Name: Plazma Retinol Bağlayıcı Protein Membran Reseptör tarafından Retinol Ulaştırma Gerçek zamanlı Analizleri (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 32 s
Description: Öğrenin, bakterilerde ifade edilen ve HPLC ile saflaştırılan plazma retinol bağlayıcı proteinin gerçek zamanlı analizler için nasıl üretildiğini. Bu yöntem, STRA6 reseptör aktivitelerini incelemek için yüksek kaliteli RBP elde edilmesini sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Sağlık hibe R01EY018144 Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenir.

1. Holo-RBP üretimi, refolding ve HPLC Arıtma <ol><li> PET3a vektör N-ucu üzerinde 6x His etiketi olan insan RBP için cDNA barındıran BL-21cells dönüştürülmesi. 600 nm&#39;de OD kadar karbenisilin ile 40 mL LB ortamı içinde 37 ° C sıcaklıkta bir çalkalayıcı içinde transforme BL-21 hücrelerinin büyümesini 0,5 ulaşır. 1mM için IPTG ekleyerek RBP protein ekspresyonu øndükle. 37 bakteri büyümek ° C başka bir 5 saat. </li><li> E.coli &#39;de üretilen RBP çözünmeyen inklüzyon cisimcikleri çoğunlukla mevcuttur. 20 dakika boyunca 10.000 xg&#39;de inklüzyon cisimcikleri, pelet hücreleri zenginleştirmek. Sonra, dondurma ve buz çözme 2 döngüsü uygulayarak proteaz inhibitörleri ile birlikte 5 ml PBS içinde buz üzerinde hücreler sonikasyon. Pelet aşağı 4 az 30 dakika süreyle 20,000 x g inklüzyon gövdelerinin ° C. Süpernatantı ve buz üzerinde pelet tutun. </li><li> 10 ml 7.5 M guanidin hidroklorür sonication tarafından inklüzyon cisimciği pelet çözünür. Bir nihai C ile 25 mM Tris tamponu, pH 9.0 ve DTT bir yarım hacim (5 ml) ekleyin10 mM oncentration. Kuvvetlice tam olarak azaltmak ve proteinleri denatüre etmek için oda sıcaklığında gece boyunca bir vorteks mikseri üzerinde çözelti ilave edilir. </li><li> 4 ° C&#39;de 20 dakika süre ile 18,000 x g çözünmeyen malzemelerin ayrılması için protein çözeltisi santrifüje Sıkma sonra, yeni bir tüp için supernatant aktarmak ve buz üzerine yerleştirilir. </li><li> Refolding tamponu dört hacim (60 mi) (25 mM Tris, pH 9.0, 0.3 mM sistin, 3.0 mM sistein, 1 mM EDTA) içinde hazırlayın. Degas refolding tampon. Ayrıca loş kırmızı ışık altında etanol 600 ul 10 mM retinol hazırlamak. Buz üzerinde karanlıkta saklayın. Refolding tampon ve retinol çözüm Hem taze hazırlanmış olması gerekir. </li><li> Protein çözeltisi ve en az 30 dakika boyunca buz üzerinde refolding tampon her ikisi de soğutulur. Yüksek sıcaklık olasılıkla RBP refolded kalitesini azaltır. 1 ml refolding tampon damlalar halinde ve sırayla 10 ul retinol çözelti protein çözeltisi şiddetle buz üzerinde bir behere karıştırılır iken ekleyin. Tüm refolding tampon ve retinol kadar bu adımı yineleyinilave edilir. 5 saat için karanlıkta buz üzerinde reaksiyon karıştırmaya devam edin. </li><li> 4 ° C&#39;de 30 dakika süreyle 24,000 x g refolding reaksiyon aşağı Spin Bu doğru refolding reaksiyondan sonra toplamları kaldırmak için esastır. </li><li> Yaklaşık 10 ml Amicon Ultra 15 konsantratör (MWCO 10 K) kullanarak süpernatant çözümü Konsantre. Bu seviyede daha refolded çözüm konsantre olmayın. Çok konsantre protein agregasyonunu yol ve doğru katlanmış RBP nihai verim ve kalitesini düşürür olacaktır. Soğuk PBS ile 100 mL&#39;ye konsantre örnek seyreltilir. Bu adımın amacı, nikel saflaştırma ile müdahale refolding reaksiyon bileşenleri ortadan kaldırmaktır. </li><li> 4 ° C&#39;de 20 dakika süre ile 24,000 x g çözelti bir kez daha Spin Bu, herhangi bir çökelti kaldırmak için önemlidir. Iki adet 50 ml&#39;lik tüp, PBS ile yıkandı her içeren 1 ml Ni-NTA bulamaç fazı aktarın. Bir saat boyunca 4 ° C&#39;de tüp döndürün. Seyreltilmiş çözelti f kuluçkayaya da 1 saat kaldırılması gerekir katlanan proteinleri çökelmesini neden olabilir. </li><li> 3 dakika boyunca 500 xg&#39;de tüpler aşağı spin. Dikkatli Süpernatantı. Her şey yüzer kaldırılması gerekir. Her bir tüp için 30 ml soğuk PBS ekleyin. Yeniden Spin ve süpernatant kaldırmak. Eğer tüp ama boncuk şey görene kadar bu işlemi tekrarlayın. </li><li> Boş bir sütun Ni-NTA reçine aktarın. 10 mM imidazol, PBS içinde 500 mM NaCl 20 kolon hacmi ile reçine yıkanır. PBS içinde 100 mM imidazol 5 kolon hacmi içinde His-RBP Zehir. Uzun bir süre için bu çözüm depolamak ve donma son verim ve kalitesini azaltır etmeyin. En iyi sonuç için, hemen HPLC ile RBP arındırmak. </li><li> 25 mM Tris, pH 8.4, ve 120 mM NaCl karşı Ni-NTA reçinesi saflaştırıldı His-RBP Dialyze. Bir yoğunlaştırıcı, aynı zamanda tampon değişimi için de kullanılabilir. ° C sağ Her koşudan önce 4 az 10 dakika süreyle 16,000 x g&#39;de santrifüj ile HPLC için Clear örnekleri. </li><li> Bir iyon kullanarak HPLC üzerinde sanal-RBP Purifydeğiş tokuş 1 ml / dakika hızında mobil faz olarak 25 mM Tris, pH 8.4 NaCl kullanarak bir adım gradyanı (12 dakika 220 mM, 360 mM, 15 dakika, ve 15 dakika 1,000 mM) ile sütun AX-300. NaCl konsantrasyonu arttıkça, holo-His-RBP apo-RBP ederken yayımlanan ve RBP sütun (Şekil 1) bağlı kalmak katlanan edilir. RBP refolding en iyi şekilde yapılmadığı takdirde, RBP (örneğin, Şekil 1 &#39;de RBP-I katlanan) tüm hazırlık ağırlıkta olabilir katlanan. </li><li> 360 mM NaCl doruk fraksiyonları doğru katlanmış holo-RBP kurtarın. Dikkatle doğru katlanmış ve His-RBP katlanan ve elüsyon profili izlemek. 1.000 mM NaCl anda, çoğu His-RBP serbest bırakılmalıdır katlanan. </li><li> Sanal-RBP ihtiva eden fraksiyonlar, toplanmış konsantre edildi ve 4 ° C de bir gece PBS&#39;ye karşı diyaliz edilmiştir Spektrofotometre ile son verim ve kalite (330 nm/280 nm) kontrol edin. Doğru katlanmış ürün 1 (Şekil 1) biraz daha yüksek bir 330 nm nm/280 oranında olmalıdır. </li><li> Üretimi içinE apo-RBP, saflaştırılmış holo-RBP için heptan eşit hacimde ekleyin ve 4 ° C gecede çevirerek hafifçe karıştırın 4 ° C&#39;de 10 dakika süreyle 16,000 g de santrifüjlenir ve dikkatlice bir yeni tüpü (ara yüzeyde çökelti kaçınarak) ile alt sulu faz transfer edin. Her biri için 3 saat inkübasyon işlemi üç kez tekrarlayın. 330 nm tepe plan düzeyine inmiştir emin olmak için bir Nanodrop spektrofotometre üzerinde emilimini kontrol edin. </li></ol> 2. STRA6-katalizli Retinol Yayın ve Retinol Yükleniyor Gerçek zamanlı izleme <ol><li> 4 gecede Engelleyici Kazein (Pierce) 200 ul bir siyah 96-Microfluor-2 plaka (Thermo Scientific) Blok ° plastik holo-RBP nonspesifik yapışmasını önlemek için C. Engelleyici Kazein Denediğimiz tüm engelleme çözümlerinin iyi bloke edici etkisi verir. </li><li> Taze STRA6 ya da kontrol hücreleri ifade eden hücrelerden hazırlanan Zarlar bir Hamilton şırıngası (Gasti ile PBS ile yıkanmış ve geçirilirPBS içinde üniform bir süspansiyonu elde etmek için) 6 kere # 1710 GHT. Bu reaksiyon tipik olarak her bir 100 mm tabak üzerinde yetiştirilen hücreler 1/100 ile 1/20 &#39;dan türetilen membranlar kullanılır. </li><li> 200 ul PBS ile bir kez Microfluor-2 plaka kuyucuklar yıkayın. Membran süspansiyonu (kuyu başına 50 ul) ilave etmeden önce buz üzerinde plaka soğutulur. </li><li> Retinol floresans Gerçek zamanlı izleme eksitasyon filtresi 320ex ve emisyon filtresi 460-10 ile POLARstar Omega (BMG Labtech) floresans optikler kullanılarak ölçülür. Program Endpoint okuma moduna ayarlanır. Zaman aralıkları çeşitli takdirde Plaka Mod, aynı zamanda, bir zaman süreci ölçmek için kullanılabilir. Her bir zaman noktasında elde edilen sinyali 10 ölçüm (2 mm arasında bir çapa sahip orbital ortalama) ve ortalama ve kazanç 1.800 ayarlanır. Plakası her ölçümden önce çift yörüngesel titreme kullanarak 500 rpm&#39;de 10 saniye çalkalanır. </li><li> Retinol salınım testi başlatmak için, kuyular m okuma Endpoint kullanarak bir kez okunursanal-RBP önce gazel (tipik olarak 1 uM nihai konsantrasyon) 0 dak ilave edilir. En kısa sanal-RBP eklendiğinde, reaksiyon 1-3 saat için sürekli olarak her 5-10 dakikada izlenir. Retinol yükleme tahlil, all-trans retinol (tipik olarak 1 uM nihai konsantrasyon) başlatmak için soluk kırmızı ışık altında oyuklara ilave edilir. Apo-RBP 0 dakika önce ilave edilir plaka bir kez okunur. En kısa apo-RBP eklendiğinde, reaksiyon 1-3 saat için sürekli olarak her 5-10 dakikada izlenir. </li><li> Tüm ölçümler yapıldıktan sonra, veri analizi için Microsoft Excel Omega Veri Analizi yazılımı (BMG Labtech) ham verileri (Şekil 2&#39;de gösterildiği örnek) indirebilirsiniz. Her zaman noktasında tüm deneysel koşullar okumaları içeren bir dosya oluşturur. 20 kez puan varsa Örneğin, veri analizi için bir Excel dosyası içine 20 dosyaları birleştirmek. </li><li> Veri analizi için, 0 dak retinol veya sanal-RBP ilave edilmeden önce flöresan sinyalleri, bir arka plan sinyali olarak kabul edilird tüm zaman noktalarında nihai flöresan sinyalleri çıkarılır. Arka sinyaller düşük çıkarılarak, holo-RBP retinol floresans kıyasla rağmen arka membranlar tarafından ışık saçılma nonspesifik etkisini ortadan kaldırır ve 0 dakika ilave holo-RBP veya retinol retinol floresans odaklanmak mümkün kılar. </li></ol> 3. CRBP-I Holo-RBP kaynaktan Retinol arasında STRA6-katalizli Ulaştırma Gerçek zamanlı izleme <ol><li> Retinol-EGFP son 41 kurulmuş yeni bir floresan rezonans transferi (FRET) çiftidir. Holo-RBP gelen EGFP-CRBP-I retinol EGFP ölçerek gerçek zamanlı olarak izlenir STRA6-katalizli retinol ulaşım FRET. 6XHis etiketi (EGFP-CRBP-I) ile EGFP-CRBP-I füzyon proteini, memeli hücrelerinde üretilir ve deneyden önce Ni-NTA reçinesi üzerinde saflaştırılır. EGFP-CRBP-I 4 ° C de kısa bir süre için, proteaz inhibitörleri ile PBS içinde saklanabilir Alternatif olarak, füzyon proteini is -80 ° C küçük alikotları donduruldu. </li><li> Reaksiyon başlamadan önce, bir bloke edilmiş Microfluor-2 plaka ve yukarıda tarif edildiği gibi membranlar hazırlanır. Membran süspansiyonu (kuyu başına 50 ul) ilave etmeden önce 200 ul PBS ile bir kere Microfluor-2 plaka kuyucuklar yıkayın. </li><li> Gerçek-zamanlı retinol-EGFP FRET simültane emisyon düello floresan optik kullanılarak uyarma filtre 320ex ve emisyon filtre 460-10 ve 510-10 ile POLARstar Omega kullanılarak ölçülür. Program Endpoint okuma moduna ayarlanır. Zaman aralıkları çeşitli takdirde Plaka Mod, aynı zamanda, bir zaman süreci ölçmek için kullanılabilir. Her bir zaman noktasında elde edilen sinyali 10 ölçüm (2 mm arasında bir çapa sahip orbital ortalama) ve ortalama ve kazanç kanal başına 1.800 ayarlanır. Plakası her ölçümden önce çift yörüngesel titreme kullanarak 500 rpm&#39;de 10 saniye çalkalanır. </li><li> Reaksiyonları, EGFP-CRBP-I (tipik olarak 1 uM nihai konsantrasyon) başlamak için kuyu ilave edilir. Plaka okunurHolo-RBP önce Endpoint okuma modunu kullanarak ce 0 dakika eklenir. En kısa sanal-RBP eklendiğinde, reaksiyon ölçüm tarafından sürekli olarak 1-2 saat için her 5-10 dakikada izlenir. </li><li> Tüm ölçümler yapılır sonra, yukarıda tarif edildiği gibi veri analizi için, Microsoft Excel ile Omega veri analiz yazılımı gelen ham verileri (Şekil 3&#39;te gösterildiği gibi örneğin) yükleyin. </li><li> Retinol-EGFP alıcı / verici emisyon zirveleri 47 oranında dinamik değişimi ile tespit edilir FRET. Bu oranı hesaplamak için denklem 41&#39;dir [(510 t -510 b) / (460 t -460 b)], burada 510 t, 510 b, 460 t ve 460 b reaksiyon başladıktan sonra 510 nm&#39;de emisyon temsil ( t = zaman noktası), retinol veya sanal-RBP önce 510 nm &#39;de tepkime (t = zaman noktası) başlandıktan sonra 460 nm&#39; de, (b = arka plan) ilave edilir ve retinol veya sanal-RBP önce 460 nm &#39;de ilave edilir (b = arka plan), sırasıyla. </li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

RBP Üretim ve saflaştırma prosedürleri doğru katlanmış RBP üretme açısından kritik önem taşımaktadır çünkü biz burada bir optimize RBP üretim protokolü paylaşabilirsiniz. Katlanan RBP tür olasılığı ve RBP bakteri üretimi dahi HPLC saflaştırılmış içinde bakteriyel proteinler, eser miktarda varlığı göz önüne alındığında, RBP ile ilgili bir sonuç teyit etmek için serum dan doğal RBP kullanmak yararlıdır. Piyasada mevcut İdrar RBP, apo-RBP ve sanal-RBP 48,49 dahil RBP birçok türün kompleks bir karışımıdır. <p...

A vitamini, insan yaşam ve hemen hemen tüm insan organlarının düzgün işleyişi için gerekli olan organik bir moleküldür. A vitamini türevleri (retinoidler) vizyon 1,2 ve embriyonik gelişim sırasında ve yetişkin dokularda 3-6 gen ekspresyonu ve protein çeviri düzenleme için ışık algılama dahil çeşitli biyokimyasal ve hücresel etkinliklere katılır. Retinol sistemik diffüz yeteneğine sahip olsa da, evrim plazma retinol bağlayıcı protein, vitamin yüksek verim ve spesifite elde etmek ve 7-10 rastgele difüzyon ile ilişkili toksisite önlemek için kan bir ulaşım için belirli bir taşıyıcı protein ile geldi. RBP bağlanır ve vitamin alır yüksek afiniteli reseptör A 1970&#39;lerde 11-13 varsayılmıştır. RBP reseptör 14-31 varlığını üç yıl içinde biriken kanıtlara rağmen, reseptör hipotezine nedeniyle existenc yıllarca tartışıldıHolo-RBP yanlış bir tanım e. Sanal-RBP arasında doğru bir tanımı da retinol ve RBP arasında yüksek afinite 01:01 karmaşık olmasıdır. Organik çözücü tarafından sanal-RBP Mükerrer ekstraksiyon apo-RBP üretmek için gereklidir. Bu tanım, RBP 7,9,32-35 veya RBP reseptör 14-31,36-42 okuyan hemen hemen tüm laboratuarlar tarafından kullanılır. RBP reseptörünün varlığı çürütmek için kullanılan sanal-RBP arasında yanlış tanım apo-RBP ile serbest retinol akut karışımıdır. Vitamin RBP reseptör fonksiyonu yana holo-RBP A alımını holo-RBP gelen retinol yayınlayacak retinol (as holo ve yanlış tanımı tarafından önerilen ile başlayan ücretsiz ise, RBP reseptör retinol alımını hiçbir rol oynayacak -RBP). Bir multitransmembrane etki protein olarak RBP reseptör son tanımlama STRA636 denilen ve vitamin işlevi holo-RBP 36-43 A alımını kuvvetle RBP değil hipotezi karşı savunuyorSTRA6 hücre içinde 40 bulunan bir transmembran 9 ekstraselüler yer alan N-terminus ile etki ve C-terminali sahip olduğunu ortaya çıkarmıştır A vitamini detaylı analizler de teslim etmek için bir alıcı gereklidir. Transmembran 6 ve 7 arasında yer alan önemli bir RBP bağlayıcı alanı 39 olduğunu. STRA6 LRAT ve vitamin sanal-RBP A uptake CRBP-I hem de birleştirilmiştir, ancak LRAT, ne de CRBP-I tamamen gelişmiş bir etkinlik STRA6 41 için gereklidir. Olduğu Holo-RBP gelen retinol serbest katalize STRA6 yeteneği, onun A vitamini alımı etkinliği 41 için anahtardır. Onun retinol serbest STRA6 güvenerek, vitamin RBP A teslimat A vitamini yüksek özgüllük ve verimlilik ile periferik dokularda hücrelerin hedef taşıyabilir. Holo-RBP tanımı ve hazırlanması büyük önem holo-RBP tanımları dif esas ilgili üç yeni makale ile de RBP reseptörünün varlığı tarihsel tartışmayı tarafından sadece gösterildiği, ancaközgün ve doğru tanımını 44-46 den ferent. İlk kağıt RBP reseptörü 44 okumak için RBP reseptörünün varlığı reddetmek için kullanılan sanal-RBP tanım kullanılır. İkinci ve üçüncü kağıtlar bile daha az retinol için çalışılması gereken RBP 45,46 ile uygun bir kompleks oluşturur yapılan sanal-RBP üçüncü bir tanımı ile geldi. Bu çalışmalar 3 H-retinol ile sanal-RBP (bile apo-RBP) karıştırılarak 3 H-retinol/RBP hazırlanmıştır. Bu testte 3 H-retinol/RBP oluşmuş ve aşırı ücretsiz 3 H-retinol 45,46 çıkarmadılar yoktu bu yana, 3 H-retinol/RBP 3 H-retinol alımı için bir test değil, ama ücretsiz bir 3 H-retinol difüzyon testi. Bu STRA6 LRAT 38 ya da CRBP-I 41 oranında serbest retinol hücre alımını artırmak olmadığı önceden gösterilmiştir. Hemen hemen tüm retinol kan içinde RBP bağlı olduğu ve hiçbir saptanabilir fre yokture retinol. RBP reseptör A ana işlevi holo-RBP 41&#39;den retinol alımı sırasında holo-RBP gelen retinol serbest katalize etmektir. Retinol yapay olarak serbest ya da 45,46 ile başlamak için, serbest formdaki olduğu takdirde, RBP reseptör gerekli değildir. Doğru sanal-RBP RBP bu doğru hazırlanmasını göstermektedir hazırlanan esas testleri ile karşılaştırıldığında serbest retinol difüzyon testi elde ölçüde farklı sonuçlar fonksiyonel testler için çok önemlidir. RBP insan serum den 41 arıtılmış, fakat bu işlem oldukça karmaşıktır ve düşük verim edilebilir. Alternatif bir yaklaşım, E. RBP üretmek için coli. Çünkü E. coli düzgün RBP gibi disülfid bağlarının birden fazla çift memeli salgılanan proteinler pas yeteneğine sahip değildir, katlanamayan RBP ve doğru katlanmış proteini saflaştırmak için gereklidir. Katlanan proteinleri sadece, farklı çeşitli testler giderilmiştir katlanmış RBP gelen davranmazfakat aynı zamanda saklama esnasında protein agregasyonu neden olur. Aynı nedenle, apo-RBP sadece yüksek kaliteli sanal-RBP üretilir. Biz kaliteli RBP bakteriyel ifade refolding ve HPLC arıtma yoluyla retinol ile yüklenen% 100 üretmek için burayı optimize edilmiş protokol açıklar. HPLC saflaştırma yanlış katlanmış RBP değil, aynı zamanda RBP sinyal transdüksiyon testlerin kullanılması durumunda ciddi eşya neden olabilir önemli bakteriyel kontaminasyon kaldırır sadece. Biz de STRA6 tarafından retinol ulaşım incelemek için iki hassas gerçek zamanlı izleme teknikleri anlatıyoruz. Her iki teknikler kaliteli RBP bağlıdır. Alanı sınırlamaları nedeniyle, radyoaktif retinoid tabanlı ve HPLC bazlı vitamin klasik teknikler alımını deneyleri burada yer verilmemiştir.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif / Malzeme Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog Numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> guanidin hidroklorür </td><td> EMD </td><td> 5010 </td><td></td></tr><tr><td> sistin </td><td> Sigma </td><td> C8755 </td><td></td></tr><tr><td> sistein </td><td> Sigma </td><td> C7352 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Balıkçı </td><td> BP118-500 </td><td></td></tr><tr><td> Tris </td><td> Balıkçı </td><td> 7786-1 </td><td></td></tr><tr><td> DTT </td><td> EMD </td><td> 3860 </td><td></td></tr><tr><td> retinol </td><td> Sigma </td><td> R7632 </td><td></td></tr><tr><td> karbenisilin </td><td> Balıkçı </td><td> BP2648-5 </td><td></td></tr><tr><td> IPTG </td><td> EMD </td><td> 5810 </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> EMD </td><td> 6508 </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Balıkçı </td><td> BP358-10 </td><td></td></tr><tr><td> Ni-NTA </td><td> Qiagen </td><td> 1018244 </td><td></td></tr><tr><td> imidazol </td><td> EMD </td><td> 5720 </td><td></td></tr><tr><td> heptan </td><td> EMD </td><td> HX0295-1 </td><td></td></tr><tr><td> Engelleyici Kazein </td><td> Delmek </td><td> 37528 </td><td></td></tr><tr><td> Amicon Ultra 15 konsantratör (MWCO10 K) </td><td> Millipore </td><td> UFC901024 </td><td></td></tr><tr><td> Microfluor-2 plaka </td><td> Balıkçı </td><td> 14-245-177 </td><td></td></tr><tr><td> Hamilton şırınga Gaz Geçirmez # 1710 </td><td> Balıkçı </td><td> 14-824-655 </td><td></td></tr></tbody></table>

plazma retinol bağlayıcı protein membran reseptör tarafından retinol ulaştırma gerçek zamanlı analizleri

Real-time Analyses of Retinol Transport by the Membrane Receptor of Plasma Retinol Binding Protein

A vitamini görme için gerekli olan ve büyüme / neredeyse bütün insan organlarının farklılaşması. Plazma retinol bağlayıcı protein (RBP) A kan ilke ve vitamin belirli taşıyıcısıdır. İşte biz üretmek ve yüksek afinite RBP reseptör STRA6 tarafından A vitamini ulaşım incelemek için holo-RBP ve iki gerçek zamanlı izleme teknikleri arındırmak için optimize edilmiş bir tekniği tanımlar. İlk teknik mümkün yüksek kaliteli vitamini için holo-RBP (100 retinol ile% yüklenmiştir) A ulaşım testlerinin büyük miktarda üretmek için yapar. RBP bültenleri vitamini RBP hazırlanmasında bir kolaylıkla ve bakteriyel kontaminasyon eserler neden olabilir katlanan çünkü Yüksek kalite RBP fonksiyonel testleri için gereklidir. Elektrofizyoloji gibi Gerçek zamanlı izleme teknikleri membran taşıma çalışmaları için kritik katkılarda bulunmuşlardır. RBP reseptör-aracılı retinol taşıma gerçek zamanlı olarak yakın zamana kadar analiz edilmemiştir. Burada anlatılan ikinci teknik rea olduğunuSTRA6-katalizli retinol serbest veya yükleme l-zaman analizi. Üçüncü tekniği holo-RBP gelen hücresel retinol bağlayıcı protein I (CRBP-I) STRA6-katalizli retinol taşıma gerçek zamanlı analiz. Bu teknikler RBP reseptörün A vitamini alımı mekanizmayı açıklamada, yüksek hassasiyet ve çözünürlük sağlar.

Biz sanal-RBP ve retinol yükleme apo-RBP içine (Şekil 2) ve gerçek zamanlı analiz itibaren STRA6-katalizli retinol serbest HPLC ile sanal-RBP üretimi ve saflaştırılması (Şekil 1), gerçek zamanlı analiz için buraya temsilcisi sonuçları sunmak Holo-RBP gelen EGFP-CRBP-I STRA6-katalizli retinol taşımacılığı (Şekil 3). Hemen hemen tamamen yanlış bir çok disülfid bağların varlığı nedeniyle katlanan bir refolding olmadan, RBP bakteriler üretilir. ...

Burada yüksek kaliteli vitamin A / RBP karmaşık ve STRA6, RBP reseptör tarafından A vitamini ulaşım incelemek için iki gerçek zamanlı izleme teknikleri üretmek için optimize edilmiş bir tekniği tanımlar.

Plazma Retinol Bağlayıcı Protein Membran Reseptör tarafından Retinol Ulaştırma Gerçek zamanlı Analizleri

Vitamin A is essential for vision and the growth/differentiation of almost all human organs.  Plasma retinol binding protein (RBP) is the principle and ...

Bu protokol, retinol bağlayıcı protein reseptörünün aktivitelerini gerçek zamanlı olarak incelemek için kullanılan yüksek kaliteli plazma retinol bağlayıcı proteinin üretimini gösterir. Bu, önce bakterilerden büyük miktarda retinol bağlayıcı proteinin eksprese edilmesi ve saflaştırılmasıyla elde edilir. Saflaştırılmış retinol bağlayıcı protein tamamen denatüre edilir ve ligandı retinolünün varlığında yavaşça yeniden katlanır.Daha sonra, doğru şekilde yeniden katlanmış retinol bağlayıcı protein, yanlış katlanmış protein ve bakteriyel kirleticileri uzaklaştırmak için HPLC kullanılarak saflaştırılır. Yüksek kaliteli retinol bağlayıcı protein elde edildikten sonra, membran reseptörünün retinol salınımını, retinol yüklemesini veya retinolün hücresel retinol bağlayıcı protein birine taşınmasını katalize etmedeki aktivitelerini incelemek için kullanılabilir. Gerçek zamanlı olarak.Bugün, retina bağlayıcı protein üreten bakterileri yeniden biçimlendirmek ve saflaştırmak için geliştirilmiş protokolümüzü göstereceğim. Bu teknik, fonksiyonel tahliller için gerekli olan yüksek kaliteli retina bağlayıcı protein üretebilir. Retina bağlayıcı protein reseptörünü incelemek için yeni geliştirilen tek

real-time-analyses-retinol-transport-membrane-receptor-plasma-retinol

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu çalışmanın amacı, singeneik fare endotelial hücreler ve astrositlerin ortak-kültür içeren bir in vitro modelinin BBB tekrarlanabilirliğini doğrulamak için oldu. Endotel hücre tek yüksek Teer ve düşük LY geçirgenliği sundu. Belirli TJ proteinlerin ekspresyonu, enflamasyon ve taşıyıcı ve reseptörlerin işlevselliğine fonksiyonel tepkileri değerlendirildi.

Ayarlama-up bir<em&gt; In Vitro</emSıçan Kan-beyin bariyerinin&gt; Model (BBB): BBB geçirimsizliği ve Reseptör aracılı Ulaştırması Bir Odak

İnsan retinal pigment epitel hücrelerinin (H-RPE) metabolik durumu, sağlıklarını ve işlevlerini yansıtır. Burada, yüksek çözünürlüklü respirometri kullanarak H-RPE'nin gerçek zamanlı metabolik akısını incelemek için optimize edilmiş bir protokol sunulmaktadır.

Primer İnsan Retinal Pigment Epitel Hücrelerinde Yüksek Çözünürlüklü Respirometri Kullanılarak Biyoenerjetik Biyoenerjetik Analizinin Gerçek Zamanlı Analizi

Burada, temel ışığa duyarlı rodopsin kromoforu 11-cis-retinal'i oluşturmak için sistemik A vitamini kaynağı bağlamında, hem oküler hem de sistemik dokuda görme fonksiyonunun kolaylaştırılmasında rol oynayan kritik retinoidleri tespit etmek ve miktarını belirlemek için normal fazlı, yüksek performanslı bir sıvı kromatografisi yöntemi açıklanmaktadır.

Murin Oküler ve Non-Oküler Dokularda Diyetle Alınan Vitamin A Metabolitlerinin Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi Kullanılarak Kantitatif Analizi

Burada, A vitamini membran reseptörlerinin ve fotoreseptör opsin'in ilgili fizyolojik ligandları ile protein-ligand etkileşimlerini incelemek için iki kantitatif yöntem tanımlanmıştır.

Retinylidene Proteininin Üretilmesinde A Vitamini Membran Reseptörleri ve Opsin Proteininin Ligandları ile Etkileşimlerinin İncelenmesi için Metodoloji

Düzenlenmiş endositoz, hücre zarı proteinleri çoğunluğu yüzey ekspresyon düzeyleri yönetir. Burada, dopamin taşıyıcısı (DAT), polytopic membran proteini endositik hızını ölçmek için indirgenebilir, Membran geçirgenliği olmayan biyotinilasyon reaktifleri kullanmaktadır. Bu yöntem çoğu plazma membran proteinlerinin endositik oranını ölçmek için basit bir yaklaşımdır kolaylaştırır.

Tersinir biyotinilasyon Plazma Membran Protein endositik Oranları Ölçüm

Bu protokol, flow sitometri ile hücre plazma membranı, sitoplazma GLUT4 translokasyon ölçmek hızlı bir teknik anlatılmaktadır.

Akış Sitometri Plazma Membran GLUT4 Translokasyon Kantitatif Ölçüm

Steroid Reseptör Biyokimyasal Sulandırma Ligand • Protein Hsp90 Kompleksleri ve Yeniden bağlayıcı

Çoklu Hedef İzleme canlı hücrelerinin plazma membranı içinde ayrı ayrı işaretli moleküllerin izlenmesi için geliştirilen ev yapımı bir algoritma. Verimli, tespit nano ölçekli membran dinamiğini incelemek için kullanıcı dostu, kapsamlı bir araç sağlamak, yüksek yoğunluklu zaman içinde moleküller tahmin ve izleme.

Çoklu Hedef İzleme (MTT) tarafından Plazma Membran Moleküler Difüzyon Haritalama

Bu konjuge polimer polydiacetylene (PDA), florofor biyomoleküllerin algılama için PDA lipozomlar yüzeyine bağlı arasında FRET göstermektedir. PDA lipozomlar da problar olarak kullanılmak üzere biyomoleküllerin için, yüzeyleri üzerinde reseptör molekülleri içermektedir. Ligand-reseptör etkileşimlerinin algılama mekanizmasının temelidir florofor ve PDA arasında FRET verim değişikliklere yol açmaktadır.

Floresans Rezonans Enerji Transferi Ligand-reseptör etkileşimleri gerçek zamanlı izleme

Mikro Termoforosis (MST) yaygın olarak hücre lizatlarından hedef proteinin arıtılmadan bağlanma afinitesinin belirlenmesinde kullanılabilir. Protokol, GFP-kaynaşık proteini, denatüre edici olmayan koşullar hücre parçalama ve ligand arasında değişen konsantrasyonlarda varlığında MST sinyalinin tespiti arasında aşırı içerir.

Mikro Termoforosis tarafından Bağlama Affinity belirlenmesi Protein Saflaştırma-ücretsiz Yöntemi

Öğrenin, bakterilerde ifade edilen ve HPLC ile saflaştırılan plazma retinol bağlayıcı proteinin gerçek zamanlı analizler için nasıl üretildiğini. Bu yöntem, STRA6 reseptör aktivitelerini incelemek için yüksek kaliteli RBP elde edilmesini sağlar.

Plazma Retinol Bağlayıcı Protein Membran Reseptör tarafından Retinol Ulaştırma Gerçek zamanlı Analizleri

Daha fazla video keşfet