Birincil Preneoplastic Meme Epitel Hücrelerinin Time-lapse görüntüleme Meme Kanseri Genetik Fare Modelleri türetilen

Aşağıdaki deneyin genel amacı, meme kanserine yatkın genetik lezyonların primer kültürdeki epifiz plastik hafıza hücrelerinin davranışını değiştirip değiştirmediğini belirlemektir. Bu, genetik olarak tasarlanmış farelerden birincil meme epitel hücrelerinin izole edilmesiyle elde edilir. İkinci adım olarak, canlı hücre hızlandırılmış görüntüleme beş ila yedi gün boyunca gerçekleştirilir ve hücre davranışını analiz etmek için bir film oluşturulur.

Daha sonra, meme kanserinin genetik olarak tasarlanmış farklı fare modellerinden izole edilen hücrelerin davranışlarını ölçmek ve karşılaştırmak için tek hücreleri izleyen bir yazılım programı kullanılır. Sonuçlar, spesifik genetik lezyonların preneoplastik bellekte farklı davranışlara neden olduğunu göstermektedir. Tek hücre takibi kullanılarak gerçekleştirilen kantitatif davranışsal analizlere dayalı epitel hücreleri.

Bu yöntem, farklı genetik lezyonların preneoplastik meme meme epitel hücrelerinin davranışını nasıl değiştirdiğine dair fikir verebilir. Preneoplastik, diğer organlardan gelen hücreler, herhangi bir organdan gelen kanser hücreleri gibi diğer sistemlere de uygulanabilir, olası tedaviye bağlı davranış değişikliklerinin incelenmesinin yanı sıra, prosedürü gösteren normal ve kanserli dokudan stromal hücre davranışının karşılaştırılması da dahildir. Bugün, bu yayının kıdemli yazarı Dr.Priscilla Firth ve Georgetown Üniversitesi'ndeki Lombardi Kanser Araştırma Merkezi'ndeki Mikroskopi ve Görüntüleme ortak kaynak Merkezi'nin yöneticisi Pete Johnson olacak.

Bir fareye ötenazi yapın ve hemen nekropsiye devam edin. Fareyi bir strafor nekropsi platformuna sırtüstü yatırın ve ventral cilt gergin olacak şekilde dört uzvunu da sabitleyin. Uzuvlardaki cilt de dahil olmak üzere ventral cildi ve saçı% 70 etanol ile doyurun.

İki ve üç numaralı ve dört ve beş numaralı meme bezlerini deriden orta hat kesisi ile ortaya çıkarın. İnsizyonu, dört ekstremitenin medial derisinden iki y insizyonu ile uzatın. Künt diseksiyon kullanarak peritona girmemeye dikkat edin.

Cildi alttaki peritondan ayırın. Cildin her iki tarafından gergin olana kadar geri çekin ve dış taraftan başlayarak platforma sabitleyin. Sağlam inal ve/veya torasik meme bezlerini alttaki bağ dokusu ve kastan izole eden künt bir diseksiyon yapmak için makası kullanın.

Bir veya iki meme bezini 10 santimetrelik bir Petri kabına yerleştirin ve bir doku kültürü başlığına geçin. Şimdi, meme lenf düğümleri için bezleri inceleyin. Sarımsı bir renge sahip küçük, iyi sınırlı nodüller.

Bir neşter ve forseps kullanarak, bunları çevreleyen bezden çıkarın. Meme dokusunu iki neşter kullanarak milimetre büyüklüğünde küpler halinde doğrayın. Kıyılmış meme dokusunu beş mililitre ayrışma ortamı ile 50 mililitrelik konik bir tüpe yerleştirin.

Nazik bir tat ile karıştırın ve gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün kapağı gevşek tutun. Birincil epitel hücrelerini izole edin ve kültürleyin.

Hücreleri kapladıktan hemen sonra. Altı kuyulu plakayı bir inkübasyon odası içindeki bir mikroskop aşamasına güvenli bir şekilde yerleştirin. Plakanın en az 15 dakika dengelenmesine izin verin.

Kohler aydınlatması için kondansatörü ayarlayın ve faz halkalarını ortalayın. Velocity gibi görüntü alma yazılımını açın ve hızlandırılmış görüntüler için bir kitaplık oluşturun ve adlandırın ve büyük dosyalar için yeterli alana sahip bir konuma kaydedin. Sahne lensi girişimini önlemek için lensleri indirin.

Aşama başlığı altında, X, Y, Z sekmesi altında Z sıfıra eşittir odak düzlemi ayarını yeniden elde etmek için aşamayı kalibre et'i seçin. Ve sahne alanının altında nokta ekle'yi seçerek görüntüleme noktalarını işaretleyin. Başlık: Her kuyunun ortasına görüntüleme noktaları yerleştirin.

Faz kontrast görüntüleme, plastik kuyuların çevresine yakın yerlerde bozulabilir. Bir karedeki noktaları, her biri yaklaşık %5 örtüşme ile dörde dört alan halinde düzenleyin. Sahne alanı altında seçilen noktaları kaydedin.

Sahne altında, odak haritası yap'ı seçin ve her noktanın odağını ayarlamak için istemi izleyin. Ardından, görüntü alma zamanlamasını, saatte doğru sayıda resim çekecek şekilde ayarlayın. Şimdi odak haritasını sahne altına kaydedin.

Sağ taraftaki araç çubuğunda görüntü alımına sağ tıklayarak devam edin. Ardından görüntüleme ayarlarını kaydedin. Bir saat sonra görüntüleme işlemine başlamak için kayıt düğmesine basın, herhangi bir ayarlama gerekip gerekmediğini görmek için görüntülerin odağını kontrol edin.

Hücreler birleştiğinde beş gün boyunca canlı görüntülemeyi izleyin ve devam ettirin. Elde edilen dijital görüntülerin izlenmesi ve odak haritasının ilk 24 saat boyunca sık sık ayarlanması çok önemlidir, çünkü hücreler daha sonra günde en az iki kez plakaya bağlanacaktır. Hücrelerin odakta olduğunu ve kültürlerin kontamine olmadığını kontrol edin.

İlk koloni oluşumunun mekanizmasını belirlemek için, plaka üzerindeki bir görüntüleme bölgesini temsil eden tek bir görüntü yığını ile başlayın. İlk çerçevelerde, hücreler yüzer olacak, epitel ve fibroblast hücreleri hücre morfolojisi ile ayırt edilebilir. Epitel hücreleri küboidal bir şekle sahiptir ve hücre kolonileri oluşturur.

Bir tür stromal hücre olan fibroblastlar uzun bir morfolojiye sahiptir. İlk epitel hücresinin plakaya ne zaman yapıştığını belirlemek için seri görüntüleri takip edin. Bu adımda, epitel hücreleri daha küboidal morfolojileri ile fibroblastlardan tanımlanabilir ve ayırt edilebilir.

Bu tek epitel hücresini seri görüntüler aracılığıyla takip edin ve sonraki 24 saat boyunca kaderini takip edin. Hücre ek epitel hücreleri ile çevrili hale gelirse, hücre bölünmesi geçirirse veya apoptoz geçirirse, epitel hücreleri ile çevriliyse, koloni oluşum mekanizmasının çevrenin toplanmasından veya hücre bölünmesinden belirlenebileceğini unutmayın. Belirli bir süre boyunca apoptoza uğrayan başlangıçta yapışık hücrelerin sayısını belirlemek için ilk 24 saat boyunca hücre bölünmesine karşı hücre agregasyonu ile oluşan kolonilerin sayısını kaydedin.

Zamanla yapışık kalmış bir hücrede gelişen apoptozun klasik özelliklerinin görünümü için seri görüntüleri takip edin. Kültürdeki epitel hücreleri, morfolojilerini başlangıçtaki küboidal şekilden daha uzun bir görünüme değiştirir. EMT ile tutarlı.

Kaplamadan sonraki gün ve saati belirlemek için seri görüntüleri takip edin Bu meydana geldiğinde, TTT programını başlatarak başlayın. Kullanıcı baş harflerini seçin ve devam et'i tıklayın. NAS'ı ayarla tuşuna basın, kullanıcı tarafından oluşturulan TTT dışa aktarma klasörünü seçin ve Tamam'a tıklayın.

Tarayıcıda bir deneme klasörü seçin. Bir konum klasörü seçin ve ardından konumu yükle düğmesine basın. Oküler faktörü 10 kez gönderin.

Genellikle tüm görüntülerden oluşan gerekli görüntü sayısını yükleyin. Bu analizi kullanırken. Hücre düzenleyici penceresinde ilk kez, film penceresindeki dosya menüsü altında yeni koloni'yi seçin.

İz hücresi düğmesine basın veya F iki düğmesine basın. Bir hücreyi izlemeye başlamak için. Film penceresinde bir hücreyi tanımlayın ve imleci hücrenin üzerine getirin.

F iki tıklandıktan sonra hücre numarasını içeren bir daire görünmelidir. Hücrenin yerleşimini izlemek ve sonraki resme ilerlemek için sayısal tuş takımındaki sıfır tuşunu kullanın. Her hücrenin her çerçeve boyunca yerleşimini takip etmek için imleci hareket ettirin.

Bir parçayı silmek ve önceki görüntüye dönmek için, hücreyi izlemeden kareleri ileri taşımak için sayısal tuş takımında sil tuşuna basın, üçe basın. Ve izlemeden geri gitmek için birine basın. Film penceresinde bir hücre bölünmesini işaretlemek için, film penceresinde hücre ölümünü işaretlemek için bölme düğmesine tıklayın, hücre ölümüne tıklayın.

Bir bölünme meydana geldiğinde, yavru hücreler aynı hücre kader haritasında izlenebilir. Bunu yapmak için, hücre düzenleyici penceresine gidin ve belirlenen nokta hücresinin daire sembolüne sağ tıklayın. Bu, izleme modunu otomatik olarak başlatır, şimdi ağacı kurtarmak için F 10'a basın.

Her ağaç, belirlenen çıktı klasörüne kaydedilecektir. Hücre düzenleyici penceresinde yeni bir sülfat haritası başlatmak için açık menüyü seçin, dosyaya tıklayın ve tıklayın. Yeni koloni hücreleri, görüntülemenin başlangıcında yuvarlaktı ve yüzdü.

Boyut çubukları 200 mikrona eşittir Plakaya tutturulduktan sonra düz hale geldiler ve küboidal tip bir görünüm gösterdiler. Dört günlük kültürle, epitel hücrelerinin çoğunluğu EMT benzeri bir morfolojiye uzadı. Bu değişiklik, incelenen tüm genotiplerde aynı kronoloji ile meydana geldi: yüzen hücreler, tanımlanmış bireysel epitel hücre kolonilerine dönüştü.

Kaplamadan 24 saat sonra, seri görüntü analizi, bu kolonilerin hücre bölünmesinden ziyade hücre toplanması ile üretildiğini ortaya çıkardı. BRCA'nın bozulması tek başına oluşan koloni sayısını değiştirmedi. TP 53 haplo yetmezliğinin eklenmesi, oluşan koloni sayısını önemli ölçüde azaltmıştır.

Benzer şekilde, ekspresyon üzerine ER alfa eklenmesi, bu prosedürü takiben oluşan koloni sayısını önemli ölçüde artırdı. Spesifik terapötik yaklaşımların veya ek genetik lezyonların hücre davranışını nasıl değiştirdiği ve terapötik yanıtı veya kanser ilerlemesini nasıl etkileyebileceği gibi ek soruları yanıtlamak için tek hücre izleme ile birlikte hızlandırılmış görüntülemenin kullanımını kullanan diğer yöntemler gerçekleştirilebilir.