Name: Mikrobiyal Systems Biyoloji Chemostats Kullanımı (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-14T20:45:00.000+00:00
Duration: 13 min 19 s
Description: Keşfedin chemostat kullanımı ile mikrobiyal sistemler biyolojisinde sürekli hücre kültürü ve büyüme hızı kontrolü. Bu yöntem, hücre fizyolojisi ve adaptif evrim araştırmaları için kararlı deney koşulları sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma fonlar New York University oluşturmak başlatmak tarafından desteklenmiştir. Biz başlangıçta chemostats olarak Sixfors biyoreaktörlerin kullanımını geliştirdi Maitreya Dunham ve Matt Brauer teşekkür ederim.

Bir kemostat kullanarak sürekli kültür ilkesi uygulamaları çeşitli elde edilebilir. Bütün chemostats olarak tüm bileşenlerin steriliteyi korumaya 1) yöntemleri olması esastır, 2), iyi karıştırılmış, kültür, kültür kabı 3), uygun havalandırma ve ortam toplama ve kültür kaldırma 4) güvenilir bir araç. Burada, hali hazırda alternatif kurulumları için adapte edilebilir yöntemler kullanılarak, kemostat bir Sixfors biyoreaktör (Infors Inc) kullanımını tarif eder. 1.. Kemostat Gemiler Montaj <ol><li> Ana düğmeyi kullanarak Sixfors açın. </li><li> Iyice kemostat gemi, karıştırıcı montaj, ve deiyonize (DI) su ile ekli boru durulayın. Tüm boru ve o-halkaları kontrol edin ve herhangi bir yıpranmış görünümlü parçaları değiştirin. </li><li> Tahrik mili destek tabanı cam kap içinde ve tahrik milinin üst karıştırma düzeneği üzerinde yuva içine geçerek olduğu yukarı baktığından emin olun. Stirre ayarlayınTahrik milinin alt sağlanması cam kabına r düzeneği tahrik mili destek oturduğundan. Cam kabına karıştırma tertibatını sağlamak için kelepçenin kullanın. </li><li> DI suyun yaklaşık 300 ml damar doldurun. </li><li> Prob (2 dO) ve alt muhafazayı sökerek ve alt kılıf elektrolit solüsyonu ile yarım dolu olduğundan emin yaparak elektrolit seviyesini kontrol edin, bir çözünmüş oksijen kapaklarını çıkarın. Alt kasa Rescrew ve kemostat gemide noktasına takın. Parmak Sımsıkı kadar vidalayın. </li><li> PH probu alın ve depolama tamponu (3 M KCl) çıkarın. PH probu kapağını çıkarın ve fermentörüne 1 ekleyin. Sixfors kontrol ekranını kullanarak, fermentörü parametre menüsüne gidin ve &quot;pH kalibre&quot; seçeneğini seçin. Standart bir pH 7 tampon ve Yüksek Okudum kayıt okuma içine pH probu yerleştirin. PH 4 tamponu ve Düşük okuyun gibi rekor okuma ile tekrarlayın. Fermantörden pH probu ayırın, DI su ile yıkayın ve prob int eklemeko kemostat gemide liman. Parmak Sımsıkı kadar vidalayın. </li><li> Rafa kemostat gemi yerleştirin. PH değeri sonda bağlanır ve kalibre edilmiştir fermantör (1-6) kabın hakkında not. PH probu üzerinde pH prob kapağı yerleştirin. Folyo kullanarak sıkıca dO 2 prob üst kapağı. </li><li> , Kemostat kabına bağlı boru uçlarından folyo katlayın. </li><li> Tekrar tüm gemiler için 1,2-1,8 adımları. </li><li> Bir sıvı döngüsü 15 dakika boyunca, onları otoklav ile sterilize damarları. </li></ol> 2. Medya hazırlanması <ol><li> Farklı besin konsantrasyonlarda toplu büyüme kültürleri ile bir gıda maddesi için konsantrasyonlarının sınırlayıcı aralığını oluşturulması. Nihai hücre yoğunluğu başlangıçtaki besin konsantrasyonunun doğrusal bir fonksiyonu (Şekil 4) olduğu besin aralığında sınırlamaktadır. De sınırlayan aralığında bir besleyici konsantrasyonu seçin. Saccharomyce birlikte çalışmaları için, standart ortam bileşimin örnekleris cerevisiae 7-11 mevcuttur. </li><li> Önce medya hortumun ucu folyo kaplı emin olduktan sonra bir hava girişi ve medya çıkış içeren bir lastik tıpa ile kapatılmış boş damacana otoklavlayın. </li><li> Ayrı bir kap içinde 10 L ortam hazırlar. </li><li> 100 ml&#39;lik bir şişe için bir ortam 500 ml filtre fincan takın. Etanol içinde sterilize forseps ile pamuk filtreyi kaldırmak ve hemen medya damacanaya filtrasyon noktasına takın. </li><li> Filtre fincan ekleyerek ortamı sterilize bir vakum kaynağına ve filtre medya damacana takın. </li><li> Ortam filtrasyon işlemi tamamlandığında, metal bir kelepçe ile filtrasyon noktasını kapatmaktadır. </li></ol> 3. DO 2 Probları kalibre ve Kemostat ayarlama <ol><li> Kemostat gemiler otoklava ve karşılık gelen ısı ceketi burası gemi soğumasına izin alındıktan sonra. Sıcaklık probu, pH probu ve dO 2 probu bağlamak. Letdamar dO 2 sondalar kutuplaşmaya izin vermek için en az 6 saat süreyle gücü ile otur. </li><li> Ayrı bir toplama deponun her bir çıkış borusunun ucunu. Otoklavlanmış filtre aracılığıyla hava kaynağını bağlayın ve hava akımı açın. Her bir kap içinde su her bir tıkaç oluşturduğu olduğunu gösterir, çıkış borularının üzerinden akmalıdır. </li><li> İstenilen çalışma hacminin (örneğin 300 ml) &#39;ye göre çıkış borusunun yüksekliği ayarlayın. Biz farklı çalışma hacimleri kalibre tüp yerleşimler ile işaretlenmiş bir cetvel kullanın. </li><li> , Kemostat kabına ortam damacana bağlayın. Tüpü tutmak için etanol kullanarak mümkün olduğu kadar steril sona erer. Pompa ve açık kelepçe ile pompa hortumu geçirin. Medya kemostat kabına akmaya başlayıncaya kadar elle pompayı basın. Pompadan boru bırakın, medya kemostat kabına serbestçe akmalıdır. Medya atık borusunu ulaştığında, pompa ve boru kelepçe takın. </li><li> Ru başlayınpervane 400 rpm seti ve 30 ° C&#39;ye ayarlanmış sıcaklık ile temel programı nning </li><li> , DO 2 sondaları kalibre hava beslemesini kapatın ve azot gazına geçmek için. &quot;Düşük okuma&quot; gibi en az bir saat ve kayıt ölçü değeri bekleyin. Geri (yani ortam oksijen konsantrasyonu içeren) hava kaynağına geçiş &quot;yüksek okuma&quot; gibi en az bir saat daha kayıt ve ölçüm bekleyin. </li><li> Iris yazılımı kullanarak veri kaydı başlatın. </li></ol> 4. Aşılama <ol><li> Kültür kabın üst sterilize etmek için% 70 etanol kullanın. </li><li> , Kemostat kabına kap üst ve pipet bir gecelik kültürü için 1 ml ilgili vida çıkarın. Vidayı tekrar sıkın. </li><li> Iris aşılama zamanı gösterir. </li><li> Kültürler, erken durağan fazı ulaşmak için yaklaşık 24 saat bekleyin. Kültür büyüdükçe, çözünmüş oksijen ve pH azalır. Glikoz, sınırlayıcı ortam durumunda, çözünmüş oksijen sabit pha olarak ~% 100 geri dönecektirse. Diğer sınırlamalar besin için çözünmüş oksijen durağan faz olarak &lt;% 100 kalır. </li></ol> 5. Pompalar başlatılıyor ve Steady State Kavuşturulması <ol><li> Seyreltme oranı kültür hacmi ile (ne kadar ortam saatte tekneye döküldüğü) akış hızını bölünmesi ile hesaplanır. Örneğin, 300 ml 0.1 arasında bir seyreltme oranı, bir hacim kullanılarak ortam 30 ml kültüre her saat ilave edilir demektir. Sistem, aynı ses kültür sürekli olarak seyreltilmiştir sağlayarak kabın kaldırılır pozitif basınç altında olduğu için. Seyreltme oranları (D) ihtiva eden bir dizi hücre, kemostat yıkanarak olacak, yukarıda hücrelerin maksimum büyüme oranı (μ max), aşmamak kullanılabilir. </li><li> İstenilen akış hızını kurmak için, pompa üzerinde ve kapalı saniye sayısını belirtmek pompa ayarlarını seçin. Pompa ~ 0.11 ml / sn &#39;lik bir oranda ortam sunar. </li><li> Sixfors int kullanarak bir program tanımlayınPompa zamanlama, sıcaklık ve kanatçıklı hızını belirtir Hiperface. Programını başlatın. </li><li> Sıvı toplanması kapları boşaltın ve saati kaydedin. </li><li> En az iki saat sonra, kabın kaldırılmıştır ne kadar ortam ölçmek için bir dereceli silindir kullanır. Bu, kemostat kabına ilave edilmiş ses eşit olacaktır. Seyreltme oranı (D = V çıkış / V kültür / saat) hesaplayın. Hesaplanan seyreltme oranı istenilen seyreltme oranına uygun değilse pompa ayarlarını yapın. </li><li> Kararlı durumda, Kemostat hücre yoğunluğu zamanla değişmez. Bu çıkış örnekleme ile kültür bozucu olmadan ölçülebilir. Biz operasyonel en az bir nüfus iki katına ayrılır özdeş hücre yoğunluğu ölçümleri gibi istikrarlı devlet ulaşılmasını tanımlar. Kararlı duruma ulaşma kültürü seyreltme başlandıktan sonra yaklaşık sekiz kültür nesiller alacaktır. Kararlı durumda, hücreler yani (katlanarak büyüyecekbesin sınırlı koşullar zamanla e. sabit büyüme oranı). Nüfusun (üretim süresi) katlama zamanı ln (2) / D. </li><li> Aralıklarla sabit bir seyreltme oranı muhafaza edilmesini sağlamak için deney süresince çıkış birimleri ölçmek için devam edin. </li></ol> 6. Uygulama 1: Kararlı durum Koşullarında Farklı fiyatlara Yetiştirme Eğitim Hücreleri <ol><li> Kemostat istikrarlı halde, hücrelerin nüfus artış hızı seyreltme oranına eşittir. Sistematik seyreltme oranını değiştirerek farklı oranlarda hücre büyümesi mümkündür. Bu hücre hacmi, hücre döngüsü aşaması ve gerilme direnci dahil olmak üzere bir büyüme oranı ile değişir fizyolojik parametrelerin sistematik bir çalışma sağlar. Buna ek olarak, küresel mRNA, protein ve metabolit seviyelerinin kararlı durum profilleri farklı oranlarda büyüyen hücrelerde analiz edilebilir. Örnekleri elde etmek için iki yol vardır: </li><li> Küçük örnekler pasif ob olabilirBir 1.5 ml veya 15 ml tüp içine çıkış borusunun ucunu yerleştirerek saklanmaktadır. 1-5 ml&#39;lik bir örneği (akış hızına bağlı olarak) birkaç dakika içinde elde edilebilir. Birçok fizyolojik parametreler, bu örneklerden ölçülebilir. </li><li> Gen ifadesi, ya da metaboliti analizler mümkün olduğunca çabuk elde edilmesi gereken daha büyük örnekleri gerektirir. 15 ml konik bir tüp içine çıkış borusunun ucunu. Atık borusunun metal ucunu tutarak vidayı bırakın ve yavaşça aşağı doğru itin. A ~ 10 ml numune hızla tüp dolduracaktır. Kemostat kapta hacmi değişti unutmayın. Birçok ardışık numuneler alınır eğer bir sabit seyreltme oranını korumak için akışını azaltmak için gerekli olabilir. </li></ol> 7. Uygulama 2: Sitometrisi-tabanlı Yarışması Tahliller kullanma Kontrollü Ortamlarda Genotiplerinin Arasındaki Artış Oranları Farklılıkların hassas ölçümü <ol><li> Chemostats doğru besin konsantrasyonunun etkisini ölçmek için kullanılabilirfarklı genetik geçmişleri arasındaki büyüme oranları (yani spor) farklılıklar üzerine. Farklı floresan ile etiketlenmiş proteinleri ortak kültür suşları ile üstel büyüme sırasında rölatif çokluk içinde değişim oranı belirlenir. Farklı seyreltme oranı (D), bu deneyi gerçekleştirmek spor farkların besleyici madde konsantrasyonu (ler) etkileri çalışma sağlar. </li><li> Aynı seyreltme oranları ve 300 ml&#39;lik bir hacme sahip ayrı kemostat damarlarda iki suşların sabit durum kültürleri oluşturulması. </li><li> Pasif her bir kabın 1 ml numune. Hücreleri aşağı Spin, fosfat tekrar süspansiyon 4 ° C&#39;de tuzlu su (PBS) ve yer tamponlu Bu örnekler daha sonra akış sitometrisi analizi için kontroller homojen hücre örnekleri, içerir. </li><li> Bir otoklav dereceli bir silindir içine bir kabından çıkış tüpü yerleştirin. Atık borusunun metal ucunu tutarak vidayı bırakın ve yavaşça Kemostat hücreleri çıkarmak için aşağı doğru itin. Ne zamanhacmi, orijinal pozisyonuna (300 mi) ile çıkış borusunun metal ucunu döndürmek, 150 ml ulaşır. Farklı bir dereceli silindir kullanarak, ikinci kap ile tekrarlayın. </li><li> , Kemostat kabın üstüne vidayı kaldırılırken sterilliği korumak için,% 70 etanol kullanın. Açıklığında huni ve kemostat damar içine, diğer kültürden 150 ml dökün. Vidayı tekrar sıkın. İkinci hunisi kullanılarak, ikinci kap ile tekrarlayın. Her kemostat kap artık iki suş bir karışımını içerir. </li><li> Her 2-6 saatte pasif örnekleme kullanılarak her bir kap bir 1 ml bir örnek elde edilir. Hücreleri aşağı Spin, tekrar süspansiyon 4 ° C&#39;de PBS ve mağaza 2-3 gün dikkatle her numune alındığı zaman kayıt için numune almaya devam. </li><li> Deney, sonikasyon sonunda ve örnekleri ~ 2 x 10 6 hücre / ml &#39;ye seyreltilir. Akış sitometresi kullanılarak, her bir numune iki suşların oranını ölçer. Her iki suşları katlanarak büyüyor gibi, göreli büyüme oranı farkısüresi (nesiller olarak ölçülür) karşı ln lineer regresyon (strain1/strain2) ile belirlenmiştir. Regresyon eğimi diğer bir suş göreli (spor avantaj yani) büyüme oranında oransal fark olduğunu. </li><li> Karışık bir kültür, yeni bir kararlı duruma ulaşmak için biraz zaman alabilir, erken kez puan gerileme kötü uygun olabilir. Bu sorun, en iyi 2-3 nesiller örnekleme başlayan veya berrak aykırı değer olan erken noktaları çıkarmadan önce geçmesini sağlayarak çözülür. Bir suş diğer outcompeted kez tersine, veriler artık yararlıdır ve bu noktaları ekarte edilmelidir. </li></ol> 8. Uygulama 3: Deneysel Evrim <ol><li> Chemostats gerçekleştirilen deneysel evrim besin sınırlı ortamda uygunluk artmıştır mutantlar için seçer. Seçim genellikle nesiller yüzlerce üzerinde gerçekleştirilir. </li><li> Bir gerginlik kullanarak istikrarlı bir devleti kemostat kültür kurmakbilinen genotip (ve tercihen, bilinen genom dizisi) ve belirli bir besin sınırlama. </li><li> Adapte nüfusun bir &quot;fosil kayıtlarını&quot; korumak için pasif 2-3 günde Kemostat örnek ve -80 ° C&#39;de% 15 gliserol örneği saklamak </li><li> Medya rezervuar izlemek ve gerektiğinde taze medya ile doldurmak. </li><li> Birkaç yüz nesiller için katlanarak büyüyen kültürünü korumak. </li><li> Seçim levhası katı agar plakaları üzerinde bir hücre numunesi tamamlandıktan sonra. Hücreler koloniler haline sonra kürdanlar kullanılarak koloni ilgili bir örnek almak ve ortam ihtiva eden 100 ul, 96 oyuklu bir plakanın oyuklarına ayrı klonlar inoküle. Klonal örnekleri, gece boyunca büyümeye -80 ° de% 30 gliserol ve deposunun 100 ul ekle izin ver </li><li> Tüm genom sekanslama ve uygulama 2&#39;de tarif edildiği gibi, uygunluk değerlendirilmesi dahil olmak üzere fenotipik Analizleri yapan ortak bir flüoresan etiketli referans suşu kullanılarak klonlar karakterize eder. &#39;/ Li&gt; </ol>

<ol><li>Ingraham, J. L., Maaloe, O., Neidhardt, F. C. Growth of the Bacterial Cell. , Sinauer Associates, Inc. (1983).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Cell+Growth%3A+Control+of+Cell+Size%22">Cell Growth: Control of Cell Size</a>. Hall, M. N., Raff, M. C., Thomas, G. , CSHL Press. (2004).</li>
<li>Monod, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((La+technique+de+culture+continue%2C+theorie+et+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Inst.+Pasteur%22%5BJournal%5D)">La technique de culture continue, theorie et applications.</a> Ann. Inst. Pasteur. 79, 390-410 (1950).</li>
<li>Novick, A., Szilard, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Description+of+the+chemostat%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Description of the chemostat.</a> Science. 112, 715-716 (1950).</li>
<li>Kjeldgaard, N. O., Maaloe, O., Schaechter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transition+between+different+physiological+states+during+balanced+growth+of+Salmonella+typhimurium%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The transition between different physiological states during balanced growth of Salmonella typhimurium.</a> J. Gen. Microbiol. 19, 607-616 (1958).</li>
<li>Maaloe, O., Kjeldgaard, N. O. Control of macromolecular synthesis. , W.A. Benjamin. (1966).</li>
<li>Saldanha, A. J., Brauer, M. J., Botstein, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutritional+Homeostasis+in+Batch+and+Steady-State%5BTitle%5D)+AND+%22Culture+of+Yeast.+Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Nutritional Homeostasis in Batch and Steady-State.</a> Culture of Yeast. Mol. Biol. Cell. 15, 4089-4104 (2004).</li>
<li>Boer, V. M., Crutchfield, C. A., Bradley, P. H., Botstein, D., Rabinowitz, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth-limiting+intracellular+metabolites+in+yeast+growing+under+diverse+nutrient+limitations%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Growth-limiting intracellular metabolites in yeast growing under diverse nutrient limitations.</a> Mol. Biol. Cell. 21, 198-211 (2010).</li>
<li>Boer, V. M., de Winde, J. H., Pronk, J. T., Piper, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genome-wide+transcriptional+responses+of+Saccharomyces+cerevisiae+grown+on+glucose+in+aerobic+chemostat+cultures+limited+for+carbon%2C+nitrogen%2C+phosphorus%2C+or+sulfur%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The genome-wide transcriptional responses of Saccharomyces cerevisiae grown on glucose in aerobic chemostat cultures limited for carbon, nitrogen, phosphorus, or sulfur.</a> J. Biol. Chem. 278, 3265-3274 (2003).</li>
<li>Brauer, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordination+of+growth+rate%2C+cell+cycle%2C+stress+response%2C+and+metabolic+activity+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Coordination of growth rate, cell cycle, stress response, and metabolic activity in yeast.</a> Mol. Biol. Cell. 19, 352-367 (2008).</li>
<li>Gresham, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptation+to+diverse+nitrogen-limited+environments+by+deletion+or+extrachromosomal+element+formation+of+the+GAP1+locus%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Adaptation to diverse nitrogen-limited environments by deletion or extrachromosomal element formation of the GAP1 locus.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 18551-18556 (2010).</li>
<li>Regenberg, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth-rate+regulated+genes+have+profound+impact+on+interpretation+of+transcriptome+profiling+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Growth-rate regulated genes have profound impact on interpretation of transcriptome profiling in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genome Biol. 7, R107(2006).</li>
<li>Castrillo, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+control+of+the+eukaryote+cell%3A+a+systems+biology+study+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol%22%5BJournal%5D)">Growth control of the eukaryote cell: a systems biology study in yeast.</a> J. Biol. 6, 4(2007).</li>
<li>Cipollina, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revisiting+the+role+of+yeast+Sfp1+in+ribosome+biogenesis+and+cell+size+control%3A+a+chemostat+study%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Revisiting the role of yeast Sfp1 in ribosome biogenesis and cell size control: a chemostat study.</a> Microbiology. 154, 337-346 (2008).</li>
<li>Gresham, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((System-level+analysis+of+genes+and+functions+affecting+survival+during+nutrient+starvation+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">System-level analysis of genes and functions affecting survival during nutrient starvation in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 187, 299-317 (2011).</li>
<li>Levy, S. F., Ziv, N., Siegal, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bet+hedging+in+yeast+by+heterogeneous%2C+age-correlated+expression+of+a+stress+protectant%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Bet hedging in yeast by heterogeneous, age-correlated expression of a stress protectant.</a> PLoS Biol. 10, e1001325(2012).</li>
<li>Kao, K. C., Sherlock, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+of+clonal+interference+during+adaptive+evolution+in+asexual+populations+of+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization of clonal interference during adaptive evolution in asexual populations of Saccharomyces cerevisiae.</a> Nat. Genet. 40, 1499-1504 (2008).</li>
<li>Gresham, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+repertoire+and+dynamics+of+evolutionary+adaptations+to+controlled+nutrient-limited+environments+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">The repertoire and dynamics of evolutionary adaptations to controlled nutrient-limited environments in yeast.</a> PLoS Genet. 4, e1000303(2008).</li>
<li>Wenger, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hunger+Artists%3A+Yeast+Adapted+to+Carbon+Limitation+Show+Trade-Offs+under+Carbon+Sufficiency%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Hunger Artists: Yeast Adapted to Carbon Limitation Show Trade-Offs under Carbon Sufficiency.</a> PLoS Genet. 7, e1002202(2011).</li>
<li>Dunham, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristic+genome+rearrangements+in+experimental+evolution+of+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Characteristic genome rearrangements in experimental evolution of Saccharomyces cerevisiae.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 16144-16149 (2002).</li>
<li>Ronen, M., Botstein, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+response+of+steady-state+yeast+cultures+to+transient+perturbations+in+carbon+source%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Transcriptional response of steady-state yeast cultures to transient perturbations in carbon source.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 389-394 (2006).</li>
<li>Kresnowati, M. T. A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((When+transcriptome+meets+metabolome%3A+fast+cellular+responses+of+yeast+to+sudden+relief+of+glucose+limitation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Sys.+Biol%22%5BJournal%5D)">When transcriptome meets metabolome: fast cellular responses of yeast to sudden relief of glucose limitation.</a> Mol. Sys. Biol. 2, 49(2006).</li>
<li>Tu, B. P., Kudlicki, A., Rowicka, M., McKnight, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Logic+of+the+yeast+metabolic+cycle%3A+temporal+compartmentalization+of+cellular+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Logic of the yeast metabolic cycle: temporal compartmentalization of cellular processes.</a> Science. 310, 1152-1158 (2005).</li>
<li>Tzur, A., Kafri, R., LeBleu, V. S., Lahav, G., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Growth+and+Size+Homeostasis+in+Proliferating+Animal+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cell Growth and Size Homeostasis in Proliferating Animal Cells.</a> Science. 325, 167-171 (2009).</li>
<li>Conlon, I., Raff, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size+control+in+animal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Size control in animal development.</a> Cell. 96, 235-244 (1999).</li>
<li>Conlon, I. J., Dunn, G. A., Mudge, A. W., Raff, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+control+of+cell+size%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Extracellular control of cell size.</a> Nat. Cell Biol. 3, 918-921 (2001).</li>
<li>Fussmann, G. F., Ellner, S. P., Shertzer, K. W., Hairston, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crossing+the+hopf+bifurcation+in+a+live+predator-prey+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Crossing the hopf bifurcation in a live predator-prey system.</a> Science. 290, 1358-1360 (2000).</li>
<li>Cohen, E. P., Eagle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simplified+chemostat+for+the+growth+of+mammalian+cells%3A+characteristics+of+cell+growth+in+continuous+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">A simplified chemostat for the growth of mammalian cells: characteristics of cell growth in continuous culture.</a> J. Exp. Med. 113, 467-474 (1961).</li>
</ol>

Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarlarını olmadığını beyan ederim.

Chemostats büyüme kontrollü kararlı hal koşulları mikropların ekimi etkinleştirin. Hücreler, değişmeyen bir dış çevre ile sonuçlanan sabit bir oranda sürekli olarak büyür. Bu durum, dış çevre, sürekli değişen ve hücre büyüme oranı çevre ve genotip karmaşık etkileşimi ile belirlenen küme kültür yöntemlerin aksine bulunmaktadır. Bu nedenle, toplu kültürler üzerinde chemostats içinde mikropları kültür önemli bir avantajı, deneysel olarak hücrelerin büyüme hızını kontrol etme yeteneğidir. Bir hü...

Hücrelerin büyümesi, genetik ve çevresel faktörler 1,2 etkileşen kompleks ağlarda düzenlenir. Hücre büyümesi çok faktörlü yönetmelik çalışmada bir sistem düzeyinde yaklaşımı gerektirmektedir. Bununla birlikte, düzenlenmiş hücre büyümesinin sıkı çalışma deneysel olarak hücrelerin büyüme hızını kontrol zorluğu tarafından meydan. Ayrıca, hatta en basit deneylerde hücre-dışı koşullar, çoğaldıkları olarak hücreler sürekli olarak çevreyi değiştirmek sık olarak, dinamik ve karmaşıktır. , Tanımlanmış değişmez ve kontrollü ortamlarda hücre büyüme oranlarının deneysel kontrol edilmesini sağlar hücrelerin kültürlenmesi için bir yöntem: bu sorunlara bir çözüm, kemostat tarafından sağlanmaktadır. Bir kemostat kullanarak sürekli kültür ait yöntem, bağımsız bir şekilde, 1950&#39;de Monod 3 ve Novick ve Szilard 4 tarafından tanımlanmıştır. Aslen tasarlandığı gibi, hücreler con medya sabit bir ses yetiştirilentinually yeni medya eski ve ortam ve hücre eşzamanlı çıkarılması (Şekil 1) eklenerek seyreltildi. Akuple diferansiyel denklemler (Şekil 2) hücre yoğunluğunda (x) ve bir kap içinde, kemostat büyüme sınırlayıcı besin (ler) konsantrasyonundaki değişim oranını tarif eder. Önemlisi, denklem bu sistem kararlı durumda, hücrelerin (yani üstel büyüme hızı sabit) spesifik büyüme oranı oranına eşit olduğu olağanüstü ima ile bir tek (sıfır olmayan) kararlı kararlı durum (Şekil 3) tahmin bu da kültür (D) seyreltilir. Seyreltme oranı değiştirilerek, farklı büyüme oranları ve de besin sınırlama farklı koşullar altında hücrelerin kararlı hal popülasyonları kurmak mümkündür. Chemostats kullanarak büyüme hızı deneysel kontrolü nasıl hücre fizyolojisi değişiklikleri bir anlayışın geliştirilmesi için kritikbüyüme 5,6 oranları ile. Ancak, mikrobiyolojik yöntemlerle bu eski dayanak yirminci yüzyılda moleküler biyoloji araştırma patlama sırasında giderek belirsiz hale geldi. Bugün, mikrop ve çok hücreli organizmalar ve sistemler düzeyinde analiz için genom ölçekli yöntemler gelişiyle hem de büyüme kontrolü ilgiyi chemostats kullanımı için motivasyon yeniledi. Burada, biz hücre büyüme oranlarının hassas kontrolü ve chemostats kullanarak benzersiz mümkündür dış ortama yararlanmak üç uygulamalarını tanımlamak. Transkript ve metabolitler olarak - - koordineli bir büyüme oranı ile düzenlenir İlk olarak, biyomoleküllerin binlerce bolluğu araştırmak için chemostats kullanılmasını tarif eder. İkinci olarak, chemostats rekabet deneyleri kullanılarak sınırlı besin ortamlarında, farklı genotipler arasında büyüme hızı farklılıkları hassas tahminleri elde etmek için nasıl kullanılabileceğini açıklar. Üçüncü olarak, biz tarif nasıl chemostats yapabilirsinizSürekli besin-fakir ortamlarda büyüyen hücrelerin adaptif evrimini incelemek için kullanılabilir. Bu örnekler chemostats çevre etkileşimleri ve adaptif evrim tarafından hücre büyüme regülasyonu, gen sistemleri düzeyinde soruşturma sağlayan hangi bir şekilde sergilemiştir.

<table><tbody><tr><td>Infors-HT Sixfors Chemostat</td><td>Uygun Teknik Kaynaklar A.Ş.</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Cam Şişe 9.5 L</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-887-1</td><td>Medya Kabı ve Hortum için</td></tr><tr><td>Pinchcock</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-867</td><td>Medya Kabı ve</td></tr><tr><td>Hortum Tıpası, Boyut 12, Yeşil Neopren</td><td>Cole-Palmer</td><td>EW-62991-42</td><td>Medya Kabı ve Hortum için</td></tr><tr><td>Düz Konnektör</td><td>Cole-Palmer</td><td>EW-30703-02</td><td>Medya Kabı ve Hortum</td></tr><tr><td>Genel için Amaç Bağları 4 Fisher Scientific NC9557052'da</td><td></td><td></td><td>Medya Kabı ve</td></tr><tr><td>Hortum Boruları için, Silikon Kauçuk Medya Kabı</td><td>ve Hortum Boruları için</td><td>B000FMWTDE Küçük Parçalar</td><td></td></tr><tr><td>, Silikon, 3/8 OD</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-587-1Q</td><td>Medya Kabı ve Hortum Boruları için</td></tr><tr><td>, Silikon, 7/32 OD</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-587-1E</td><td>Medya Kabı ve Hortum için</td></tr><tr><td>Boru, Paslanmaz Çelik, 3/16 inç OD</td><td>McMaster-Carr</td><td>6100K164</td><td>Medya Kabı ve Hortum Boruları için</td></tr><tr><td>, Paslanmaz Çelik, 3/8 inç</td><td>OD McMaster-Carr</td><td>6100K161</td><td>Medya Kabı ve Hortum</td></tr><tr><td>Kancası Konnektörleri</td> için Medya <td>Kabı ve Hortum</td>için <td>Fisher Scientific</td><td>14-66-18Q</td></tr><tr><td>Cırcır Kelepçesi</td><td>Cole-Palmer</td><td>EW-06403-11</td><td>Medya Kabı ve Hortum</td></tr><tr><td>Luer için, Medya Kabı</td><td>ve Hortum</td>Luer için Dişi <td>Cole-Palmer</td><td>EW-45512-34</td></tr><tr><td>, Medya</td><td>Kabı ve Hortum</td>için Erkek <td>Cole-Palmer</td><td>EW-45513-04</td></tr><tr><td>Millipore Aervent MTGR05010 62 mm Filtre, 0.2 & mu; m</td><td>Fisher Scientific</td><td>MTGR05010</td><td>Medya Kabı ve Hortum</td></tr><tr><td>için PTFE Acrodisc CR 13 mm filtreler, 0.2 & mu; m</td> Medya <td>Gemisi ve Hortum için</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9131037</td></tr><tr><td>Hava için Doğrudan Okuma Akış Tüpü</td><td>Cole-Palmer</td><td>EW-32047-77</td><td>Azot Gazı Kurulumu için</td></tr><tr>Azot <td>Cole-Palmer</td><td>için Doğrudan Okuma Akış Tüpü</td><td>EW-32048-63</td><td>Azot Gazı Kurulumu için</td></tr><tr><td>Gaz Oranlayıcı Çok Tüplü Çerçeveler</td><td>Azot Gazı Kurulumu</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>için Cole-Palmer EW-03218-50Regülatör,</td><td>Azot Gazı</td>Kurulum Hortumu için İki Aşamalı Analitik <td>Hava Gazı</td><td>Y12-N145D580</td></tr><tr>, <td>Azot Gazı</td>Kurulum Hortumu için<td>Paslanmaz Çelik</td><td>Airgas</td><td>Y99-26450</td></tr><tr><td>Azot Gazı Kurulumu için</td><td>Erkek Adaptör</td><td>Airgas</td><td>WES544</td></tr><tr><td>Azot Gazı Kurulumu için</td><td>Norpren Boru</td><td>ABD Plastikleri</td><td>57280</td></tr><tr><td>Tripod Tabanı</td><td>Cole-Palmer</td><td>EW-03218-58</td><td>Azot Gazı Kurulum</td></tr><tr><td>Vanası Kartuşları</td><td>için Cole-Palmer</td><td>EW-03217-92</td><td>Azot Gazı Kurulumu için</td></tr><tr><td>Damacana 10 L</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-963-2A</td><td>Medya Hazırlama için</td></tr><tr><td>Steritop Steril Vakumlu Şişe Üstü Filtreler, 1.000 ml, PES membran; 45 mm boyun ölçüsü için</td><td>Fisher Scientific</td><td>SCGP-T10-RE</td><td>Medya Hazırlama</td></tr><tr><td>Şişesi için 100 ml, 45 mm boyun ölçüsü</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB-800-100</td><td>Medya Hazırlama için</td></tr><tr><td>kalsiyum klorür ve orta nokta; 2H2O</td><td>Fisher Scientific</td><td>C79-500</td><td>Medya Reaktifleri</td></tr><tr><td>sodyum klorür</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-1</td><td>Medya Reaktifleri</td></tr><tr><td>magnezyum sülfat ve orta nokta; 7H2O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>230391</td><td>Medya Reaktifleri</td></tr><tr><td>potasyum fosfat monobazik</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC424205000</td><td>Medya Reaktifleri</td></tr><tr><td>amonyum sülfat</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC423400010</td><td>Medya Reaktifleri</td></tr><tr><td>potasyum klorür</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9541</td><td>Medya Reaktifleri</td></tr><tr><td>borik asit</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B6768</td><td>Medya Reaktifleri</td></tr><tr><td>bakır sülfat ve orta nokta; 5H2O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>209198</td><td>Medya Reaktifleri</td></tr><tr><td>potasyum iyodür</td><td>Sigma Aldrich</td><td>60400</td><td>Medya Reaktifleri</td></tr><tr><td>ferrik klorür ve orta nokta; 6H2O</td><td>Fisher Scientific</td><td>I88-100</td><td>Medya Reaktifleri</td></tr><tr><td>manganez sülfat ve middot; H2O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>230391</td><td>Medya Reaktifleri</td></tr><tr><td>sodyum molibdat ve orta nokta; 2H2O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M7634</td><td>Medya Reaktifleri</td></tr><tr><td>çinko sülfat ve orta nokta; 7H2O</td><td>Fisher Scientific</td><td>Z68-500</td><td>Medya Reaktifleri</td></tr><tr><td>biotin</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP232-1</td><td>Medya Reaktifleri</td></tr><tr><td>kalsiyum pantotenat</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC24330-1000</td><td>Medya Reaktifleri</td></tr><tr><td>folik asit</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F7876</td><td>Medya Reaktifleri</td></tr><tr><td>inositol (diğer adıyla miyo-inositol)</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC12226-1000</td><td>Medya Reaktifleri</td></tr><tr><td>niasin (diğer adıyla nikotinik asit)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>N4126</td><td>Medya Reaktifleri</td></tr><tr><td>p-aminobenzoik asit</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC14621-2500</td><td>Medya Reaktifleri</td></tr><tr><td>piridoksin HCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9755</td><td>Medya Reaktifleri</td></tr><tr><td>riboflavin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R4500-25G</td><td>Medya Reaktifleri</td></tr><tr><td>tiamin HCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP892-100</td><td>Medya Reaktifleri</td></tr><tr><td>Lösin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L8000-100G</td><td>Medya Reaktifleri</td></tr><tr><td>Urasil</td><td>Sigma Aldrich</td><td>U0750</td><td>Medya Reaktifleri</td></tr><tr><td>Dekstroz</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0155-08-5</td><td>Medya Reaktifleri</td></tr></tbody></table>

mikrobiyal systems biyoloji chemostats kullanımı

The Use of Chemostats in Microbial Systems Biology

Hücreler, dış dünyaya gelen sinyallerine yanıt olarak büyüme hızını düzenler. Hücre büyüdükçe, çeşitli hücresel işlemleri makromolekül sentezi, metabolizma ve hücre bölünmesi döngüsü sonunda, bağlılık içeren koordine edilmelidir. Kemostat, deneysel olarak hücre büyüme hızının kontrol edilmesi için bir yöntem olup, sistematik olarak okuyan bir araç sağlar ne kadar güçlü bir büyüme etkileri hücresel süreçleri - ve hücre büyüme hızını kontrol eden düzenleyici ağlar - gen ifadesi ve metabolizma da dahil olmak üzere. Kuşak chemostats yüzlerce muhafaza zaman, hücre büyümesini sınırlamaya çevre koşullarında mikropların uyarlanabilir evrimini incelemek için kullanılabilir. Biz, kemostat kültürlerin ilkesi tanımlamak çalışmalarını gösteren ve çeşitli uygulama örnekleri sağlar. Yirminci yüzyılın ortasında kendi girişten sonra kullanmama dönemi takiben, ile genom ölçekli metodolojileri yakınsama bir yenilenditerest hücre büyümesi ve adaptif evrim moleküler temelinin düzenlenmesinde biyolojik araştırma chemostats kullanımında bir rönesans uyarıcı olduğunu.

Chemostats önemli bir avantajı seyreltme oranının değiştirilmesiyle deneysel olarak hücrelerin büyüme hızını kontrol etme yeteneğidir. Tomurcuklanma Mayalarda Saccharomyces cerevisiae, bir hücre morfolojisi, hücre bölünme döngüsündeki kendi fazın bilgilendirici. Daha yüksek büyüme oranları ile Nüfus unbudded hücrelerin fraksiyonu (Şekil 5A) ölçülerek belirlenir aktif olarak bölünen hücreler daha yüksek bir oranda içerir. Kemostat kültürlerde küresel mRNA ifadesinin analizi, çok sayıda genin ekspresyon d...

Hücre büyüme oranı düzenlenmiş bir süreç ve hücre fizyolojisi temel belirleyicisidir. Chemostats kullanılarak sürekli kültürü, hücre büyümesini ve ne kadar bu ağlar hücre büyümesini optimize etmek için moleküler evrim kontrol ağların çalışma kolaylaştırmak besin kısıtlaması hücre büyüme hızının dışsal kontrol edilmesini sağlar.

Mikrobiyal Systems Biyoloji Chemostats Kullanımı

Cells regulate their rate of growth in response to signals from the external world. As the cell grows, diverse cellular processes must be coordinated ...

Aşağıdaki sunumun genel amaçları; kemostat prensibini açıklamak, çalışmasını göstermek ve kemostat kullanan uygulama örnekleri sunmaktır. Bu, öncelikle hemostat kabının monte edilip ekim yapılması ve ardından eski besiyerinin ve hücrelerin sabit bir hızla uzaklaştırılırken sürekli olarak yeni besiyeri eklenmesiyle gerçekleştirilir. Matematiksel modelleme, her bir kemostat içindeki hücre yoğunluğundaki değişimi ve büyüme sınırlayıcı bir besinin konsantrasyonundaki değişimi tanımlar.Bu denklemlerin kullanımı; hücre ve besin konsantrasyonlarının sabit olduğu ve hücrelerin spesifik büyüme hızının, hücrelerin uzaklaştırılma hızına eşit olduğu tek bir sıfır olmayan kararlı durumun öngörülmesine olanak tanır. Kemostatlar içindeki hücre büyümesinin ve çevrenin hassas kontrolünün diğer teknolojilerle birleştirilmesi sonucunda, hücre büyüme regülasyonu, genetik değişiklikler ve adaptif evrim üzerine sistem düzeyinde incelemeler yapılmasına imkan tanıyan sonuçlar elde edilebilir. Bu hücre kültüreleme yönteminin diğer tekniklere göre temel avantajı, büyüme hızının kontrol edilebilmesi ve hücrenin dış ortamının sabit kalmasıdır.Bu yöntem; hücre büyüme regülasyonunun moleküler temeli nedir ve tanımlanmış ortamlardaki adaptif evrim nasıl gerçekleşir gibi, hücre biyolojisi ve evrim alanlarındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Hemostat kültürlerinin kurulması ve sürdürülmesi, dahil olan çok sayıda adım ve bileşen nedeniyle zor olduğundan, bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritik öneme sahiptir. İşleme öncelikle ana şalteri kullanarak six four sistemini açarak başlayın.Ardından; hemostat kabını, karıştırıcı düzeneğini ve bağlı hortumları deiyonize su ile iyice durulayın. Tüm hortumları ve O-ringleri kontrol edin ve aşınmış görünen parçaları değiştirin. Karıştırıcı düzenek ve tahrik mili monte edildikten sonra, kabı 300 milliliters DI su ile doldurun.Çözünmüş oksijen probunun elektrolit seviyesini kontrol ederek alt gövdenin yarıya kadar elektrolit çözeltisiyle dolu olduğundan emin olun. Ardından pH probunu kalibre edin. Kalibrasyon tamamlandıktan sonra probu fermentörden ayırın.DI su ile durulayın ve hemostat kabındaki porta yerleştirin. Parmakla sıkıca kapanana kadar vidalayın. Problar bağlandıktan sonra, pH probunun hangi fermentor ile kalibre edildiğini kabın üzerine not ettiğinizden emin olarak hemostat kabını rafa yerleştirin. Son olarak, pH probuna kapağı takarak ve çözünmüş oksijen probu ile tüm boş tüp uçlarını otoklav folyosu ile kapatarak probları ve tüpleri otoklavlamaya hazırlayın.Hava girişi ve medya çıkışı içeren bir kauçuk tıpa ile kapatılmış boş bir kap. Medya tüpünün ucunun folyo ile kapalı olduğundan emin olun. 100 mililitrelik bir medya şişesine 500 mililitrelik bir filtre kabı takın.Pamuk filtreyi, sterilize edilmiş ve etanolle temizlenmiş pensler yardımıyla filtreden çıkarın ve vakit kaybetmeden medya arabasındaki filtrasyon portuna takın. Medya arabasını bir vakum kaynağına ve filtreye bağlayın. Taze hazırlanmış 10 litre medyayı filtre kabına ekleyerek sterilize edin.Besiyerinin filtrasyonu tamamlandığında, filtrasyon portunu metal bir klemple kapatın. Hemostat kapları otoklavlanıp soğumaya bırakıldıktan sonra, kabı ilgili ısıtıcı cekete yerleştirin. Sıcaklık, pH probu ve çözünmüş oksijen probunu bağlayın.Çözünmüş oksijen problarının polarize olması için kabın gücü açık halde en az altı saat bekletin. Ardından, medya karbonatını hemostat kabına bağlayın. Tüp uçlarını mümkün olduğunca steril tutmak için etanol kullanın.Ardından, pompa tüpünü pompanın içinden geçirin ve klempi açın. Sonra, her bir çıkış tüpünün ucunu ayrı bir toplama kabına yerleştirin. Hava kaynağını bir otoklav filtresi aracılığıyla bağlayın ve hava akışını başlatın.Her bir kasın içindeki suyun atık tüplerinden dışarı akması gerekir; bu durum, tüm sızdırmazlıkların düzgün şekilde oluştuğunu gösterir. Atık tüpünün yüksekliğini, istenilen 300 mililitrelik çalışma hacmine göre ayarlayın. Besiyeri hemostat kabına akmaya başlayana kadar pompayı manuel olarak bastırın.Ardından boruları pompadan ayırın. Medya çıkış borusuna ulaştığında, boruları pompaya tekrar bağlayın ve medya ön hazırlığı tamamlanmış şekilde klempleyin. İmpeller hızı 400 RPM ve sıcaklık 30 °C olarak ayarlanmış temel programı çalıştırmaya başlayın.Ardından, hava beslemesini kapatıp nitrojen gazına geçerek çözünmüş oksijen problarını kalibre edin. En az bir saat bekleyin ve ölçülen değeri düşük okuma olarak kaydedin. Ortam oksijen konsantrasyonu içeren hava beslemesine geri dönün ve en az bir saat daha bekleyin.Bu ölçümü yüksek okuma değeri olarak kaydedin. Bu aşamada, inokülasyondan önce iris yazılımını kullanarak veri kaydını başlatın. Kültür kabının üst kısmını %70 etanol ile sterilize edin.Ardından, bir tornavida kullanarak kap portunu açın, bir mililitre gecelik kültürü kabın içine pipetleyin ve işlem bittiğinde vidayı tekrar yerine takın. Kültürler erken durağan faza ulaştığında, pompaları çalıştırın ve istenen akış hızını belirleyin. Pompanın açık ve kapalı kaldığı saniye sayısını belirleyerek, akış hızını ve kültür hacmini ayarlayın.Seyreltme hızını belirleyin. Six fours arayüzünü kullanarak, pompa zamanlaması sıcaklığını ve impeller hızını belirleyen bir program tanımlayın. Ardından programı en az iki saat sonra başlatın.Zamanı kaydedin ve kaptan ne kadar besiyerinin çıkarıldığını ölçmek için dereceli silindir kullanın. Çıkarılan miktar, hemostat kabına eklenen hacme eşit olacaktır; bu değer seyreltme hızını hesaplamak için kullanılabilir, dış akışı belirleyip hücre yoğunluğunu ölçmek için kullanılabilir. Hücre yoğunluğu zamanla değişmediğinde kararlı durum büyümesi sağlanmış olur.Kararlı duruma ulaşıldığında, çıkış tüpünden birkaç dakika boyunca pasif olarak bir toplama tüpüne akış sağlayarak küçük örnekler alın. Gen ekspresyonu ve metabolit analizleri daha büyük örnekler gerektirir. Bu örnekler, vida gevşetilip çıkış tüpünün metal ucu tutularak tüpün yavaşça aşağı indirilmesiyle hızlıca elde edilebilir.Büyük bir hacim alındığında, aynı dilüsyon oranını korumak için akış hızı düşürülmelidir. İlk olarak, özdeş dilüsyon oranlarına ve hacimlere sahip iki maya suşunun kararlı durum kültürlerini oluşturun. Daha sonraki akış sitometrisi analizi için kontrol olarak kullanılmak üzere her kaptan pasif olarak bir mililitre örnek alın. Hücreleri 6.000 RPM'de bir dakika boyunca santrifüjleyin, bir mililitre PBS içinde yeniden süspande edin ve tüpü dört derece Celsius'ta saklayın.Ardından, her seferinde tek bir kaptan gelen çıkış tüpünü bir otoklav dereceli silindirine yerleştirin. Çıkış tüpünü tutan vidayı gevşetin ve kemostatdan 150 milliliters hücre tahliye etmek için hafifçe aşağı doğru itin, ardından çıkış tüpünün metal ucunu orijinal konumuna geri getirin. İşlem tamamlandığında, bölgeyi sterilize ettikten sonra kemostat kabının üstündeki kap portunu açın.Açıklığa steril bir huni yerleştirin ve diğer kültürden 150 milliliters ekleyin. Ardından portu kapatın ve aynı işlemi ikinci kapla tekrarlayın. Her bir kap artık iki suşun 50 50 karışımını içermektedir; iki ila üç gün boyunca her iki ila altı saatte bir numuneler alınabilir.Numuneleri PBS içinde saklayın ve her bir numunedeki suş oranlarını akış sitometrisi kullanarak analiz edin. Bilinen bir genotipe sahip bir suş ile tanımlanmış bir besin kısıtlaması altında kararlı durum hemostat kültürü oluşturduktan sonra, gerektiğinde medya rezervuarını taze medya ile doldurarak, müdahale edilmemiş kültürü birkaç yüz nesil boyunca sürdürün. Her iki ila üç günde bir çıkış akımından pasif örnekleme yaparak adapte olan popülasyonun bir fosil kaydını tutun.Seçim işlemi tamamlandıktan sonra örneği %15 Gliserol içinde -80 °C'de saklayın, hücre örneğini katı agar plaklarına ekin. Hücreler koloni oluşturduğunda, kürdanlar kullanarak kolonilerden tarafsız bir örnek seçin ve klonları, 100 µL besiyeri içeren 96 kuyucuklu bir plakanın ayrı kuyucuklarına inoküle edin. Klon örneklere gece boyunca büyüme imkanı tanıyın.Ardından her kuyucuğa 100 µL %30 gliserol ekleyin ve genomik analizde kullanılana kadar -80 °C'de saklayın. Kemostatların temel bir avantajı, hücrelerin büyüme hızını kontrol edebilme yeteneğidir. Burada Y ekseninde gösterilen tomurcuklanan maya hücrelerinin yüzdesi, büyüme hızlarının iyi bir göstergesidir.Burada görüldüğü üzere, bu yüzde artışı, artan dilüsyon hızıyla neredeyse doğrusal bir şekilde gerçekleşmektedir. Daha yüksek dilüsyon hızları, daha hızlı büyüme hızlarıyla sonuçlanır; bu durum, burada UTR 2 mRNA bolluğundaki artışla temsil edilen, gen ekspresyonunda sistematik artışlara yol açabilir.Bununla birlikte, ASM örneğinde olduğu gibi, büyüme hızının artmasıyla birlikte gen ekspresyonunda sistematik azalmalar da meydana gelebilir. Farklı genotiplerin göreceli uygunluğu, floresan işaretli hücreler kullanılarak hemostatlarda rekabet deneyleri gerçekleştirilerek ve akış sitometrisi analizi ile belirlenebilir; burada gösterilen, bir mutantın floresan işaretli bir yabanı tip suşa karşı rekabet ettirildiği temsili bir sonuçtur. Bu örnekte, mutant suş nesil başına %40 büyüme hızı avantajına sahiptir.Tüm genom dizileme analizi, kemostatlarda uzun süreli seçimin ardından fitness'ı artmış hücrelerdeki edinilmiş mutasyonların belirlenmesi için kullanılabilir. Örneğin, azot kısıtlı koşullarda gerçekleştirilen bağımsız adaptif evrim deneylerinin analizi, genel amino asit permeazını kodlayan gap1 lokusunda farklı kopya sayısı varyant alellerini tanımlamıştır. Bu prosedürün ardından, hücre büyümesinin sistem düzeyindeki regülasyonu ve adaptif evrimle ilgili benzer soruları yanıtlamak için kütle spektrometrisi, akış sitometrisi ve yeni nesil dizileme gibi diğer yöntemler kullanılabilir.Bu tekniğin geliştirilmesi, mikrobiyolojiden hücre biyolojisine kadar birçok alandaki araştırmacıların, hücre fizyolojisinin ve moleküler süreçlerin hücre büyüme hızındaki varyasyonlardan nasıl etkilendiğini incelemelerinin önünü açmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, kemostat kültürlerinin nasıl kurulacağı ve sürdürüleceği ile farklı uygulamalar için gereken örnekleme yöntemleri hakkında iyi bir fikre sahip olmanız gerekir.

the-use-of-chemostats-in-microbial-systems-biology

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Biz geliştirdi ve düşük maliyet için hazır parçalardan inşa minyatür chemostats küçük bir yer kaplayan dizi doğrulanmış. Fizyolojik ve deneysel evrim sonuçları büyük hacimli chemostats benzerdi. Ministat dizi geleneksel kemostat deneyler, fonksiyonel genomik ve kimyasal tarama uygulamaları için, kompakt, ucuz ve erişilebilir bir platform sağlar.

Multiplexed kemostat Diziler Tasarımı ve Kullanımı

İlaç konsantrasyonunu dinamik olarak ayarlayarak antibiyotik ilaç direncinin karakterizasyonunu sağlayan düşük maliyetli, yapılandırılabilir bir morbidostat tarif ediyoruz. Cihaz, çoğullanmış bir mikroakışkan platform ile entegre edilebilir. Yaklaşım, laboratuvar antibiyotik ilaç direnci çalışmaları için ölçeklendirilebilir.

Tasarım ve Düşük Maliyetli kullanımı, Otomatik Morbidostat Bakterilerin Adaptif Evolution için antibiyotik ilaç Seçimi Altında

Burada, biz kemostat kültür kullanarak koşullar altında mikroorganizmaların adaptif laboratuvar evrimini elde etmek için bir protokol mevcut. Ayrıca, gelişmiş soyunun genomik analiz tartışılmıştır.

Bir Kemostat kullanarak Mikroorganizmaların Adaptif Laboratuvarı Evolution Prosedürü

Biz bir inverted mikroskop ile atık mikropların kültürler ve düzenli görüntü hücrelere aydınlatmak için Optogenetic sistemleri ile kullanım için sürekli bir kültür cihazı tasarlanmıştır. aydınlatma dinamik tepkiler birkaç gün içinde ölçülebilir, böylece kültür, örnekleme, görüntüleme ve görüntü analizi tam otomatik vardır.

Mikrobiyal optogenetic Uygulamaları Tasarım ve Otomatik Aydınlatıcı, kültürleme ve Örnekleme Sistemi Uygulaması

Burada, sıvı kromatografisi ve kütle spektrometresi ile, Staphylococcus aureus ve bunların daha sonraki analiz metabolitlerin ekstraksiyonu için bir protokol açıklar.

metabolit analizi için bir Tandem Sıvı Kromatografi-Kütle Spektrometresi tabanlı yaklaşım<em&gt; Stafilokok aureus</em

Detaylı bir protokol 48 paralel hücre kültürlerinde bir microbioreactor sisteminde çeşitli koşullar altında eşzamanlı işlem için sunulmaktadır. Hücre kültür süreci, hasat ve sonraki antikor titresi analiz anlatılmıştır.

Yüksek üretilen iş kullanımı otomatik Microbioreactor sistemi modeli Igg1 CHO hücrelerdeki imalatı için

EVOLVER çerçevesi yüksek çözünürlüklü ve deneysel parametreler üzerinde dinamik kontrol ile yüksek verimlilik sürekli mikrobiyal kültür sağlar. Bu protokol, kullanıcıların birçok bireysel kültürde otomatik kontrolü programlama, ölçme, toplama ve deneysel verilerle gerçek zamanlı etkileşime girme konusunda rehberlik ederek karmaşık bir fitness deneyi yapmak için sistemin nasıl uygulanacağını gösterir.

EVOLVER kullanarak otomatik, yüksek verimlilik, sürekli hücre büyüme denemeleri tasarlama

Mikroakışkan ve miliakışkan kurulumlar içinde fotolik tarafından dinamik kimyasal manzara üretimi için bir protokol sunulmaktadır. Bu metodoloji, hem tek hücre hem de popülasyon düzeyinde, hareketli davranış, besin alımı veya mikroorganizmaların kimyasallarına adaptasyon dahil olmak üzere çeşitli biyolojik süreçleri incelemek için uygundur.

Mikrobiyal Davranışı İncelemek Için Kontrollü, Dinamik Kimyasal Manzaralar Üretmek

Burada sunulan bir in situ kemotaksis test için protokol, çevrede doğrudan mikrobiyal davranış çalışmaları sağlayan yeni geliştirilen mikroakışkan bir cihaz.

Sucul Ekosistemlerde Mikrobiyal Davranışı İncelemek Için Situ Chemotaxis Tsay'da

Mikrobiyal metabolizmanın optogenetik kontrolü, fermantasyon süreçleri üzerinde esnek dinamik kontrol sağlar. Buradaki protokol, farklı hacimsel ölçeklerde kimyasal ve protein üretimi için mavi ışık ayarlı fermantasyonların nasıl kurulacağını göstermektedir.

Mikrobiyal Kimyasal ve Protein Üretimi için Işık Kontrollü Fermantasyonlar

Bakteri popülasyonlarının sürekli düşük besinli koşullarda (yüzlerce nanomolar konsantrasyona kadar) veya geçici besin dalgalanmaları altında küçük bir zaman ölçeğinde yetiştirilmesini sağlayan milifluidik sürekli kültür cihazı (MCCD) için bir protokol sunuyoruz.

Düşük ve Dalgalanan Besin Koşullarında Escherichia coli'nin Incelenmesi için Sürekli Kültür Milifluidik Cihaz

Keşfedin chemostat kullanımı ile mikrobiyal sistemler biyolojisinde sürekli hücre kültürü ve büyüme hızı kontrolü. Bu yöntem, hücre fizyolojisi ve adaptif evrim araştırmaları için kararlı deney koşulları sağlar.

Mikrobiyal Systems Biyoloji Chemostats Kullanımı

Daha fazla video keşfet