-dimensional+affinity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Quantifying the impact of membrane microtopology on effective two-dimensional affinity.</a> J. Biol. Chem. 276 (16), 13283-138 (2001).</li>
<li>Vink, H., Duling, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Distinct+Luminal+Domains+for+Macromolecules%2C+Erythrocytes%2C+and+Leukocytes+Within+Mammalian+Capillaries%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Identification of Distinct Luminal Domains for Macromolecules, Erythrocytes, and Leukocytes Within Mammalian Capillaries.</a> Circulation Research. 79, 581-589 (1996).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Bu iki tabaka modeli ve endotel duvar ile kan içinde dolaşan bir lökosit etkileşimini modellemek için Hertz teori hesaplanan değerler kullanılmıştır. Biz, 10 pN yük altında 50 nm çapında lökosit bir mikrovillus glycocalyx içine yaklaşık 150 nm girinti edeceğini toplam kalınlığı yalnızca bir kısmını hesaplanmıştır. Bu, bu deneyde ölçüldüğü gibi özelliklere sahip glycocalyx, hücre-hücre etkileşim için önemli bir engel olan ve lökosit hücre yapışma sırasında yapışma sırasında kademeli üstesinden gelmesi gereken büyük bir s...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif / Malzeme Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog Numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> McCoy&#39;un Orta </td><td> Gibco </td><td> 16600-082 </td><td></td></tr><tr><td> Fötal Buzağı Serumu </td><td> Hyclone </td><td> SH30070 </td><td></td></tr><tr><td> Endotel Hücre Büyümesi Orta </td><td> Vec Teknolojileri </td><td> MCDB-131 </td><td></td></tr><tr><td> Pooled İnsan Umbilical Ven Endotel Hücreleri </td><td> Vec Teknolojileri </td><td> PHUVEC/T-25 </td><td></td></tr><tr><td> Sülfürik Asit </td><td> JT Baker </td><td> 9681-02 </td><td></td></tr><tr><td> Hidrojen peroksit </td><td> VWR </td><td> BDH3742-1 </td><td></td></tr><tr><td> (3-aminopropil) triethoxysilane </td><td> Aldrich </td><td> 440140-100ML </td><td></td></tr><tr><td> İzopropil Alkol </td><td> VWR </td><td> BDH8999-4 </td><td></td></tr><tr><td> Tripsin </td><td> Cellgro </td><td> 25-054-C1 </td><td></td></tr><tr><td> Hank&#39;in Tamponlu Tuz Çözeltisi </td><td> Gibco </td><td> 14175-095 </td><td></td></tr><tr><td> sülfo-NHS-LC-Biotin </td><td> Thermo Scientific </td><td> 21335 </td><td></td></tr><tr><td> Streptavadin boncuk </td><td> Dynabeads </td><td> 112.06D </td><td></td></tr><tr><td> MFP-3D AFM </td><td> İltica Araştırma </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Tipless cantilevers </td><td> Nanoworld </td><td> OK-TL1-50 </td><td></td></tr><tr><td> Silhouette SD </td><td> Quickutz </td><td> Silhouette-SD </td><td></td></tr><tr><td> Silikon Kauçuk </td><td> Stockwell Elastomerics </td><td> SE50-RS </td><td></td></tr><tr><td> 30 ml şırıngalar </td&gt; <td> Benton Dickinson </td><td> 309650 </td><td></td></tr><tr><td> 18 gauge iğne </td><td> Benton Dickinson </td><td> 305196 </td><td></td></tr><tr><td> Uzatma Takımları </td><td> Hospira </td><td> 4429-48 </td><td></td></tr><tr><td> 4 yollu vanalar </td><td> Teleflex </td><td> W21372 </td><td></td></tr><tr><td> Erkek / Kadın Liman Caps </td><td> Smith&#39;in Tıp </td><td> MX491B </td><td></td></tr><tr><td> Peristaltik Pompa </td><td> Watson-Marlow </td><td> 401U / D </td><td></td></tr><tr><td> Peristaltik Hortum </td><td> Watson-Marlow </td><td> 903.0016.016 </td><td></td></tr><tr><td> steril filtre </td><td> Pall Yaşam Bilimleri </td><td> 4652 </td><td></td></tr></tbody></table>

atomik kuvvet mikroskobu ile endotelyal glycocalyx mekanik Özelliklerinin nicel

Quantifying the Mechanical Properties of the Endothelial Glycocalyx with Atomic Force Microscopy

Lökositler ve lökosit çekme sırasında damar duvarının etkileşimin anlaşılmasına endotel yüzey tabakasının mekanik özellikleri eksik bir anlayış ile sınırlıdır. Bu lökosit adezyon moleküllerinin yüzey topografyası 3 göreli olmayan düzgün yayılı olduğu bilinmektedir, bu topografya diğer yüzeyleri 9 yapışkan bağ oluşumu sınırlar ve fizyolojik temas kuvvetleri (≈ 5,0 - mikrovillus başına 10.0 pN) olarak mikrovilluslar sıkıştırabilir karşıt yüzeyi 3, 7 ila moleküllerin yönelik artan istirahat uzunluğunun üçte biri kadar biraz. Bir iki-tabakalı yapı, nispeten sert hücre gövdesi, artı glycocalyx, lümen yüzeyi 6 üzerinde bir koruyucu yumuşak bir şeker kaplama gibi endotelyum düşünün. Bu glycocalyx endotel yüzeyi 4 lökositlerin yapışmasını azaltmak için bir engel olarak hareket edebilir olduğu gösterilmiştir.Bu yazıda endotel mekanik sertliği bağ oluşumu nasıl etkileyeceğini anlamak için endotel yüzeyler deformabilitesi ele başlar. Statik kültüründe yetişen Endotel hücreleri sağlam glycocalyx ifade etmezler, ancak fizyolojik akış koşullarında yetiştirilen hücreler in vivo 2 gözlenen yaklaşık glycocalyx başlar. Endotel hücre vücudun modülü yaklaşık 5 ila 20 kPa 5 olmak atomik kuvvet mikroskobu (AFM) kullanılarak ölçülmüştür. Glycocalyx kalınlığı ve yapısı elektron mikroskobu 8 kullanılarak çalışılmıştır ve glycocalyx bir modülü dolaylı yöntemler kullanılarak yaklaştırılır olmuştur, ama bildiğimiz kadarıyla, canlı hücreler içerisinde glycocalyx modülü doğrudan ölçüm yayımlanmış bir rapor olmamıştır . Bu çalışmada, biz ma kendi glycocalyx ifade maksimize etmek koşullarda kültüre edilmiştir hücreleri üzerine bir roman AFM probe ile yapılan girinti deneyler sunmakendotel glycocalyx bir modülü ve kalınlığı ke doğrudan ölçümler.

Tipik bir deneyde, 20 kuvvet-vs-mesafe eğrisi yakın, ancak çekirdek (~ 2 mikron içinde), üzerinde, tipik olarak perinükleer bölge, hücre belirli bir bölge elde edilmiştir. Eğrileri ölçüm süresi üzerinde hiçbir örnek kayması için hesap hizalanır ve daha sonra Şekil 4&#39;de gösterildiği gibi, kendi kendini taşır gürültü çıkarmak için ortalamaları alınmıştır. Eğrileri analiz ve ince polimer filmler 1 modülü ve kalınlığı belirlemek için geliştirilen iki tabaka modeli ile uyum. 25 hücrelerinin eğ...

Endotel glycocalyx mekanik özellikleri AFM konsollar üzerine mikron boyutlu küreler kullanarak girinti ile ölçüldü. Endotel hücreleri glycocalyx ifadesi neden fizyolojik akış koşullarında özel bir odasında kültüre edildi. Veri glycocalyx kalınlık ve modül belirlemek için, ince bir film model kullanılarak analiz edildi.

Atomik Kuvvet Mikroskobu ile Endotelyal Glycocalyx Mekanik Özelliklerinin nicel

Our  understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during  leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the ...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, bir atomik kuvvet mikroskobu veya bir FM kullanarak endotelyal glikokaliksin mekanik özelliklerini ölçmektir. Bu, ikinci bir adım olarak glikokaliks tabakasını oluşturmak için bir biyoreaktörde fizyolojik bir akış altında bir endotel hücresi tek tabakası olan ilk kültürleme ile elde edilir. Mikron boyutlu boncuklar bir FM konsoluna tutturulur ve girinti sırasında hücre gövdesinin ve glikokaliksin direnç kuvvetini ölçmek için bir prob olarak kullanılır. Daha sonra, glikokaliks modülünü belirlemek için girinti eğrileri iki katmanlı bir modele uygun hale getirilir ve iki katmanlı analize dayalı olarak endotelyal glikokaliksin 0.7 kilo paskal modülüne ve 380 nanometre kalınlığa sahip olduğunu gösteren kalınlık sonuçları elde edilir.Merhaba, ben Rick Wa.Rochester Üniversitesi'nde biyomedikal mühendisliği başkanıyım. Son yıllarda, endotelyal glikokaliksin inflamasyondaki olası rolü, özellikle de inflamasyon sırasında istenmeyen hücre yapışmasını önlemek için koruyucu bir bariyer görevi görüp göremeyeceğine dair çok fazla tartışma olmuştur. Bu sorunu çevreleyen soruları çözmenin anahtarlarından biri, hem normal koşullarda hem de enflamatuar yanıt sırasında bu tabakanın fiziksel özelliklerini, yani kalınlığını ve sertliğini ölçme yeteneğidir.Adım Graham Marsh. Rochester Üniversitesi Biyomedikal Mühendisliği Bölümü'nde yüksek lisans öğrencisiyim. Endotelyal glikokaliksi karakterize etmedeki en büyük sorun, inanılmaz derecede yumuşak olmasıdır.Bulduğumuz yaklaşım, ölçülen kuvvetlerin A ile çözülebilir olması için A ve A FM konsolunun ucuna büyük bir boncuk yapıştırmak FM.To bu işleme başlamak, burada gösterilene benzer, 1.0 Pascal'lık bir kesme gerilimi altında hücreleri büyütebilen bir akış odası inşa etmektir. Önce cam slaytları piranha solüsyonunda 15 dakika temizleyerek akış odasını deney için hazırlayın. Damıtılmış su ile üç kez durulayın ve 70 derecede 30 dakika kurutun.Ardından, slaytları amino propil trixi, cy lane veya buhar biriktirme ile apte ile kaplayın. Numune ile birlikte vakum odasına tutturulmuş bir şişeye bir mililitre apte ekleyin. Ardından şişeyi kapatın ve bir saat boyunca 0,7 bar'lık bir vakum çekin.Bu süre zarfında vakumu üç kez yenileyin. Ardından, bir siluet SD kesme aleti kullanarak 0,4 milimetre kalınlığındaki bir silikon levhadan yeni bir akış odası contası kesin. Kanal, 6,4 milimetre genişliğinde ve 19 milimetre uzunluğundadır ve dış çapı, iltica kültürü kabına sığması için 35 milimetreye kesilmiştir.Bu boyutları kullanarak, burada gösterilen denklemle bir paskal'lık saf gerilim oluşturmak için gerekli akış hızını hesaplayın. Q akış hızını temsil eder. Tau tam bir strestir.Mu, ortamın viskozitesidir. H, kanal yüksekliğidir ve W, akış odasının genişliğidir. Bir sonraki adım, akış odasının üst parçasını hücre kültürü kabındaki conta ile hizalamak ve manyetik bir halka ile sabitlemektir.Hücre kültürü kabındaki akış portlarını, 30 mililitrelik şırıngalara giden hatları olan üç dalga valfine bağlayın. Ardından, beş dakika boyunca izopropil alkolle yıkayarak tüm düzeneği sterilize edin. Daha sonra alkolü çıkarın ve dokuda kurumaya bırakın.Kültür davlumbazı %4 fetal buzağı serumunu McCoy'un ortamında 37 santigrat dereceye kadar önceden ısıtın. Beş ila 10 dakika kurumaya bırakıldıktan sonra, kalan alkolü 30 mililitre önceden ısıtılmış fetal buzağı serumu ile yıkayın. Daha sonra şırıngaları 20 mililitre veek MCDB 1 31 büyüme ortamı ile doldurun.Ardından, kontaminasyonu önlemek için şırıngaları kapatın. Sistemi steril davlumbazdan çıkarırken, ortamı yukarı akış rezervuarına geri çekmek için sıvıya ulaşan iğne ile toplama haznesinin kapağını takın. Son olarak, 0.2 mikron steril filtreleri, bir sonraki hasat insan göbek damarı kapaklarındaki hava girişlerine takın.Endotel hücreleri bir T 25 şişesinde birleşecek şekilde büyür. Peletlenmiş hücreleri ortamda mililitre başına 100.000 hücrede yeniden askıya alın ve çözeltiyi bir şırıngaya çekin. Daha sonra süspansiyonu üç vanadan akış odasına enjekte edin.Hücrelerin iki saat boyunca cam alt tabakaya yerleşmesine ve yapışmasına izin verin. Akışa başlamadan önce, biyoreaktörü ve hücreleri, hücrelerin iki saat boyunca yerleşmesine ve yapışmasına izin verilen bir inkübatöre taşıyın. Rezervuarları peristaltik bir pompaya bağlayan boru, inkübatörün arkasından geçer Hücreler yapıştıktan sonra, peristaltik pompayı istenen akış hızına ayarlayın.Ortam, rezervuarlar arasında hareket eder, bir basınç kafası ve biyoreaktör boyunca bir pascal'lık bir duvar kesme gerilimi üreten bir akış oluşturur. Hücrelerin, oda birleşene kadar bir ila beş gün boyunca 37 santigrat derecede sürekli akışla inkübe etmesine izin verin. Konsol hazırlamaya başlamak için, bir ucu ve bir FM konsolunu nitrik asit içinde beş dakika temizleyin ve ardından damıtılmış su ile durulayın.Kuruduktan sonra, konsolu daha önce cam kızaklar için gösterildiği gibi bir buhar biriktirme odasında apdi ile işlevsel hale getirin. Daha sonra ağırlıkça mililitre başına beş miligram NHS Sulf O lc, Hank'in tamponlu tuz çözeltisinde biotin içeren bir çözelti hazırlayın. Konsolları 15 dakika boyunca çözeltiye batırın.Bu reaksiyon, CY ve uç hidroksi oksidi konjuge eder ve konsolların yüzeyinde biyotin molekülleri sunar. Bir gün önce, %20 serum içeren 20 mililitre vexcel kültür ortamını 200 mikrolitre strept ENC kaplı boncuklarla birleştirerek biyotin içermeyen bir besiyeri çözeltisi hazırlamaya başlayın ve dönerken 12 saat inkübe edin. Deney gününde.Manyetik boncukları iki dakika boyunca bir mıknatısla tüpün dibine çekin ve biyotin içermeyen süper natan ortamını yeni bir tüpe aktarın. Ortamı 0,22 mikrometrelik bir filtreden geçirerek sterilize edin ve yeni bir tüpe koyun. Bir sonraki adım, akış odasını hücre kültürü kabından çıkarmak ve daha sonra hücreleri iki mililitre 37 santigrat derece, biyotin içermeyen ortamla üç kez yıkamaktır.Daha sonra 2.4 mikrometre çapında bir mikrogram, soyulmuş Aden kaplı boncuklar ekleyin. Hücre kültürü kabına mililitre başına 10 mikrogramlık bir konsantrasyon ekleyin ve yavaşça karıştırın. Ardından, A FM tib'yi bir strippin boncuğuna takarak ve düz bir cam yüzeye bastırarak kalibre edin.Bunu gerçekleştirmek için, ucu bir boncuğun yanındaki cam yüzeye indirin, ucu geri çekin, ardından konsolun tepesini boncuğun üzerine yerleştirin ve birkaç saniye aşağı bastırın. Son olarak, numuneleri girintilemek için kalibre edilmiş konsolu kullanın. 2.4 mikrometre boncuklar, yumuşak glikokaliks tabakasının mekanik özelliklerinin daha kolay tespit edilebilmesi için hücre yüzeyi ile daha geniş bir temas alanı sunar.Bu pozisyonu gerçekleştirmek için, hücre çekirdeğine yakın bir hücre üzerindeki konsol, konsol yüksekliğini hücre yüzeyinin yaklaşık üç mikrometre üzerine ayarlamak için ucun hücreye yumuşak bir yaklaşımını kullanın. Daha sonra yüzeyi saniyede bir mikrometre oranında 20 kez maksimum yedi kuvvete kadar girintileyin. Nano Newtonlar, ardışık temaslar arasında altı saniyelik bir sürenin geçmesine izin verir.Hertz teorisi ile ilgili denklemleri kullanarak glikokaliks tabakasının kalınlığını hesaplayın. F girinti kuvveti, delta'nın girinti derinliği olduğu bu denklem ile tanımlanır. R, küre yarıçapıdır ve estar, stres altındaki malzemelerin birleşik modülüdür.Kombine elastik modül estar'ı hücresel ve glikokaliks bileşenlerine ayırmak için, glikokaliks tabakasını hücre gövdesinin yüzeyinde düzgün, ince yumuşak bir film olarak ele alın ve Clifford'un iki katmanlı modelini kullanın ve bu denklemi C.In, PQ ve N, polimer uyumlarından ampirik olarak belirlenir. M, polimer modelinden bir sabittir ve Z, burada gösterilen denklemle ince film veya glikokaliks tabakasının kalınlığı ile ilişkilidir. Nano Newton cinsinden ölçülen A FM tarafından ölçülen kuvvet, yüzeyle temas ettikten sonra artmaya başlar ve başlangıçta glikokaliks tabakası bileşeni tarafından domine edilir.Glikokaliks tabakası sıkıştırıldığında, hücre gövdesi deformasyonun ana bileşeni haline gelir. Mavi iki katmanlı uyum çizgisi, hücre modülü, glikokaliks, katman modülü ve glikokaliks katman kalınlığının tümü belirlenebilen, kullanılan denklemden kırmızı ile gösterilen girinti verileriyle eşleşmesini sağlamak için dört serbest parametrenin uydurulmasıyla hesaplandı. 25 hücrenin özellikleri burada gösterilen histogramda derlendi.Ortalama glikokaliks tabaka modülü 0.7 artı veya eksi 0.5 kipacal, glikokaliks tabaka kalınlığı ise 380 artı veya eksi 50 nanometre olarak belirlendi. Bu yaklaşım bize, iltihaplanma sırasında hücre yapışmasını düzenlemede glikokaliksin rolü hakkındaki temel soruları yanıtlamak için ihtiyaç duyduğumuz aracı sağlar. Artık iltihaplanma sırasında glikokaliksin özelliklerinin nasıl değiştiğiyle ilgili soruları ele alabiliyoruz.Bu değişiklikler hangi yollarla gerçekleştirilir. Bu yaklaşım çeşitli şekillerde genişletilebilir. Örneğin, glikokaliksin özelliklerinin yeni, daha karmaşık teorik açıklamalarını test etmek için kullanılabilir.Ya da daha pratik bir düzeyde, bu, implante edilebilir cihazları konakçıdaki bağışıklık tepkisinden korumak için tasarlanmış biyo-esinlenmiş yüzey kaplamalarını test etmek için kullanılabilir. Çalışmalarımıza gösterdiğiniz ilgi için çok teşekkür ederiz.

quantifying-mechanical-properties-endothelial-glycocalyx-with-atomic

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Ekstraselüler matriksin sertliği kuvvetle yapışık hücrelerinin birden fazla davranışları etkiler. Matrix sertliği bir doku boyunca mekansal değişir ve çeşitli hastalık koşullarında değişiklik uğrar. Burada atomik kuvvet mikroskobu microindentation kullanarak fare akciğer dokusunun normal ve fibrotik sertliği mekansal farklılıklar karakterize etmek için yöntemler geliştirmek.

Atomik Kuvvet Mikroskobu kullanarak Akciğer Doku Mikro-Mekanik Karakterizasyonu

Bu videoda, hücre dışı matris sertliğine bağlı Listeria monocytogenes'in endotel hücreleri yoluyla yayılımını değerlendirmek için kantitatif hızlandırılmış mikroskopi gösterilmektedir. Daha yumuşak bir hidrojel, daha sert muadillerine kıyasla endotel hücreleri yoluyla daha hızlı bakteri yayılımını kolaylaştırır ve matris sertliğinin bakteri yayılımı üzerindeki etkisini vurgular.

Hücre Dışı Matriks Sertliğine Bağlı Bakteri Yayılımını Değerlendirmek için Kantitatif Hızlandırılmış Mikroskopi

Endotelyal endotel / glycocalyx yüzey tabakası ideal intravital mikroskobu kullanılarak incelenmiştir. Intravital mikroskop teknik gibi akciğer gibi hareketli bir organ zordur. Biz eş zamanlı aydınlık ve floresan mikroskop serbestçe-hareket eden endotel yüzey tabakasının kalınlığını belirlemede nasıl kullanılabileceğini...

Fare Pulmoner Endotelyal Yüzey Katman in vivo ölçümü olarak

Bu kağıt bir atomik kuvvet mikroskobu (AFM) kullanarak microindentation ile canlı hücrelerin mekanik özelliklerini karakterize etmek için bir protokol göstermektedir.

Atomik Kuvvet Mikroskobu kullanarak Yaşam Hücrelerinin Mekanik Özellikleri Ölçme

Bir endotel hücre tek tabakası içindeki gerçek yapışkan hücre sayısının kantitasyonuna izin veren bir in vitro yöntem sunuyoruz.

Endotel Hücre yapışma miktarının belirlenmesi<em&gt; In Vitro</em

Aortların fareden izolasyonu ve atomik kuvvet mikroskobu kullanılarak elastik modüllerinin ölçümü için ayrıntılı protokoller sunuyoruz.

sertliği ölçme<em&gt; Ex Vivo</emAtomik Kuvvet Mikroskobu Kullanma&gt; Fare aorta

Biz immunolojik çalışmalar için tek bir T hücresi ve boncuk parçacık ile Atomic Force mikroskop (AFM) konsol functionalize bir protokol sunuyoruz. AFM tarafından tek çifti T hücreli dendritik hücre bağlayıcılığı araştırması ve makrofajların gerçek zamanlı hücresel tepkisi ile AFM tarafından floresans görüntüleme ile tek bir katı parçacığın izlenmesi için prosedürler gösterilmektedir.

Tek-T hücreleri veya tek parçacık Immünolojik tek hücreli kuvvet spektroskopisi ile Atomic Force mikroskop Cantilevers functionalization

Burada, connexin 43 arasındaki boşluk kavşağını bozacak ve bunun endotel biyomekaniği üzerindeki etkisini çekişler ve hücreler arası gerilimlerin gözlemi yoluyla ölçmek için mekanik tabanlı bir protokol salıyoruz.

Connexin 43 Yapısal Bozulma ile Perturbing Endotel Biyomekanik

UV'ye yakın litografi ve çekiş kuvveti mikroskopisi, mikropatterned hidrojeller üzerindeki hücresel kuvvetleri ölçmek için birleştirilir. Tek hücrelerin hedeflenen ışık kaynaklı salınımı, aynı numune üzerinde yüksek sayıda ölçüm sağlar.

Çekiş Kuvveti Mikroskopisinde Uygulamalar için Hidrojel Desenleme Teknikleri Kullanılarak Hücre Yapışıklıklarının Kontrolü

Bir atomik kuvvet mikroskobu (AFM) prob ucu tarafından bir numune yüzeyine uygulanan temas alanının ve kuvvetin ölçülmesi, nano ölçekli mekanik özellik belirlemeyi mümkün kılar. Elastik modülü veya diğer nanomekanik özellikleri ölçmek için yumuşak ve sert numunelerde havada veya sıvıda AFM konsol bazlı nanogirinti uygulamak için en iyi uygulamalar tartışılmaktadır.

Atomik Kuvvet Mikroskobu Konsol Tabanlı Nanogirinti: Hava ve Sıvıda Nanoölçekte Mekanik Özellik Ölçümleri

Bu protokol, murin akciğer dokusunun kriyoseksiyonlarının nasıl hazırlanacağını, atomik kuvvet mikroskobu kuvvet haritası deneylerinin nasıl gerçekleştirileceğini ve doğal murin pulmoner bazal membranının Young modülünü belirlemek için verilerin nasıl analiz edileceğini görselleştirir.

Atomik Kuvvet Mikroskobundan Türetilmiş Kuvvet Haritalarından Doğal Murin Pulmoner Bazal Membranlarının Young Modülünün Çıkarılması

Keşfedin, atomik kuvvet mikroskobu ile endotelyal glikokaliks mekanik özelliklerini doğrudan ölçme yöntemini. Bu teknik, canlı hücrelerde glikokaliks modülü ve kalınlığını nicel olarak belirlemeyi sağlar.

Atomik Kuvvet Mikroskobu ile Endotelyal Glycocalyx Mekanik Özelliklerinin nicel

Daha fazla video keşfet