Name: Tetrasiklin-indüklenebilir (Tet-on) shRNA veya cDNA Expression Durağan İnsan Hücre Üretimi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: Öğrenin, insan hücre hatlarında tetrasklin-indüklenebilir shRNA veya cDNA ifadesiyle gen fonksiyonunu çalışmak için kararlı hücre hatları üretme yöntemini. Bu güvenilir sistem, zor transfekte edilen hücrelerde gen manipülasyonunu sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz yararlı tartışmalar için laboratuarımızda tüm üyelerine teşekkür ederim. Biz yazının eleştirel okuma Joanna Lisztwan ve Christina Gewinner ederim. Bu çalışma BBSRC hibe BB/I021248/1 tarafından desteklenen ve Wellcome Trust hibe 090090/Z/09/ZAH UCL Kanser Enstitüsü&#39;nde Wellcome Trust Araştırma Kariyer Geliştirme akademisyendir edildi.

1. PcDNA6_TetR_IRES_blast klonlanması <ol><li> Şekil 3 &#39;de gösterildiği üzere, kısıtlama enzimleri xba I ve NCO bir gen ve Tetr blasticidin direnci (BlastR) gen promoter çıkarmak için birlikte plazmid pcDNA6/TR (V1025-20, Invitrogen) kısmi bir özet gerçekleştirir. 4.6 kb vektör fragmanı ayırın. </li><li> Tetr geninden poliadenilasyon sekansı kaldırmak için, bir Xho I site hemen Tetr bir stop kodonu cDNA 5&#39;end de muhafaza xba I site süre sonra cDNA, PCR ile getirmektedir. PMigR1_TetR plazmid üretmek için kısıtlama enzimlerinin xba I ve Xho I ile pMigR1 17 içine sonuçtaki fragman Subclone. </li><li> TetR_IRES fragmanı serbest restriksiyon enzimleri xba I ve Astsubay ben pMigR1_TetR vektör sindirmek. 1.25 kb ekleme parçası ayırın. </li><li> 4.6 kb pcDNA6/TR ve 1.25 kb TetR_IRES parçaları Arter. TrYetkili E.coli içine ligasyon ürünü ansform ve standart moleküler biyoloji teknikleri kullanarak istenen pcDNA6_TetR_IRES_blast yapı tanımlar. </li></ol> 2. Hücre Hatları Nesil stabil Tetr ifade <ol><li> Günde 1, Tohum 1x10 Açık standart büyüme ortamı kullanılarak 10 cm doku kültürü plaka başına 6 hücre (örneğin DMEM% 10 FCS ile takviye). Tohum iki levha, pcDNA6_TetR_IRES_blast ile transfeksiyon için, diğeri ise blasticidin seçimi için bir negatif kontrol olarak, diğer. Mümkün olan en düşük geçiş ve tavsiye edilen büyüme ortamında kullanmak için emin olun. </li><li> Günde 2 üzerinde, transfekte üreticinin yönergelerini izleyerek Fugene 6 (E2691, Promega) kullanılarak pcDNA6_TetR_IRES_blast 2 mikrogram ile bir tabak. Ikinci plaka transfekte etmeyin. </li><li> 3. günde, iki tabak için 5 mg / ml blasticidin içeren standart büyüme ortamı ekleyin. Optimum seçimi konsantrasyonu belirli bir hücre hattı için farklı olabileceğini lütfen unutmayın olabilir nönceden belirlenecek eed. </li><li> 4. günde, 10 cm tabak ve 5 mg / ml blasticidin içeren standart büyüme ortamı kullanılarak 1/50 ve 1/100, 1/25, 1/5 de hücreleri bölme. Düzgün untransfected veya transfekte hücreler içeren plakalar etiketlemek için emin olun. Seyreltme adım başına iki tabak hazırlayın. </li><li> Untransfected plakalar üzerinde tüm hücreleri ilk hafta içinde öldüğü sağlanması, günlük hücreleri denetleyin. 2-3 günde bir seçim ortamı değiştirin. </li><li> 1-2 hafta sonra, blasticidin dayanıklı koloniler görünmeye başlaması gerekir. Tek koloniler toplandı olmasını sağlamak için 5-50 ihtiva eden koloniler plakalar seçin. </li><li> Koloniler yaklaşık olarak 5 mm (ya da daha büyük) bir çapa ulaştığı zaman, tek koloniler almak için klonlama silindir kullanılarak, en az 12 bağımsız klon izole eder. 24 iyi doku kültürü plaka ayrı bir kuyuya her klon aktarın. Ne zaman birleşmiş, iyi bir 6-doku kültür plakasının tek tek her bir kuyu gelen hücreleri ayrıldı. </li><li> Kültür cl DevamSeçimi medya olanları. 6-iyi doku kültürü plaka iki tek kuyulara her kuyudan zaman konfluent, split hücreler. </li><li> Her klon test edilmesi için immunblotting sonraki test için başka bir kuyuya confluent hücreleri ve hasat hücreleri de bir dondurma. </li><li> Batı fare monoklonal anti-TET02 antikor (Mobitec GmbH) kullanarak blotting ile Tetr algıla. Bir negatif kontrol olarak ebeveyn hücre hattının bir lizat dahil unutmayınız. </li><li> Yüksek Tetr ifade ile 3 klon seçin ve her klonal kültür genişletin. En kısa sürede, her umut verici klonu stokları dondurun. Son olarak, tetr-salgılayan klonlar ile karşılaştırarak ana hücre soyu ile, ilgilenilen ve moleküler biyolojik hücre parametreleri inceleyin. Ilgi moleküler ve hücre biyolojisi parametrelerinde herhangi bir değişiklik göstermez yüksek Tetr ifadesi ile &#39;en iyi&#39; klon seçin. </li></ol> 3. Pter ve pT-Rex DEST30 Vektörler Pilot Test ExpressSırasıyla ing shRNA veya cDNA, <ol><li> 12 açıklandığı gibi shRNA ekler ile plazmid pter oluşturun. Pt-Rex DEST30 vektör (12301-016, Invitrogen) ve ağ geçidi teknolojisi (Invitrogen) kullanılarak ilgi cDNA içeren Construct. CDNA ifade etmesi halinde, cDNA ile bir etiketin ilave daha sonra ifade edilmiş protein Eksojen olarak tespit kolaylaştıracaktır. </li><li> Geçici seçim transfeksiyon reaktif kullanılarak pter veya pT-Rex DEST30 plazmidler (shRNAs veya ilgi cDNAlarının da ifade) ile Ebeveyn hedef hücre hattı transfekte. ShRNA ifade plazmid test için, yüksek transfeksiyon verimlilik elde edilebilir sağlamak. </li><li> Hasat ilgi gen tükenmesi veya aşırı algılamak için bekliyor, uygun antikorlar kullanılarak immunoblotting için hücreleri ve süreç transfekte. </li></ol> 4. Tetrasiklin-indüklenebilir (Tet-on) pter veya pT-Rex DEST30 Vektörler kullanma shRNAs veya cDNAlann Expression Kararlı Hücre Hatları Üretimi </p&gt; <ol><li> Günde 1, sertifikalı Tetrasiklin serbest serum (; 16000-014 Invitrogen örneğin FBS için) ile desteklenmiş standart büyüme besiyeri kullanılarak 10 cm plaka başına &#39;en iyi&#39; Tetr-ifade klonu tohum 1x10 6 hücre üzerinde. Pter (veya pT-Rex DEST30), ve çift seçimi için negatif kontrol olarak bir plaka ile transfeksiyon için Tohum bir tabak. Mümkün olan en düşük geçiş kullandığınızdan emin olun. </li><li> Günde 2 üzerinde, transfekte Fugene 6 kullanarak pter 2 mikrogram (veya pT-Rex DEST30) ile bir tabak. Ikinci plaka transfekte etmeyin. </li><li> 3. günde, 5 ug / ml blasticidin ve 500 ug / ml zeocin (ya da 1 mg / ml G418) ihtiva eden standart büyüme ortamı ilave edin. </li><li> 4. günde, 5 mg / ml blasticidin ve 500 mg / ml zeocin (veya 1 mg / ml içeren 10 cm tabak ve standart büyüme ortamı kullanılarak 1/50 ve 1/100, 1/25, 1/5 de hücreleri bölme G418). Seyreltme adım başına iki tabak hazırlayın. </li><li> Ilk hafta içinde untransfected tabaklar üzerindeki ölenlerin emin, günlük hücreleri denetleyin.Blasticidin ve zeocin (veya G418) her 3-4 günde içeren standart büyüme ortamı değiştirin. </li><li> 2-3 hafta sonra, blasticidin / zeocin (veya blasticidin/G418) çift dayanıklı koloniler görünmeye başlaması gerekir. Tek koloniler almak için 5 ila 50 koloni içeren plakalarda seçin. </li><li> Koloniler yaklaşık 5 mm (veya daha büyük) bir çapa ulaştığında, tek koloniler almak için klonlama silindir kullanın. En az 24 ayrı klonlar ayırın. 24 iyi doku kültürü plaka ayrı bir kuyuya her klon aktarın. </li><li> Blasticidin (5 ug / ml) ve zeocin (250 ug / ml) ihtiva eden bakım ortamı konsantrasyonları kültür klonlar [G418 ya da (0.5 mg / ml)]. Ne zaman birleşmiş, iyi bir 6-doku kültür plakasının tek tek her bir kuyu gelen hücreleri ayrıldı. </li><li> Her bir klon test edilmesi için, iyi bir 6-kuyulu plakanın kuyularına üç tek bir 6-kuyulu plakanın bir konfluent ayrıldı. Zaman konfluent, iyi biri hücreleri dondurmak. Tetrasiklin test için kalan iki kuyu kullanınE-indüklenebilir ifade. Ikinci da tetrasiklin serbest bırakırken, iyi bir ila 1 ug / ml &#39;lik bir konsantrasyonda tetrasiklin ekleyin. </li><li> Uygun antikorlar kullanılarak immunoblotting için Tetrasiklin, hasat hücreleri ve süreç ile inkübasyondan 24 ila 96 saat sonra. CDNA ifadesinin indüksiyonu için tarama yaparken uzun tetrasiklin tedavisi endojen proteinlerin shRNA aracılı tükenmesi belirlemek için gerekli olacak ise kısa tetrasiklin inkübasyon sürelerinde, tavsiye edilir. </li><li> İstenen tükenmesi / aşırı ekspresyonu ile en az iki klon seçim ve her bir kültür genişletmek. En kısa sürede, her umut verici klonu stokları dondurun. Deneyler için klonlar Tet-büyüyen daima Tetrasiklin serbest serum ve bakım konsantrasyonlarda ilgili seçim antibiyotik ile desteklenmiş ortam kullandığınızdan emin olun. </li></ol>

<ol><li>Postle, K., Nguyen, T. T., Bertrand, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleotide+sequence+of+the+repressor+gene+of+the+TN10+tetracycline+resistance+determinant%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Nucleotide sequence of the repressor gene of the TN10 tetracycline resistance determinant.</a> Nucleic Acids Res. 12, 4849-4863 (1984).</li>
<li>Gossen, M., Bujard, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tight+control+of+gene+expression+in+mammalian+cells+by+tetracycline-responsive+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 5547-5551 (1992).</li>
<li>Gossen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+activation+by+tetracyclines+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Transcriptional activation by tetracyclines in mammalian cells.</a> Science. 268, 1766-1769 (1995).</li>
<li>Elbashir, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Duplexes+of+21-nucleotide+RNAs+mediate+RNA+interference+in+cultured+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells.</a> Nature. 411, 494-498 (2001).</li>
<li>Brummelkamp, T. R., Bernards, R., Agami, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+system+for+stable+expression+of+short+interfering+RNAs+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells.</a> Science. 296, 550-553 (2002).</li>
<li>McManus, M. T., Petersen, C. P., Haines, B. B., Chen, J., Sharp, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+silencing+using+micro-RNA+designed+hairpins%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Gene silencing using micro-RNA designed hairpins.</a> RNA. 8, 842-850 (2002).</li>
<li>Miyagishi, M., Taira, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((U6+promoter-driven+siRNAs+with+four+uridine+3%27+overhangs+efficiently+suppress+targeted+gene+expression+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">U6 promoter-driven siRNAs with four uridine 3' overhangs efficiently suppress targeted gene expression in mammalian cells.</a> Nat. Biotechnol. 20, 497-500 (2002).</li>
<li>Paddison, P. J., Caudy, A. A., Bernstein, E., Hannon, G. J., Conklin, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+hairpin+RNAs+%28shRNAs%29+induce+sequence-specific+silencing+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Short hairpin RNAs (shRNAs) induce sequence-specific silencing in mammalian cells.</a> Genes Dev. 16, 948-958 (2002).</li>
<li>Paul, C. P., Good, P. D., Winer, I., Engelke, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+expression+of+small+interfering+RNA+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Effective expression of small interfering RNA in human cells.</a> Nat. Biotechnol. 20, 505-508 (2002).</li>
<li>Sui, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+DNA+vector-based+RNAi+technology+to+suppress+gene+expression+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A DNA vector-based RNAi technology to suppress gene expression in mammalian cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 5515-5520 (2002).</li>
<li>Yu, J. Y., DeRuiter, S. L., Turner, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interference+by+expression+of+short-interfering+RNAs+and+hairpin+RNAs+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">RNA interference by expression of short-interfering RNAs and hairpin RNAs in mammalian cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 6047-6052 (2002).</li>
<li>van de Wetering, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+inhibition+of+gene+expression+using+a+stably+integrated%2C+inducible+small-interfering-RNA+vector%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Specific inhibition of gene expression using a stably integrated, inducible small-interfering-RNA vector.</a> EMBO Rep. 4, 609-615 (2003).</li>
<li>Hergovich, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MST1+and+hMOB1+tumor+suppressors+control+human+centrosome+duplication+by+regulating+NDR+kinase+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">The MST1 and hMOB1 tumor suppressors control human centrosome duplication by regulating NDR kinase phosphorylation.</a> Curr. Biol. 19, 1692-1702 (2009).</li>
<li>Hergovich, A., Lamla, S., Nigg, E. A., Hemmings, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centrosome-associated+NDR+kinase+regulates+centrosome+duplication%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Centrosome-associated NDR kinase regulates centrosome duplication.</a> Mol. Cell. 25, 625-634 (2007).</li>
<li>Kohler, R. S., Schmitz, D., Cornils, H., Hemmings, B. A., Hergovich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+NDR%2FLATS+interactions+with+the+human+MOB+family+reveal+a+negative+role+for+human+MOB2+in+the+regulation+of+human+NDR+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Differential NDR/LATS interactions with the human MOB family reveal a negative role for human MOB2 in the regulation of human NDR kinases.</a> Mol. Cell Biol. 30, 4507-4520 (2010).</li>
<li>Vichalkovski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NDR+kinase+is+activated+by+RASSF1A%2FMST1+in+response+to+Fas+receptor+stimulation+and+promotes+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">NDR kinase is activated by RASSF1A/MST1 in response to Fas receptor stimulation and promotes apoptosis.</a> Curr. Biol. 18, 1889-1895 (2008).</li>
<li>Pear, W. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+rapid+induction+of+a+chronic+myelogenous+leukemia-like+myeloproliferative+disease+in+mice+receiving+P210+bcr%2Fabl-transduced+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Efficient and rapid induction of a chronic myelogenous leukemia-like myeloproliferative disease in mice receiving P210 bcr/abl-transduced bone marrow.</a> Blood. 92, 3780-3792 (1998).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Biz, Tet-on sistemi büyük ölçüde özellikle manipüle gen hücrenin hayatta kalması için gerekli olan zaman idare ve / veya zor olan hücre sistemleri, gen fonksiyonu analizini kolaylaştırmak inanıyoruz. Ayrıca, son derece spesifik Tet-on sistemi ile gen ekspresyonu kontrol etme yeteneği farklı aşamalarında (hücre siklus progresyonu veya iyi tanımlanmış farklılaşma süreçleri sırasında örneğin) genlerin fonksiyonlarının çalışma fırsatı sunuyor. Burada sunulan yöntem araştırmacılar oluşturmak sağlayacak istenen kararlı Tet-bü...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar (isteğe bağlı) </td></tr><tr><td> Sığır fetüs serumu (FBS) </td><td> Invitrogen </td><td> 16000-044 </td><td> Tested Tet-ücretsiz </td></tr><tr><td> Blasticidin </td><td> Invivogen </td><td> ant-bl-1 </td><td></td></tr><tr><td> Zeocin </td><td> Invivogen </td><td> ant-zn-5 </td><td></td></tr><tr><td> G418 </td><td> PAA laboratuvarları </td><td> P31-011 </td><td> Ortam içinde 100 mg / ml </td></tr><tr><td> Anti-TET02 </td><td> Mobitec GmbH </td><td> TET02 </td><td> WB için 1/1000 ile 1/2000 kullanın </td></tr><tr><td> pcDNA6/TR </td><td> Invitrogen </td><td> V1025-20 </td><td></td></tr><tr><td> pT-Rex DEST30 </td><td> Invitrogen </td><td> 12301-016 </td><td></td&gt; </tr><tr><td> Tetrasiklin </td><td> Sigma </td><td> 87128 </td><td> 2 mg / ml etanol içinde </td></tr><tr><td> Doksisiklin </td><td> Sigma </td><td> D9891 </td><td> 2 mg / ml su içinde </td></tr><tr><td> Klonlama silindirler </td><td> Bellco Glass A.Ş. </td><td> 2090-00808 </td><td> yeniden kullanılabilir </td></tr></tbody></table>

tetrasiklin-indüklenebilir (tet-on) shrna veya cdna expression durağan İnsan hücre Üretimi

Generation of Stable Human Cell Lines with Tetracycline-inducible (Tet-on) shRNA or cDNA Expression

Memeli hücre biyolojisi alanında önemli bir yaklaşımı gösterir etmek amacı ile, seçilen hücre hatları ilgi genlerinin ifadesi manipülasyon bir ya da bu genin geçici / kararlı ekspresyonu ya da devirme kullanılarak gen fonksiyonu (ler) in çeşitli ilgi. Ne yazık ki, çeşitli hücre biyolojik araştırmalar için bu yaklaşımın uygun olduğunda hücre büyümesi / çoğalması kusurları veya istenmeyen hücre farklılaşmasında gen ekspresyonu sonucu manipülasyonlar. Bu nedenle, araştırmacılar E. alınan Tetrasiklin repressör proteini (Tetr), adapte olması coli, tetrasiklin direnci operon 1, 2,3, memeli hücrelerinde cDNA ifade etmek için çok verimli ve sıkı düzenleyici sistemleri üretmek için. Kısacası, Tetr de TO tetrasiklin (Tet-off sistemi olarak adlandırılır) ilavesinden sonra yükseltici bölgesinde Tet-operatör (TO) bağlanarak veya (2) bağlama ile transkripsiyon (1) blok başlatma ya da için modifiye edilmiştir ttetrasiklin onun yokluğunda (sistem Tet-on adlandırılır) (Şekil 1). Tet-off sistemi tetrasiklin sürekli varlığı (hangi doku hücre kültürü ortamında yaklaşık 24 saat bir yarılanma ömrüne sahiptir) gerektirir rahatsızlık Verilen Tet-sistem daha kapsamlı çok sıkı geliştirme sonuçlanan optimize edilmiştir ve cDNA ifade vektörü için etkili sistemler burada kullanılan şekliyle. Yakında kısa saç tokası RNA&#39;lar (shRNAs) eksprese 4 memeli hücrelerinde, vektörler gen demonte için RNA interferans (RNAi) kurulması sonrası siRNA&#39;lar 5-11 çok benzer işlevi tanımlanmıştır. Gen hedefleri hücresel hayatta kalmak için gerekli olan zaman stabil tükenmesi mümkün değildir Bununla beraber, bu shRNA aracılı knockdown yaklaşımları, konvansiyonel nakavt stratejiler aynı sınırlama var. Bu sınırlandırmayı aşmak için, van de Wetering ark. 12. shRNA ekspresyon vektörü pSUPER modifiye 5 </suOnları kendi ilgi hedef genlerin tetrasiklin indüklenebilir tükenmesi ile stabil hücre hatları oluşturmak için etkin promotor bölgede TO ekleyerek p&gt;. Burada, biz verimli üretmek için bir yöntem tarif istikrarlı insan Tet-on güvenilir indüklenebilir aşırı veya ilgi gen tükenmesi ya götürmek hücre hatları. Bu yöntemi kullanarak, başarılı yarattı Tet-önemli ölçüde sentrozom 13,14 ve 15,16 sinyalizasyon apoptoz MST / hMOB / NDR çağlayan analizi kolaylaştırdı hücre hatları. Bu yazıda, tercih edilen bizim vektörleri tarif verimli üretilmesi için gerekli olan iki ardışık işleme adımları tanımlayan ek olarak insan Tet-on hücre hatları (Şekil 2). Dahası, nesil için bir protokol taslağını yanısıra insan Tet-on hücre hatları, biz kritik teknik prosedürleri ile ilgili yönlerini ve karakterizasyonu hücreleri Tet-üzerinde görüşecek.

Stabil bir şekilde eksprese eden Tetr RPE-1 hücre hatları ilk karakterizasyonu için bir örneği Şekil 4&#39;te gösterilmektedir. Ebeveyn hücre hattı (negatif kontrol olarak görev yapar) eksojen Tetr proteini ifade etmez ise tüm RPE-1 klonları (Şekil 4, şeritli 1), (şerit 2 ve 5 karşılaştırın) Tetr çeşitli düzeylerde ifade unutmayın. RPE-1 arasında Tetr ekspresyonu Bu varyasyon Tet-on hücre klonlarının bekleniyor, plazmid ifade Tetr ifadesi yana plazmid entegrasyon sitede son derece bağlı...

Indüklenebilir ve ilgilenilen genin reversibl cDNA aşırı veya shRNA aracılı knock-down ile insan hücre hatları oluşturmak için bir hızlı ve kolay yolu. Bu yöntem geçici transfeksiyon yöntemleri veya konvansiyonel knockdown / nakavtla stratejileri değiştirmek zordur güvenilir ve son derece tekrarlanabilir işlemek hücre hatları için araştırmacılar sağlar.

Tetrasiklin-indüklenebilir (Tet-on) shRNA veya cDNA Expression Durağan İnsan Hücre Üretimi

A major approach in  the field of mammalian cell biology is the manipulation of the expression of  genes of interest in selected cell lines, with the aim ...

Bu prosedürün genel amacı, tetrasiklin ile indüklenebilir S-H-R-N-A veya CDNA ekspresyonuna sahip stabil insan hücre hatları oluşturmaktır. Öncelikle, hedef hücreleri tatar ekspresyon plazmidi ile transfekte edin ve blaster sid direnci için seleksiyon yapın. Ardından, tekil kolonileri seçin ve Tet represör proteinini stabil olarak eksprese eden hücreleri tarayın.Ardından, en iyi teta eksprese eden klonu, Tet yanıt elementi kontrolü altında hedef gen ekspresyonunu modüle etmek için tasarlanmış plazmidlerle transfekte edin. Çift seleksiyon altındaki transfekte hücrelerden tekil koloniler seçin ve western blotting ile istenen Teton klonları için tarama yapın. Nihayetinde, elde edilen Teton klonları, spesifik hedeflerin seçili biyolojik parametreler üzerindeki etkisini incelemek için kullanılabilir.Prosedürü laboratuvarda doktora sonrası araştırmacı Marty Gomez Martinez uygulamalı olarak gösterecektir. Aynı CMV promotöründen Tet Represör ve Blain direnç geninin ekspresyonunu sağlayan bir vektör oluşturun; iki adet 10 santimetrelik doku kültürü plağına, standart büyüme ortamında altı hücreyi tek bir merkez olacak şekilde ekin; plaklardan birini bir tatar ekspresyon plazmidi ile transfeksiyon için, diğerini ise Blain seleksiyonu için negatif kontrol olarak kullanın. Ertesi gün, plaklardan birine FU gene six kullanarak iki mikrogram TTA ekspresyon plazmidi transfekte edin.Üretici talimatlarını takip edin, ardından kültürü her iki plağın yanında gece boyunca inkübe edin. 24 saat sonra, kullanılan deneysel hücre hattı için optimal blastisin konsantrasyonunu içeren standart büyüme ortamı ekleyin, hücreleri toplayın ve ardından seri dilüsyon için 10 santimetrelik plakları etiketleyin; ardından mililitre başına beş mikrogram blastisin içeren standart büyüme ortamını kullanarak seri dilüsyon tekrarlarını plaklara ekleyin. Seçilmemiş veya transfekte edilmiş hücreleri içeren plakların uygun şekilde etiketlendiğinden emin olun. Hücreleri izleyin, özellikle seçilmemiş plaklardaki tüm hücrelerin ilk hafta içinde öldüğünü not edin.Blaster soin dirençli kolonlar ortaya çıktığında, bir ila iki hafta sonra seçici besiyerini her iki ila üç günde bir değiştirin. Kolonlar yaklaşık beş milimetre çapına ulaştığında tekil kolonların seçilebilmesini sağlamak için, beş ila 50 arasında koloni içeren plakaları seçin. Tekil kolonları toplamak için klonlama silindirleri kullanarak en az 12 bağımsız klonu izole edin.Her bir klonu 24 kuyucuklu bir plakanın ayrı kuyucuklarına aktarın ve hücreler konfluens olana kadar kültüre edin. Her koloniden elde edilen hücreleri hasat ederek altı kuyucuklu bir doku kültürü plakasındaki ayrı kuyucuklara aktarın. Kültürler konfluens olduğunda, klonları seleksiyon besiyerinde kültüre etmeye devam edin.Her kuyucuktaki hücreleri, altı kuyucuklu bir doku kültürü plağının iki ayrı kuyucuğuna bölün. Test edilecek her klon için, konfluens gerçekleşmiş hücrelerin bulunduğu bir kuyucuğu dondurun. İkinci kuyucuktaki hücreleri hasat edin. Tatar protein ekspresyonunun değerlendirilmesi için.Tatar proteinini tespit etmek için, parental hücre hattının lizatını negatif kontrol olarak kullanarak klonlar üzerinde western blot uygulayın. Mouse monoklonal anti Tet zero two antikoru kullanın. En yüksek testar ekspresyonuna sahip üç klonun ekspansiyonuna geçin.Her bir gelecek vadeden klonun serbest stoklarını mümkün olan en kısa sürede hazırlayın. Artık klonal hücreler, ilgilendiğiniz moleküler ve hücresel parametrelerin incelenmesi için hazırdır. Ebeveyn hücre hatlarını tatar eksprese eden klonlarla karşılaştırarak, ilgilenilen moleküler ve hücre biyolojik parametrelerinde herhangi bir değişiklik göstermeyen ve en yüksek tatar ekspresyonuna sahip en iyi klonu seçin.İlgili HRNA insertlerini içeren PTER plazmidleri oluşturun. Ayrıca, Gateway teknolojisini kullanarak ilgili CDNA'yı içeren bir PT REX desk 30 vektörü inşa edin. Ebeveyn hedef hücre hattını PTER veya P T-Rex S 30 plazmidleri ile geçici olarak transfekte edin.Tercih edilen transfeksiyon reaktiflerini kullanın. Ardından transfekte edilen hücreleri hasat edin ve hedef gen ekspresyonunu immünoblots ile değerlendirin. Birinci günde, sertifikalı tetrasiklin içermeyen serum kültürü ile takviye edilmiş standart büyüme ortamını kullanarak, en iyi tetrasiklin ekspresyonuna sahip klonun iki plağını gece boyunca inkübe edin.Ertesi gün, FU gene six kullanarak yalnızca bir plaketi iki mikrogram A-S-H-R-N-A veya CDNA ekspresyon plazmidi ile transfekte edin. Üçüncü günde, ya mililitre başına beş mikrogram blastisin ve mililitre başına 500 mikrogram eosin ya da blastisin ve G 418 içeren standart büyüme ortamı ekleyin. Ardından dördüncü günde, çift seçilim için standart büyüme ortamı kullanarak dilüsyonların duble plaketlerini oluşturmak üzere hücreleri bölün.Antibiyotik tedavisine karşı hücre ölümü yanıtını gözlemlemek için hücreleri günlük olarak kontrol edin ve besiyerini her üç ila dört günde bir yenileyin. İki ila üç hafta sonra, blaster aside zein veya blaster aside G four 18 çift dirençli koloniler görülmeye başladığında.Koloniler yaklaşık beş milimetre veya daha büyük bir çapa ulaşana kadar tek koloni kültürü seçmek için beş ila 50 koloni içeren plakaları seçin. Klonlama silindirleri ile tek kolonileri seçin ve bir 24 kuyucuklu doku kültürü plağının ayrı kuyucuklarına aktarın. Klonları, mililitre başına beş mikrogram blaster, soin ve mililitre başına 50 mikrogram içeren koruma konsantrasyonlu ortamda kültüre edin.Eosin veya blaster soin ve G four 18 kullanın. Hücreler konfluans seviyesine ulaştığında, her kuyucuktaki hücreleri altı kuyucuklu bir doku kültürü plağının tek bir kuyucuğuna aktarın. Hücreler tekrar konfluans seviyesine ulaştığında, %100 konfluansa ulaşana kadar kültüre etmek üzere hücreleri altı kuyucuklu bir plağın üç kuyucuğuna dağıtın.Test indüklenebilir ekspresyonu test etmek için bir kuyuktaki hücreleri dondurun; hücrelerin bulunduğu ikinci kuyuğu kontrol olarak bırakırken, bir kuyuğa mililitre başına bir mikrogram tetrasiklin ekleyin. CD NA ekspresyonunun indüksiyonu taraması için daha kısa süreler, endojen proteinlerin S-H-R-N-A aracılı tükenmesini belirlemek için ise daha uzun süreler kullanarak 24 ila 96 saat boyunca tetrasiklinsiz olarak inkübe edin. Ardından hücreleri toplayın ve uygun antikorları kullanarak immünobotsama için işleyin.İstenen azalma veya aşırı ekspresyona sahip en az iki klon seçin ve her bir kültürü genişletin. Her bir gelecek vaat eden klonun stoklarını mümkün olan en kısa sürede dondurmayı unutmayın. İnsan retinal epitelyal hücre hattının tatar'ın stabil ekspresyonu için gerçekleştirilen bu başlangıç karakterizasyonu, farklı düzeylerde tatar eksprese eden tüm RPE one klonlarını göstermektedir.Beklendiği üzere, parental RPE one hücre hattı ekzojen tatar proteinini eksprese etmemektedir. RPE one Teton hücre klonları arasındaki Tet R ekspresyonundaki varyasyon, plazmid entegrasyon bölgelerini yansıtmaktadır. Bu deney, MST three kinaza karşı yönlendirilmiş RNA'ları eksprese eden stabil RPE one Teton hücre klonlarını karakterize etmektedir; daha fazla analiz için üç hücre klonu seçilmiştir.Bu videoyu izledikten sonra, araştırma konunuz olan RNA veya cDNA'nın kontrolsüz ekspresyonuna sahip stabil insan hücre hatlarının nasıl oluşturulacağı konusunda iyi bir anlayış kazanmış olacaksınız.

generation-stable-human-cell-lines-with-tetracycline-inducible-tet-on

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

E4orf4 ile uyarılan hücre ölümüne ACF kromatin yeniden faktör katkı ölçüldü. Protokol doksisiklin tedavi ACF alt birimleri ACF1 ve SNF2h koşullu devirme neden olduğu hücre klonlarının seçimi içermektedir, ve indüklenebilir hücre hatlarında E4orf4 ile uyarılan hücre ölümü ölçmek için DAPI tahlil kullanımı.

E4orf4 Bağlı Hücre Ölümü üzerine Nakavt Etkilerinin Gen Ekspresyonu ve Ölçüm Şartlı Nakavt için Hücre hatları hazırlanması

Bu video, bir fare modelinde tetrasiklin veya Tet-On gen ekspresyon sistemini göstermektedir. Bir tetrasiklin türevi olan doksisiklin varlığında, ters tetrasiklin kontrollü transaktivatör proteinden oluşan Tet-On sistemi aktive olur ve ilgilenilen geni eksprese eder.

İndüklenebilir Tet-On Düzenlenebilir Sistem Tabanlı In Vivo: Fare Modelinde Hedef Gen Transkripsiyon Aktivasyonu için Tetrasiklin Kaynaklı Bir Gen Ekspresyon Sistemi

Bu video, ilgilenilen bir gen ve düzenleyici bir plazmid içeren bir plazmit ile transfeksiyon yoluyla kültürlenmiş hücrelerde gen ekspresyonunu düzenleme yöntemini açıklar. Bu plazmitin ekspresyonu, tetrasiklin veya sentetik analogları tarafından kontrol edilebilir, bu da bu sistemi düzenlenebilir gen ekspresyonunu incelemek için yararlı bir model haline getirir.

İndüklenebilir Tet-Off Düzenlenebilir Sistemi: Tetrasiklin Kapalı Sistemi Kullanılarak Kültürlenmiş Hücrelerde Gen Ekspresyonunu Modüle Etmek İçin Bir İn Vitro Yöntem

Burada, retroviral transdüksiyon ve tetrasiklin yokluğunda bir lentiviral vektör (IV) bileşenleri ifade edebilen bir hücre çizgisi oluşturmak için concatemeric transfeksiyon kullanın. Bu AG GFP kodlar ve dendritik hücreler üzerinde reseptörü için spesifik olan bir glikoprotein, SVGmu ile pseudotyped edilir.

Bir Tetrasiklin düzenlenmiş Hücre Hattı Özellikle dendritik hücreler Hedef Yüksek titre Lentiviral vektörler üretir

Bu yazıda, mevcut bir TCR'nin TCRα ya TCRβ eşleştirme periferal T hücresi reseptör repertuvarının tamamlayıcı hemichain ile, ilgi konusu antijen spesifikliğini sahip antijen-spesifik T hücre reseptörleri (TCR'ler) oluşturmak için yeni bir metot açıklamaktadır. De novo oluşturulan TCRler afiniteye değişen antijen spesifikliğini muhafaza eder.

Yaratma<em&gt; De Novo</em&gt; Merkezli Hemichain retroviral transdüksiyonu ile antijen-özel insan T hücre reseptörleri

bir heterolog ifade sistemi ile incelenmesi iyon kanalları biyomedikal araştırmalarda bir çekirdek tekniği haline gelmiştir. Bu yazıda, bir uyarılabilir promoterin kontrolü altında geçici transfeksiyon gerçekleştirerek sıkı bir şekilde kontrol iyon kanal ekspresyonunu elde etmek için bir zaman etkili bir yöntem sunmaktadır.

İndüklenebilir geçici transfeksiyon yoluyla kontrol edilebilir iyon kanal İfade

Bu iletişim kuralı olarak bir düzeni kanser hücre satırları ve sonraki kullanımı, işlevsel bir Tet-ON sistemi kurmak için özellikle monosit/makrofajlar tümör microenvironment için işe alım içinde tümör hücre kaynaklı proteinlerin rolü eğitimi için hizmet vermektedir.

Monosit/makrofajlar tümör Microenvironment için işe alım çalışmaya kanser hücre hatlarında gen ifadesinin koşullu nakavt

Burada içinde protein var koşullu olarak ters bir baskın negatif mutant yorum overexpressing tarafından inaktive bir baskın negatif indüklenebilir sistemi geliştirmek için bir iletişim kuralı mevcut.

İndüklenebilir ve tersinir baskın-negatif (DN) Protein inhibisyon

Burada, bir pipet elektroporasyon tekniğiile birleştiğinde indüklenebilir bir ifade sistemi kullanılarak primer alveoler epitel hücrelerinde bir transkript posttranskripsiyonel modülasyonu incelemek için kullanılabilecek bir araç salıyoruz.

Primer Alveolar Epitel Hücrelerde MRNA Transkriptlerinin Kararlılığının Araştırılması için Etkili Transkripsiyonel Kontrollü Plazmid Ekspresyon Sistemi

Bu protokolde, clusterin'in hasta kaynaklı GCSC'lerin sapı üzerindeki etkisini incelemek için koşullu bir nakavt sistemi ve uyarlanmış küre oluşum testini kullanarak deneysel bir tasarım salıyoruz. Protokol, farklı CSC türlerinde köklüğe bağlı genlerin hem in vitro hem de in vivo fonksiyonlarını incelemek için kolayca uyarlanabilir.

Kombine Koşullu Knockdown ve Uyarlanmış Küre Oluşumu Çalışma Hasta Kaynaklı Mide Kanseri Kök Hücrelerin bir Stemness-Associated Gene Çalışma

Öğrenin, insan hücre hatlarında tetrasklin-indüklenebilir shRNA veya cDNA ifadesiyle gen fonksiyonunu çalışmak için kararlı hücre hatları üretme yöntemini. Bu güvenilir sistem, zor transfekte edilen hücrelerde gen manipülasyonunu sağlar.

Tetrasiklin-indüklenebilir (Tet-on) shRNA veya cDNA Expression Durağan İnsan Hücre Üretimi

Daha fazla video keşfet