Name: Birincil Preneoplastic Meme Epitel Hücrelerinin Time-lapse görüntüleme Meme Kanseri Genetik Fare Modelleri türetilen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-08T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 47 s
Description: Öğrenin meme kanserinde genetik lezyonların preneoplastik meme epitel hücrelerinin davranışlarını nasıl değiştirdiğini. Genetik olarak modifiye edilmiş fare modellerinden hücre izolasyonu ve tek hücre takibi kullanılarak zamana bağlı görüntüleme yapılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar canlı hücre görüntüleme yaptığı giriş için teknik yardım ve Michael Rieger için Bofan Wu ve Hıristiyan Raithel teşekkür etmek istiyorum. NCI, NIH RO1CA112176 (PAF), NCI, NIH tarafından desteklenir. R01CA89041-10S1 (PAF), Deutscher Akademischer Austaush Dienst eV A/09/72227 Ref. 316 (REN), Savunma Bakanlığı W81XWH-11-1-0074 (REN), Eğitim, Bilim ve Teknoloji Bakanlığı (R31-10069) tarafından finanse Kore Ulusal Araştırma Vakfı aracılığıyla WCU (World Class Üniversitesi) programı (PAF ), NIH IG20 RR025828-01 (Kemirgen Bariyer Tesisi Ekipman) ve NIH NCI 5P30CA051008 (Mikroskopi ve Görüntüleme ve Hayvansal Paylaşılan Kaynakları).

<html> 1. Genel Şeması <ol><li> Genetiği ve meme bezlerinden preneoplastic meme epitel hücrelerinin primer kültürlerinde üretmek ve wild-tip farelerden kontrol. </li><li> Canlı hücre görüntüleri 5 gün için Volocity görüntü alma yazılımı (sürüm 5.3.1, Perkin Elmer, Waltham, MA) kullanılarak her 15 min. </li><li> Zamanlama ve epitel hücre koloni oluşum mekanizması, apoptoz insidansı ve morfolojik değişikliklerin aşamalı değerlendirmek için doğrudan zaman atlamalı görüntüleri görüntüle. </li><li> Için oluşturulan Volocity. TIFF yığınlarının dönüştürün. MetaMorph Mikroskopi Otomasyon ve Görüntü Analiz Yazılımı (Molecular Devices, LLC Sunnyvale, CA) ve rename dijital görüntü dosyaları (Rename 2.1.6 kullanarak JPG dosyaları <a href="http://www.softpedia.com/get/System/File-Management/THE-Rename.shtml" target="_blank">http://www.softpedia.com/get / Sistem / Dosya Yönetimi /-Rename.shtml</a> ) Timm en Takip Aracı yazılımı (TTT, uyum sağlamak için,tz-muenchen.de/en/isf/hematopoiesis/software-download/index.html &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; http://www.helmholtz-muenchen.de/en/isf/hematopoiesis/software-download/index. html). </li><li> TTT kullanarak, hücre bölünmeleri (hücre yaşam) ve hücre bölünmesi desenleri (simetrik karşı asimetrik) arasındaki süresinin belirlenmesinde hücre kaderinin haritaları oluşturmak. </li><li> Farklı genetik fare modelleri ve / veya vahşi tip kontroller arasında anlamlı farklılık olup olmadığını belirlemek için adım 3 ve üzeri 5 kantitatif verileri analiz. </li></ol> 2. Primer Meme Epitel Hücre Kültürleri Nesil <ol><li> Üreticinin talimatlarına (EpiCult-B Fare Orta Takımı, Stemcell Technologies, Vancouver, BC) bir varyasyon takiben tek meme epitel hücrelerinin izolasyonu için Komple Media hazırlayın. 450 ml Epi-Cult-B ortam, 50 ml Epi-Cult B proliferasyon takviyesi,% 5 fetal sığır serumu (FBS), 50 ug / ml penisilin / streptomisin (PenStr Kombineep) ve 10 ng / ml &#39;Epidermal Büyüme Faktörü (EGF). </li><li> 2.1 9 parça Komple Media ile 10x kollajenaz / Hyaluronidaz karışımı, 1 kısım birleştirerek Ayrılma Medya hazırlayın. </li><li> Fare Euthanize ve hemen otopsiye geçin. Sıra bir styrofoam otopsi platformda sırtında fare ve ventral deri gergin olduğunu bu yüzden tüm dört bacağı sabitleyin. O% 70 etanol ile, bacaklarda örten dahil ventral deri ve saç, doyurabilecek. Medial her ön ekstremite cilt ve yoluyla bir Y-kesi içine uzatılır deri yoluyla ortadan ensizyon (periton girmeyin) yaparak # 2/3 (göğüs) ve # 4/5 (inguinal) meme bezlerinin Açığa her iki arka ekstremite medial deri yoluyla Y insizyonu baş aşağı bir. </li><li> Künt diseksiyon kullanarak underlyingperitoneum cilt ayırmak, bu gergin kadar cildin her iki tarafına geri çekin ve işaretçilerine kullanarak strafor otopsi platforma sabitleyin. Dış taraftan başlayarak, disse akılcı kullanımı ile künt diseksiyon kullanabilirsinizction makas sağlam kasık ve / veya altta yatan bağ dokusu ve kas torasik meme bezleri izole etmek. 10 cm steril Petri kabındaki ikiden fazla meme bezlerinin yerleştirin ve doku kültürü kaputu taşımak. </li><li> Doku kültürü kaputu içinde, sarımsı bir renk ile küçük, iyi sınırlı nodüller olarak tanımlanan meme lenf düğümleri için bezleri inceleyin. Steril neşter ve forseps kullanarak çevredeki bezinden lenf düğümleri kaldırın. İki steril neşter, her biri bir el kullanarak ~ 1 mm 3 küpler halinde meme dokusu Kıyma. </li><li> Sıra yavaşça 10 ml pipet kullanarak 2-3 kez aşağı yukarı pipetleme ve tarafından 5 ml Ayrışma Medya, mix meme dokusu kıyılmış ve% 5 CO 2 ile 37 ° C inkübatör (en fazla ~ 16 saat) bir gece inkübe gevşeyen kapaklı 50 ml konik tüp. </li><li> Ertesi sabah, kırmızı bl teşvik etmek için amonyum klorür çözeltisi tamponlanmış% 2 FBS ve 4 kısım ihtiva eden 1 kısım Hanks Dengelenmiş Tuz Çözeltisi (HBSS) bir soğuk karışım hazırlamakood hücre lizisi (HFAmCl) yanı sıra, soğuk HBSS% 2 FBS (HF) ile desteklenmiştir. Ön sıcak Tripsin-EDTA (% 0.25), Hank Dengeli Tuz Çözeltisi içinde 5 mg / ml dispase, 1 mg / ml DNase I, ve Komple Media modifiye edilmiştir. </li><li> Inkübatör meme dokusu ile konik santrifüj tüpü çıkarın ve yavaşça girdap 2-3 sn iki kez darbe. 5 dk (oda sıcaklığında ya da 4 ° C) için 450 x g&#39;de santrifüjleyin tüp, ve süpernatan atılır. </li><li> 5 dk (oda sıcaklığında ya da 4 ° C) için 450 x g hızında 10 ml HFAmCl ve santrifüj içinde en az bir pelet yeniden süspanse edin ve süpernatan atılır. </li><li> Pelet 3 ml tripsin-EDTA ekleyin ve 5 ml&#39;lik pipet ile ilk karıştırın ve daha sonra tel (1-3 dk) kadar P1000 mikropipet ile. 5 dk (oda sıcaklığında ya da 4 ° C) 450 10 ml HF, santrifüj × g ekleyin ve supernatant atın. </li><li> 5 mg / ml dispase 2 ml ve 1 mg / ml DNase I pelet ve 1 dakika süreyle bir P1000 mikropipet ile karıştırmak için 200 ul ekle. Örnek clo olmalıdırudy ama kılçıklı değil. Lifli ise, DNaz I 100 ul ekleyin ve tekrar karıştırın. </li><li> 5 dk (oda sıcaklığında ya da 4 ° C) 10 ml soğuk HF, 450 bir 40 mikron hücre süzgecinden ve santrifüj yoluyla gerginlik × g ekleyin ve supernatant atın. </li><li> Komple Media nihai pelletini tekrar. Hücrelerin toplam sayısı (hemasitometre veya Coulter Sayacı kullanılarak) ölçmek. İki meme bezlerinin yaklaşık 1 x 10 6 1 x 10 7 hücre verim. Kuyu başına 1,5 x 10 5 hücre yoğunluğunda bir düz dipli 6 plaka Plak primer epitelyal hücreler. </li></ol> 3. Canlı hücre Görüntüleme <ol><li> Hemen hücreleri kaplama sonra, 2 / humidity/37 doymuş ° C sıcaklıkta inkübasyon odası% 5 CO içinde bir mikroskop sahne üzerine güvenli bir şekilde 6-plaka yerleştirin. Kohler aydınlatması ve merkezi faz halkaları için kondenser ayarlayın. Burada sunulan deneyler için, ters çevrilmiş bir Nikon Eclipse TE300/PerkinElmer Disk konfokal İplik10x objektif lens ile Widefield faz kontrast modunda mikroskop sistemi kullanılmıştır. </li><li> Açık görüntü toplama yazılımı, oluşturmak ve zaman atlamalı görüntüler için bir kütüphane isim ve büyük dosyalar için yeterli alana sahip bir yere kaydedin. Deneyleri burada kullanılan Volocity görüntü alma yazılımı (sürüm 5.3.1, Perkin Elmer, Waltham, MA) sundu. </li><li> Plaka 15 dk en az mikroskop inkübatör dengelemek için izin verin. Aşamasında objektif bir girişimi engellemek için lensler indirin. &quot;Sahne&quot; başlığı altında, &quot;Aşama kalibre edin.&quot; Seçeneğini Odak düzlemi, set Z başlığı &quot;Sahne&quot; altında &quot;Add noktası&quot; seçerek x, y, z sekmesi ve işareti görüntüleme puan altında = sıfır. Reacquire Faz kontrast görüntüleme gibi görüntüleme için 6-plaka Her kuyunun ortasına yerleştirin puan plastik kuyuların çevre yakın bozulabilir. 4 x 4 alan (650 mikron x 700 mikron alanları), küçük bir örtüşme (yaklaşık% 5) her bir kare noktaları düzenleyin. &quot;Stag altında seçilen noktalarını kaydedine &quot;. </li><li> &quot;Sahne&quot; altında seçin &quot;odak harita olun&quot; ve her noktasındaki odağı ayarlamak için yönergeleri izleyin. Saatte 4 fotoğraf (her 15 dakikada) yakalamak için görüntü toplama zamanlaması ayarlayın. Bu özel deney gereksinimlerine bağlı olarak ayarlanabilir. &quot;Sahne&quot; altında odak haritayı kaydedin. </li><li> Sağ sağ tarafında araç çubuğu &quot;Image Acquisition&quot; üzerine tıklayın ve görüntüleme ayarları kaydedin. Görüntüleme başlamak için kayıt düğmesine basın. 1 saat sonra, herhangi bir ayarlama gerekip gerekmediğini görmek için görüntülerin odağı kontrol. </li><li> Monitör ve hücreler konfluent olunca biten, 5 gün boyunca canlı görüntüleme devam eder. </li></ol> 4. Zamanlama Başlangıç ​​ve Epitel Hücre Colony Oluşum Mekanizması, Apoptozis insidansı ve Morfolojik Değişikliklerin Aşamalandırma Değerlendirememesi Time-lapse Görüntüler Doğrudan İzlenimi <ol><li> Zaman atlamalı görüntüleri Doğrudan görüntüleme uyumlu herhangi bir video izleme yazılımı (örneğin kullanılarak performans alınabilir <a href="http://www.real.com/" target="_blank">http:</a>/ / Www.real.com/ realplayer veya diğer ücretsiz ya da ticari olarak temin yazılımı). Görüntüler bu aşamada ya. JPG dosyaları (Adım 5) dönüşüm sonra. TIFF formatında izlenebilir. </li><li> İlk koloni oluşum mekanizmasını belirlemek için, plaka üzerinde bir görüntüleme alanını temsil eden tek bir görüntü yığını ile başlar. İlk çerçeve, hücreler yüzen olacaktır. Birinci epitel hücre plaka yapışır belirlemek için seri görüntü izleyin. Bu aşamada, epitel hücreleri tespit edilebilir ve bunların daha cuboidal morfolojisi ile fibroblastlar ayırt. Seri görüntüler aracılığıyla bu tek katlı epitel hücre izleyin ve sonraki 24 saat boyunca kendi kaderine izleyin. Bu ek epitel hücreleri tarafından çevrili olur veya hücre bölünmesi veya apoptoz görmesi durumunda kaydedin. Epitel hücreleri ile çevrili ise çevreleyen hücreleri daha sonra, ilk yapışık hücre (ler) i ya da toplayabilir yüzen hücrelerde elde edilir ise, koloni oluşumu mekanizmasını görüntüleyerek direkt olarak tespit edilebilirİlk yapışık hücre bölünmesi gelen. İlk 24 saat boyunca hücre agregasyonu karşı hücre bölünmesi ile oluşturulan kolonilerin sayısını kaydedin. </li><li> Belirli bir süre içinde apoptoza başlangıçta yapışık hücre sayısını belirlemek için, yapışık olan bir hücrede gelişen apoptozisin klasik özelliklerin görülmesi için seri görüntüleri izleyin ( <a href="http://www.alsa.org/research/about-als-research/cell-death-and-apoptosis.html" target="_blank">http://www.alsa.org/research/about -als-research/cell-death-and-apoptosis.html</a> ) ve görüntüleme tüm süresi boyunca ya da belirli süreler dahilinde belirlenen apoptotik hücre sayısı kaydedildi. </li><li> Zamanla, kültür epitel hücreleri EMT ile tutarlı daha ince uzun bir görünüm için bir ilk kübik şekle morfoloji değiştirebilir. Bu oluştuğunda Kaplama sonrası gün / saat belirlemek için seri görüntüleri izleyin. </li></ol> 5. Görüntü Dosyası Modifikasyon <ol><li&gt; Volocity yazılım sayesinde, TIFF yığınları görüntü dosyalarını ihraç. İşte MetaMorph Mikroskopi Otomasyon ve Görüntü Analiz Yazılımı (Molecular Devices, LLC Sunnyvale, CA) TIFF yığın dosyalarını açmak için kullanılan ve daha sonra tek. JPG görüntüleri olarak MetaMorph kaydedilen. </li><li> Timm en Takip Aracı yazılım gereksinimlerine göre görüntü klasörleri ve dosyaları yeniden adlandırın Rename 2.1.6 (gibi ücretsiz bir program kullanın <a href="http://www.softpedia.com/get/System/File-Management/THE-Rename.shtml" target="_blank">http://www.softpedia.com/get/System/File-Management/THE-Rename.shtml</a> gruplar halinde dosyaları yeniden adlandırmak için). Deneyin tüm klasörleri ve dosyaları içeren bir klasör oluşturun ve (örneğin, klasör adını </em&gt; EXPERIMENTNAME). </li><li> Kültür görüntülendi her noktası / pozisyon için bir alt klasör oluşturun. Alt Ad: EXPERIMENTNAME_pPOSITIONNUMBER. Pozisyon numarası 3 haneli olmalıdır. Örnek: 072511RN_p001. Alt bireysel konumunun tüm görüntü dosyalarını koyun. </li><li> Timepoint (5 basamak kullanarak) ve bu biçimde her dosya adının sonunda kanal numarasını (tek bir parlak alan kanal olmadığı için, &quot;0&quot; kullanın) ekleyin: EXPERIMENTNAME_pPOSITIONNUMBER_tTIMEPOINT_wCHANNELNUMBER.jpgExample: 072511RN_p001_t00001_w0.jpg </li><li> İlk TTT web sitesinden ücretsiz program TTTlogfileconverter indirerek her pozisyon için bir günlük dosyası oluşturur. TTTlogfileconverter programını başlatın ve deney klasörü seçin. Girdi bir görüntü aralığını (saniye olarak). Her 15 dakikada çekilen bir resmi için 900 sn girin. Sonra yeşil örtülü log dosyaları düğmesine basın. </li></ol> 6. TTT Kullanarak Tek Hücre Hücre Kader Harita Üretimi <ol><li> CTTTexport adında bir klasör REATE ve tüm hücre izleme verileri TTT yazılım talimatları izleyerek saklanacağı bir alt TTTfiles denir </li><li> TTT programını başlatın, kullanıcı harfleri seçin ve tıklayın &quot;Devam.&quot; </li><li> Basın &quot;Set NAS,&quot; &quot;TTTexport&quot; klasörü oluşturulur kullanıcıyı seçin ve Tamam &#39;ı tıklatın. Tarayıcıda tuşuna basın &quot;Load konumu&quot; düğmesi, bir deney klasörü seçin bir pozisyon klasörü seçin ve. </li><li> Için oküler faktörü belirle &quot;10x.&quot; Gerekli görüntü sayısını yükleyin (tüm görüntüleri yükleme ilk kez tavsiye edilir). </li><li> Hücre editörü penceresinde, Dosya menüsü altındaki &quot;Yeni koloni&quot; seçeneğini seçin. Film penceresinde, bir hücre izlemeye başlamak için &quot;Parça hücre&quot; veya F2 tuşuna basın. </li><li> M bir hücrenin belirlenmesiOvie penceresi ve hücre üzerine imleci yerleştirmek için kullanmak fare. F2 tıklandığında sonra hücre sayısı ile bir daire görünür. Sonraki resme hücre ve avans yerleşim izlemek için Klavyenin numara pad üzerinde &quot;0&quot; tuşunu kullanın. Her çerçeve ile her hücrenin yerleştirme takip götür. Bir parçayı silmek ve sayı pad üzerinde önceki görüntü basın &quot;Del&quot; geri dönmek için. &quot;, 3&quot; hücre basın izleme olmadan ileriye kareleri hareket etmek ve numara pad basın &quot;1&quot; izleme olmadan geri gitmek için. </li><li> Bir hücre bölünmesi Film penceresinde &quot;Bölüm&quot; butonuna tıklayın işaretlemek için. Hücre ölümü münasebetiyle Film penceresinde &quot;Hücre ölümü&quot; düğmesini tıklatın. Bir bölünme oluştu sonra, kızı Hücreleri sağa otomatik modunda izlemeye başlamak için Hücre editör penceresinde belirlenen yavru hücre çemberi sembolü tıklayarak aynı hücre kaderinin harita izlenebilir. </li><li> Ağaç kaydetmek için F10 tuşuna basın. Her ağaç belirlenen çıkış kat kaydederer (TTTExport). Yeni bir hücre kaderinin haritası başlatmak için, Hücre editör penceresinde &quot;Dosya&quot; ardından &quot;Aç&quot; menüsü altındaki &quot;Yeni koloni&quot; seçeneğini seçin. </li><li> Hücre düzenleyicisi penceresinde &quot;Hücre veri&quot; sekmesinden toplama sonra hücrenin ömür veri sıralayınız. </li></ol> 7. İstatistiksel Analizler <ol><li> Ya Student t-testi kullan (iki genotipi karşılaştırarak) veya ANOVA belirlemek için (&gt; iki genotipi karşılaştırarak varsa) gibi başlangıç ​​hücre kolonileri, hücre yaşam veya saat numaraları gibi parametrik veriler farklılıklar farklı genotipleri arasındaki EMT görünümünü istatistiksel kadar ise önemli. Apoptotik frekans numarası / Student t-testi ve ANOVA kullanılarak toplam sayısı kaplamalı hücreler veya yapışık hücrelerin yüzdesi olarak türetilmiş Mann-Whitney veya Kruskal-Wallis ile mukayese edilebilir. </li><li> Gerek deneysel çoğaltır kaç belirlemek için ilk deneyleri analiz verileri kullanarak güç testleri gerçekleştirin yeterli s için yapılan ve hücre kaderinin haritalar her çoğaltmak eldemevcut ücretsiz kullanarak tatistical güç (örn. <a href="http://statpages.org/" target="_blank">http://statpages.org/</a> ). Burada sunulan deneylerde, genotip başına üç fareler türetilmiş hücre kültürlerinde spesifik genetik değişiklikler yapılmış iken hücre koloni oluşumu ve hücre yaşamlarda istatistiksel olarak anlamlı farklılık olup olmadığını belirlemek için yeterli idi. </li></ol>

<ol><li>Jones, L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+estrogen+signaling+pathways+collaborates+with+loss+of+Brca1+to+promote+development+of+ERalpha-negative+and+ERalpha-positive+mammary+preneoplasia+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Activation of estrogen signaling pathways collaborates with loss of Brca1 to promote development of ERalpha-negative and ERalpha-positive mammary preneoplasia and cancer.</a> Oncogene. 27, 794-802 (2008).</li>
<li>Burga, L. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+proliferation+and+differentiation+properties+of+primary+mammary+epithelial+cells+from+BRCA1+mutation+carriers%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Altered proliferation and differentiation properties of primary mammary epithelial cells from BRCA1 mutation carriers.</a> Cancer Res. 69, 1273-1278 (2009).</li>
<li>Li, M., Wagner, K., Furth, P. A. Preparation of primary mammary epithelial cells and transfection by viral and nonviral methods. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLi%2C+M+%22Methods+in+Mammary+Gland+Biology+and+Breast+Cancer%22">Methods in Mammary Gland Biology and Breast Cancer</a>. Ip, M., Asch, B. , Kluwer Academic, Plenum Press. (2000).</li>
<li>Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+stem-cell-driven+regeneration+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Imaging stem-cell-driven regeneration in mammals.</a> Nature. 453, 345-351 (2008).</li>
<li>Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+single-cell+imaging+of+mammalian+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Long-term single-cell imaging of mammalian stem cells.</a> Nature Methods. 8, S30-S35 (2011).</li>
<li>Eilken, H. M., Nishikawa, S. -I., Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+single-cell+imaging+of+blood+generation+from+haemogenic+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Continuous single-cell imaging of blood generation from haemogenic endothelium.</a> Nature. 457, 896-900 (2009).</li>
<li>Kokkaliaris, K. D., Loeffler, D., Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+tracking+hematopoiesis+at+the+single-cell+level%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+hematology%22%5BJournal%5D)">Advances in tracking hematopoiesis at the single-cell level.</a> Current opinion in hematology. , (2012).</li>
<li>Rieger, M. A., Hoppe, P. S., Smejkal, B. M., Eitelhuber, A. C., Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+cytokines+can+instruct+lineage+choice%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic cytokines can instruct lineage choice.</a> Science. 325, 217-218 (2009).</li>
<li>Rieger, M. A., Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Instruction+of+lineage+choice+by+hematopoietic+cytokines%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Instruction of lineage choice by hematopoietic cytokines.</a> Cell Cycle. 8, 4019-4020 (2009).</li>
<li>Heinrich, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+subtype-specific+neurons+from+postnatal+astroglia+of+the+mouse+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generation of subtype-specific neurons from postnatal astroglia of the mouse cerebral cortex.</a> Nat. Protoc. 6, 214-228 (2011).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.

Kritik adımlar Bu meme bezlerinin meme epitel hücre davranışlarını yaşa bağlı değişkenlik kontrol etmek için aynı yaştaki farelerin hasat sağlamak için önemlidir. Hücreler kaplama, hücreler aynı sayıda her bir deney için her bir kuyuya kaplanacaktır. Kültürler mümkün seri görüntüleri aracılığıyla birden çok tek tek hücrelerin takip yapma çok hızlı konfluent olmazlar böylece kaplama yaparken Hücreleri nispeten seyrek olmalıdır. Bu plaka dengelenmiş sonra odağı değiştirmek çünkü plaka görüntüleme...

Genetik mühendisliği fare modelleri incelemek ve farklı genetik lezyonlar meme kanseri riskine katkıda anlamak için kullanılan araçlardır. Örneğin, genetiğiyle oynanmış farelerin göstermiştir ki, üç faktörün kombinasyonu: tam uzunlukta meme kanseri 1, erken başlangıçlı (BRCA1) meme epitel hücrelerinde gen, tümör protein p53 (TP53) germ-line haploinsufficiency ve epitel meme kaybı hücre hedefli up-regüle östrojen reseptör alfa, BRCA1 floxed (f) 11/f11/Mouse Meme Tümör Virüsü (MMTV) -Cre/p53 + / -/tetracycline-operator (% 100 oranında meme kanseri gelişiminde (ERA) ifadesi sonuçları tet-op) -ER/MMTV-reverse tetrasiklin Transaktivatörü (BRCA1 f11/f11/MMTV-Cre/p53 bildirilen düşük yüzdeler + / karşılaştırıldığında yaş 12 ay rtTA farelerde - ERA olmadan fareler aşırı ekspresyonu (~ 50 - % 60) ve TP53 haploinsuf olmadan BRCA1 f11/f11/MMTV-Cre farelerdeficiency (&lt;% 5). 1 Preneoplastic birincil meme epitel hücrelerinin davranış Dinamik time-lapse görüntüleme az kolayca statik doku kesitlerinde takdir hücre davranış farklılıkları ortaya koymaktadır. Proliferasyon ve farklılaşma değişiklikler insan BRCA1 mutasyon taşıyıcılarında primer meme hücrelerinde görülmektedir. Tek hücre normalden birincil meme epitel hücrelerinin süspansiyonlar ve genetiğiyle oynanmış farelerin 2 Yaratılış Rezeke meme bezi dokusu enzimatik ayrışma yoluyla üretilir. 3. Time-lapse görüntüleri hücre kolonisi görünümü ve epitelyal-mezenkimal geçiş (EMT) ve apoptoz gibi hücrelerinde morfolojik değişikliklerin insidansı mekanizmasını ve zamanlamasını değerlendirmek için görüntülenebilir. Hücre kaderinin harita üretimi, hücre bölünmeleri (hücre yaşam) ve hücre bölünmesi kalıplarının belirlenmesi arasındaki sürenin uzunluğu ölçümü tek hücreli izleme kullanımı ile kolaylaştırılmaktadır. Timm&#39;S Takip Aracı (TTT) tek hücre kaderinin haritaları oluşturmak için kullanılan kamuya açık yazılım. Hücre kaderinin mekanizmalarının aydınlatılmasına Onun programı normal hematopoetik kök hücre gelişimi 6-9 ve nöronların nesil inceleyerek 4,5 kurulmuştur. 10.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog Numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> EpiCult-B Bazal Orta Fare </td><td> StemCell Teknolojileri </td><td> 05610 </td><td></td></tr><tr><td> EpiCult-B Yayılmasının Önlenmesi Takviyeler Fare </td><td> StemCell Teknolojileri </td><td> 05612 </td><td></td></tr><tr><td> rekombinant insan Epidermal Büyüme Faktörü (rhEGF) </td><td> StemCell Teknolojileri </td><td> 02633 </td><td></td></tr><tr><td> Kollajenaz / Hyaluronidaz </td><td> StemCell Teknolojileri </td><td> 07912 </td><td></td></tr><tr><td> Tek Scapels </td><td> Tüy </td><td> 2975 # 10 </td><td></td></tr><tr><td> Hanks Dengelenmiş Tuz Çözeltisi </td><td> StemCell Teknolojileri </td><td> 37150 </td><td></td></tr><tr><td> Ammonium Klorür </td><td> StemCell Teknolojileri </td><td> 07800 </td><td></td></tr><tr><td> Tryspin-EDTA </td><td> StemCell Teknolojileri </td><td> 07901 </td><td></td></tr><tr><td> Dispase </td><td> StemCell Teknolojileri </td><td> 07913 </td><td></td></tr><tr><td> DNaz I </td><td> StemCell Teknolojileri </td><td> 07900 </td><td></td></tr><tr><td> 40 mikron hücre süzgecinden </td><td> StemCell Teknolojileri </td><td> 27305 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> StemCell Teknolojileri </td><td> 06100 </td><td></td></tr><tr><td> PenStrep </td><td> Gibco </td><td> 15140 </td><td></td></tr></tbody></table>

birincil preneoplastic meme epitel hücrelerinin time-lapse görüntüleme meme kanseri genetik fare modelleri türetilen

Time-lapse Imaging of Primary Preneoplastic Mammary Epithelial Cells Derived from Genetically Engineered Mouse Models of Breast Cancer

Zaman aralıklı görüntüleme meme kanseri farklı genetik olarak fare modelleri elde edilen kültür birincil preneoplastic meme epitelyal hücrelerinin davranışını karşılaştırmak için kullanılabilir. Örneğin, hücre bölünmeleri (hücre yaşam), apoptotik hücre sayıları, morfolojik değişiklikler evrimi ve koloni oluşum mekanizması arasındaki zaman ölçülebilir ve belirli genetik lezyonlar taşıyan hücreler karşılaştırıldı. Primer meme epitel hücre kültürlerinde palpabl tümör olmadan meme bezleri tarafından üretilir. Bezler dikkatlice bitişik kas açık bir ayrım ile eksize edilir, lenf düğümleri kaldırılır ve zenginleştirilmiş meme epitelyal hücrelerinin tek hücre süspansiyonları enzimatik çözünme ve süzme, ardından kıyma meme dokusu tarafından oluşturulur. Tek hücre süspansiyonları canlı hücre görüntüleme için bir inkübatör içinde kaplama ve mikroskop altında doğrudan yerleştirilir. Her w bir 4x4 konfigürasyonunda Onaltı 650 mikron x 700 mikron alanları6-kuyulu plakanın arşın 5 gün için her 15 dakikada görüntülü. Time-lapse görüntüleri doğrudan ilk 24 hücreleri kaplama ve sa (agregasyon karşı hücre çoğalması), apoptoz insidansı ve morfolojik değişikliklerin aşamalı içinde hücre koloni oluşum mekanizması ve frekans içerebilir hücresel davranışları ölçmek için incelenmiştir. Tek hücreli izleme bireysel hücre yaşam ve hücre bölünmesi desen soruşturma ölçümü için hücre kaderinin haritaları oluşturmak için kullanılır. Nicel veriler istatistiksel olarak belirli genetik lezyonlar ile ilişkili davranış önemli farklılıklar için değerlendirmek için analiz edilir.

Epitel ve fibroblast hücreleri hücre morfolojisi ile ayırt edilebilir. Epitel hücreleri kübik şekil (Şekil 1A-B) ve form hücre kolonileri (Şekil 1A) var. Fibroblastlar, stromal hücre türü olan bir ince uzun morfoloji (Şekil 1C) sahiptir. Hücreler yuvarlak ve görüntüleme başlangıçlı (Şekil 2A-D) yüzen edildi. Plakasına eki sonra onlar düz oldu ve kübik tipi görünümü (Şekil 2E, H) göstermiştir. Kültür 4 gün ol...

Time-lapse görüntüleme özgü davranışsal parametreler ve farklı genetik lezyonlar arasında bir korelasyon olup olmadığını belirlemek için meme kanseri riskinin genetik fare modelleri türetilmiştir birincil preneoplastic meme epitel hücrelerinin davranışlarını değerlendirmek için kullanılır.

Birincil Preneoplastic Meme Epitel Hücrelerinin Time-lapse görüntüleme Meme Kanseri Genetik Fare Modelleri türetilen

Time-lapse  imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic  mammary epithelial cells derived from different genetically ...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, meme kanserine yatkın genetik lezyonların primer kültürdeki epifiz plastik hafıza hücrelerinin davranışını değiştirip değiştirmediğini belirlemektir. Bu, genetik olarak tasarlanmış farelerden birincil meme epitel hücrelerinin izole edilmesiyle elde edilir. İkinci adım olarak, canlı hücre hızlandırılmış görüntüleme beş ila yedi gün boyunca gerçekleştirilir ve hücre davranışını analiz etmek için bir film oluşturulur.Daha sonra, meme kanserinin genetik olarak tasarlanmış farklı fare modellerinden izole edilen hücrelerin davranışlarını ölçmek ve karşılaştırmak için tek hücreleri izleyen bir yazılım programı kullanılır. Sonuçlar, spesifik genetik lezyonların preneoplastik bellekte farklı davranışlara neden olduğunu göstermektedir. Tek hücre takibi kullanılarak gerçekleştirilen kantitatif davranışsal analizlere dayalı epitel hücreleri.Bu yöntem, farklı genetik lezyonların preneoplastik meme meme epitel hücrelerinin davranışını nasıl değiştirdiğine dair fikir verebilir. Preneoplastik, diğer organlardan gelen hücreler, herhangi bir organdan gelen kanser hücreleri gibi diğer sistemlere de uygulanabilir, olası tedaviye bağlı davranış değişikliklerinin incelenme

time-lapse-imaging-primary-preneoplastic-mammary-epithelial-cells

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Kaynak:Marina Arantes Radicchi1, Victor Carlos Mello1,Victória Paz Machado1, Márcia Cristina Oliveira da Rocha1, Jaqueline Vaz de Oliveira1, Luana Cristina Camargo1,2, Luís Alexandre Muehlmann1, Ricardo Bentes Azevedo1, Sônia Nair Bao1, João Paulo Figueiró Longo11Biyolojik Bilimler Enstitüsü, Brasília Üniversitesi, 2Temel Psikolojik Süreçler Bölümü, Psikoloji Enstitüsü, Brasília ÜniversitesiBu video, lusiferaz eksprese eden meme adenokarsinom hücrelerini dişi bir fareye enjekte ederek ve zaman...

Dişi Fare Modelinde Meme Tümörü İlerlemesinin Biyolüminesans Görüntülemesi

Bu anti-kanser tedavisi için, görüntüleme yanıt için bir yöntem...

Meme Kanseri Fare Modelleri Tümör Mikroçevre İlaç Yanıtlarının Görüntüleme Canlı

Klinik açıdan uygun bir metastatik meme kanseri duktal meme sistemi sonuçları içine adenovirüs-Cre ile gizli mutasyonlar aktivasyonu. YFP bir promoter dahil edilmesi uzak metastatik tümör hücrelerinin izleme sağlar. Bu model, latent metastazı, anti-tümör bağışıklık ve meme kanseri tedavisi için yeni immünoterapiler tasarımı için incelemek için yararlı olan.

Meme Kanseri Bir Roman Transgenik Fare Modeli: Adenovirüs-Kretasedekine ile epiteli Hedefleme ile Metastatik Meme Kanseri Başlatma

Sağlam doku organoids kullanılarak primer hücre kültürü çok hücresel in vivo mikroortam taklit eden bir model sistemi sağlar. Biz enzimatik doku hasarı olmadan, morfoloji farklılaşmış karışık hücre kültürü soyları ve sergiler yaşatan bir serum serbest birincil meme epitel doku kültürü modeli geliştirmiştir. Meme organoids&gt; 6 ay için geçerli kalır.

Enzimatik olmayan, Mammospheres spontan Üretimi için Ön-invaziv Meme Lezyonların Serum serbest Doku Kültürü

Ortotopik meme kanseri primer tümör modeli ve primer tümörün cerrahi olarak çıkarılması açıklanan spontan metastaz oluşturmak için fare ömrünü uzatmak için. tümör büyümesi ve ilerlemesi izlenir ve lusiferaz floresan görüntüleme ile ölçülür.

Spontan Meme Kanseri metastaz Ortotopik Fare Modeli

Bu protokol amacı yeni bir meme kanseri modelleme yaklaşımı CRE-ifade adenovirüsü fare meme bezleri içine intraduktal enjeksiyon dayalı açıklamak için. Bu yaklaşım, Onkojenik olayların hem hücre tipi hem de Organ spesifik manipülasyon geçici olarak kontrollü bir şekilde sağlar.

CRE-ifade Adenovirus fare mammary bezi içine bir Intraductal enjeksiyon yoluyla meme kanseri modelleme

Bu çalışma, yeşil floresan protein ve biyolüminesans sinyallerinin yanı sıra kantitatif moleküler algılama tekniğinin entegrasyonu ile tümör yüklemesini doğru bir şekilde değerlendirmek için gelişmiş bir protokol hazırlaştır.

Ortotopik Meme Kanseri Modeli Kullanarak Üçlü Negatif Meme Kanseri Eğitimi

Bu protokol, değiştirilebilir kapaklı (R.MIW) yeni bir meme görüntüleme penceresini tanımlar. R.MIW'nin implantasyonundan sonra intravital mikroskopi, farklı gelişim aşamalarında sağlıklı ve hastalıklı meme bezinin hücresel çözünürlükle uzunlamasına ve çok günlük görüntülenmesini sağlar.

Değiştirilebilir Kapaklı Meme Görüntüleme Penceresi Kullanarak Boyuna İntravital Mikroskopi

Burada tarif edilen intravital görüntüleme yöntemi, 4D intravital görüntülerin derinlemesine analizi için etiketlenmemiş bir tümör mikroçevresini tümör, stromal ve vasküler kompartmanlara invaziv olmayan bir şekilde segmentlere ayırmak için metabolik ko-faktör NAD (P) H'den kollajen ikinci harmonik jenerasyonu ve endojen floresanı kullanır.

Meme Tümörü Mikroçevresinin İntravital Görüntülemesi için Etiketsiz Bir Segmentasyon Yaklaşımı

Mevcut protokol, lazer taramalı konfokal ve multifoton mikroskobu ile emziren fare meme bezinin intravital görüntülenmesi için kolay bir tekniği tanımlamaktadır.

Meme bezinin intravital hücre altı mikroskobu

El yazması, ortotopik olarak enjekte edilen meme tümörlerinden spontan akciğer metastazının kurulması ve uzunlamasına büyüme izlemesi için metastatik kaskadının tüm aşamalarında müdahaleye uygun bir metodolojiyi açıklamaktadır.

In vivo (İn canlı) Ortotopik Olarak Enjekte Edilen Meme Tümörü Hücrelerinin Spontan Akciğer Metastazını Ölçmek için Görüntüleme

Öğrenin meme kanserinde genetik lezyonların preneoplastik meme epitel hücrelerinin davranışlarını nasıl değiştirdiğini. Genetik olarak modifiye edilmiş fare modellerinden hücre izolasyonu ve tek hücre takibi kullanılarak zamana bağlı görüntüleme yapılır.

Birincil Preneoplastic Meme Epitel Hücrelerinin Time-lapse görüntüleme Meme Kanseri Genetik Fare Modelleri türetilen

Daha fazla video keşfet