Chef-tdTomato kullanarak Zebrafish Somatosensoriyel Nöron Optogenetic Etkinleştirme

Bu prosedürün genel amacı, larva zebra balıklarında tek somatosensoriyel nöronları aktive etmektir. Bu, önce bir optik kablo hazırlanarak ve onu ADPSS mavi lazere bağlayarak gerçekleştirilir. İkinci adım, transgeni bir ila iki hücre aşaması embriyosuna enjekte etmektir.

Daha sonra, somatosensoriyel nöronlarda C-H-E-F-T-D domatesini eksprese eden yağ embriyolarını tarayın ve bunları inuslara monte edin. Son adım, tek nöron aktivasyonu için kısa bir mavi ışık darbesi vermek ve ortaya çıkan davranışı kaydetmektir. Kanal kökü Seçenek İki'yi kullanan mevcut yöntemlerin bu tekniğinin ana avantajı, bu yaklaşımın, hastaneye yatıştan en az dört gün sonrasına kadar aktive olan tek nöronlardan davranışsal tepkiler ortaya çıkarmak için kullanılabilmesidir.

Bu yöntem, larva zebra balıklarındaki belirli somatosensoriyel nöronların işlevi hakkında bilgi sağlamak için kullanılıyor olsa da. Bu yaklaşım, iç nöronlar veya motor nöronlar gibi herhangi bir zebra balığı nöronal popülasyonu tarafından ortaya çıkan davranışları incelemek için de uyarlanabilir. Bu genetik yaklaşım, in vivo olarak spesifik nöronları aktive etmek, fonksiyonel gelişimi karakterize etmek, mutasyonların veya spesifik proteinlerin fenomenolojik blokajının davranış üzerindeki etkilerini değerlendirmek ve farklı davranışsal tepkilere yol açan aşağı akış nöronal ağlarını haritalamak için kullanılabilir.

Bu işleme başlamak için, bir camın konik boynunu eriterek optik kablo için bir depolama birimi oluşturun. 150 derecelik bir açı yapmak için bir demet ve brülörün üzerine makarna pipeti yapın. Ardından, bir tel kesici veya tıraş bıçağı kullanarak optik kabloyu dikkatlice iki parçaya bölün.

Her parçanın bir ucu açıkta ve bir ucu bir FC PC adaptörü ile olmalıdır. Ardından, kablonun kesilen ucunun 5.0 santimetresinden fiber kılıfı çıkararak, lifleri güçlendirerek ve kaplayarak optik kabloyu kaplamaya kadar soyun. Daha sonra optik kabloyu hazırlanan makarna pipetine yerleştirin.

Elmaslı bir cam kesici veya ince uçlu bir forsep kullanarak kablonun pipet ucunun içine ve dışına kolayca hareket edebildiğinden emin olun. Cam elyafı çentikleyin ve elyafın ucunda temiz bir kesim oluşturmak için ucunu kırın. Ardından, optik kabloyu makarna pipetine geri çekin.

Daha sonra optik kabloyu mikroskop altında bir mikro manipülatör kullanarak makarna pipetine yerleştirin, daha sonra bir çift forseps kullanarak 24 ila 48 HPF embriyosunu manuel olarak KOKLAYIN, larvaları bir floresan diseksiyon mikroskobu kullanarak% 0.02 trica kullanarak uyuşturun. Larvaları Ron Beard nöronu veya trigeminal nöron ekspresyonu ile tanımlayın Kolayca tanımlanabilen hücrelerde seyrek ekspresyona sahip embriyolar optimaldir, ancak bireysel nöronlar bir fiber optik kablo ile aktivasyon için hedeflenecektir, bu nedenle geniş bir ekspresyon yoğunluğu aralığı kabul edilebilir. Larvaları taze PTU mavi embriyo suyu ile yeni bir tabağa aktarın.

Embriyoları 28,5 santigrat derecede karanlıkta istenen deney aşamasına kadar saklayın. Bu bölümde% 1.5 düşük maltaz ve çift damıtılmış su yapın ve katılaşmasını önlemek için 42 santigrat derece ısı bloğunda saklayın. Bir cam makarna pipeti kullanarak, ön eleme larvalarından birini mümkün olduğunca az mavi embriyo suyu ile% 1.5 düşük eriyik agaroz tüpüne aktarın.

Daha sonra larvaları bir damla agaroz içinde küçük bir Petri kabına aktarın. Diseksiyon mikroskobu altında, aros katılaştığında lav sırt tarafını yukarı doğru konumlandırın. Lavın her iki tarafından aros kesmek için ince bir tıraş bıçağı kullanın.

Aros'u çevreleyen alanı embriyo mavisi su ile doldurun. Ardından, lavları çentiklememeye dikkat ederek yumurta sarısının her iki tarafında iki çapraz kesim yapın. Daha sonra, agrow'u lavın gövdesinden ve kuyruğundan uzaklaştırın.

Şimdi yüksek hızlı kamerayı diseksiyon dürbününe monte edin ve kamerayı bilgisayara bağlayın. Ardından bilgisayarı ve yüksek hızlı kamerayı açın. Video görüntüleme yazılımını açın ve kamera ayarlarını yapın.

Ardından, optik kabloyu, lazeri ve stimülatörü birbirine bağlayın. Ardından stimülatörü açın ve maksimum beş volta ve beş milisaniyelik darbe süresine ayarlayın. Daha sonra lazeri açın.

Ardından, optik kablonun ucunu C-H-E-F-T-D domates ekspresyonu olan bir nöron hücre gövdesinin yakınına yerleştirmek için floresan diseksiyon mikroskobunu kullanın. Duyusal nöronu aktive etmek için bir mavi ışık darbesi verin. Ardından, yüksek hızlı bir kamera kullanarak yanıtları kaydedin.

Saniyede 500 veya 1000 kareye ayarlayın ve alışmayı önlemek, lav önceki kısmını, Aris'i forsepsle serbest bırakmak için aktivasyonlar arasında en az bir dakika olacak şekilde deneyi tekrarlayın ve hayvanı içeri sokmamaya dikkat edin. Daha sonra taze mavi embriyo suyuna aktarın. Hayvanların daha fazla gelişmesine izin verilebilir ve prosedür daha eski aşamalarda tekrarlanabilir.

Embriyo, davranışı hücresel yapı ile ilişkilendirmek için aktive edilmiş hücrenin yüksek çözünürlüklü konfokal görüntülemesi için de yeniden monte edilebilir. Burada diyagramı çizilen zebra balığı lavı, rostral kısmını çevreleyen çizgi çizgileri ile temsil edilen %1.5 düşük malt Aris'e kısmen monte edilmiştir. Bir trigeminal nöron ve bir Rohan sakal nöronu, resimdeki çizgi çizgileri ile özetlenen kırmızı ağızlı hücrelerde tasvir edilmiştir.

İşte yaklaşık 35 HPF lavda C-H-E-F-T-D domatesi eksprese eden tek bir Rohan sakal nöronunun aktivasyonunun davranışsal bir tepki ortaya çıkardığını gösteren bir film. Bu film, 60 HPF'lik bir lavda Rohan sakal nöronlarını eksprese eden C-H-E-F-T-D domatesinin aktivasyonunu gösterir ve bu film, C-H-E-F-T-D domates ekspresyonu Rohan sakal nöronlarının aktivasyonunu dört DPF'lik bir lavda gösterir. Bu genetik yaklaşım bir saatin altında gerçekleştirilebilir.

Bu videoyu izledikten sonra, çeşitli zaman noktalarında bireysel nöronları ve larva Terazi balıklarını nasıl aktive edeceğinizi iyi anlamış olmalısınız. Lazerlerle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken her zaman uygun güvenlik önlemlerinin alınması gerektiğini unutmayın.