Name: Na, K ve H, K-ATPaz bölgesindeki tarafından Katyon Taşıma Ölçüm Xenopus Oosit: Radyoizotop Tahliller Alternatif Bir (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-19T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 48 s
Description: Keşfedin P-tipi ATPaz aktivitesini ölçme yöntemini Xenopus oositleri kullanarak atomik absorpsiyon spektrofotometrisi ile. Bu güvenli teknik, radyoizotop deneylerine alternatif olarak iyon taşıma kinetiğini hassas şekilde analiz eder.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Yazarlar, yöntem geliştirmenin ilk aşamasındaki cömert destekleri için Ernst Bamberg'e (Max-Planck-Biyofizik Enstitüsü, Frankfurt, Almanya), çok sayıda verimli tartışma için Kazuhiro Abe'ye (Kyoto Üniversitesi, Japonya) ve teknik destek için Dr. Michael Kohl'a (Analytik-Service, Woltersdorf, Almanya) teşekkür eder. Yazarlar, Perkin Elmer AAnalyst 800 cihazını (SFB 498) da finanse eden Alman Araştırma Vakfı DFG (Mükemmeliyet Kümesi "Katalizde Kavramları Birleştirici") tarafından sağlanan finansmanı minnetle kabul ederler.

<ol><li>Tavraz, N. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+plasma+membrane+targeting+or+protein+stability+by+certain+ATP1A2+mutations+identified+in+sporadic+or+familial+hemiplegic+migraine%5BTitle%5D)+AND+%22Channels+%28Austin%29%22%5BJournal%5D)">Impaired plasma membrane targeting or protein stability by certain ATP1A2 mutations identified in sporadic or familial hemiplegic migraine.</a> Channels (Austin). 3, 82-87 (2009).</li>
<li>Castillo, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Energy+landscape+of+the+reactions+governing+the+Na%2B+deeply+occluded+state+of+the+Na%2B%2FK%2B-ATPase+in+the+giant+axon+of+the+Humboldt+squid%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Energy landscape of the reactions governing the Na+ deeply occluded state of the Na+/K+-ATPase in the giant axon of the Humboldt squid.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 20556-20561 (2011).</li>
<li>Friedrich, T., Bamberg, E., Nagel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Na%2B%2CK%2B-ATPase+pump+currents+in+giant+excised+patches+activated+by+an+ATP+concentration+jump%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Na+,K+-ATPase pump currents in giant excised patches activated by an ATP concentration jump.</a> Biophys J. 71, 2486-2500 (1996).</li>
<li>Dürr, K. L., Tavraz, N. N., Dempski, R. E., Bamberg, E., Friedrich, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+significance+of+E2+state+stabilization+by+specific+alpha%2Fbeta-subunit+interactions+of+Na%2CK-+and++H%2CK-ATPase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Functional significance of E2 state stabilization by specific alpha/beta-subunit interactions of Na,K- and H,K-ATPase.</a> J. Biol. Chem. 284, 3842-3854 (2009).</li>
<li>Dürr, K. L., Abe, K., Tavraz, N. N., Friedrich, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((E2P+state+stabilization+by+the+N-terminal+tail+of+the+H%2CK-ATPase+beta-subunit+is+critical+for+efficient+proton+pumping+under+in+vivo+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">E2P state stabilization by the N-terminal tail of the H,K-ATPase beta-subunit is critical for efficient proton pumping under in vivo conditions.</a> J. Biol. Chem. 284, 20147-20154 (2009).</li>
<li>Durr, K. L., Tavraz, N. N., Zimmermann, D., Bamberg, E., Friedrich, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Na%2CK-ATPase+and+H%2CK-ATPase+enzymes+with+glycosylation-deficient+beta-subunit+variants+by+voltage-clamp+fluorometry+in+Xenopus+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Characterization of Na,K-ATPase and H,K-ATPase enzymes with glycosylation-deficient beta-subunit variants by voltage-clamp fluorometry in Xenopus oocytes.</a> Biochemistry. 47, 4288-4297 (2008).</li>
<li>Dürr, K. L., Tavraz, N. N., Friedrich, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+gastric+H%2CK-ATPase+activity+by+cations%2C+voltage+and+intracellular+pH+analyzed+by+voltage+clamp+fluorometry+in+Xenopus+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Control of gastric H,K-ATPase activity by cations, voltage and intracellular pH analyzed by voltage clamp fluorometry in Xenopus oocytes.</a> PLoS One. 7, e33645(2012).</li>
<li>Tavraz, N. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+functional+consequences+of+mutations+in+the+Na%2B%2FK%2B-ATPase+alpha2-subunit+causing+familial+hemiplegic+migraine+type+2%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Diverse functional consequences of mutations in the Na+/K+-ATPase alpha2-subunit causing familial hemiplegic migraine type 2.</a> J. Biol. Chem. 283, 31097-31106 (2008).</li>
<li>Lorenz, C., Pusch, M., Jentsch, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heteromultimeric+CLC+chloride+channels+with+novel+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Heteromultimeric CLC chloride channels with novel properties.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 13362-13366 (1996).</li>
<li>Koenderink, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Na%2CK-ATPase+mutations+in+familial+hemiplegic+migraine+lead+to+functional+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Na,K-ATPase mutations in familial hemiplegic migraine lead to functional inactivation.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1669, 61-68 (2005).</li>
<li>Price, E. M. J., Lingrel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-function+relationships+in+the+Na%2CK-ATPase+alpha+subunit%3A+site-directed+mutagenesis+of+glutamine-111+to+arginine+and+asparagine-122+to+aspartic+acid+generates+a+ouabain-resistant+enzyme%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Structure-function relationships in the Na,K-ATPase alpha subunit: site-directed mutagenesis of glutamine-111 to arginine and asparagine-122 to aspartic acid generates a ouabain-resistant enzyme.</a> Biochemistry. 27, 8400-8408 (1988).</li>
<li>Richards, R., Dempski, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Examining+the+conformational+dynamics+of+membrane+proteins+in+situ+with+site-directed+fluorescence+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Examining the conformational dynamics of membrane proteins in situ with site-directed fluorescence labeling.</a> J. Vis. Exp. (2627), e2627(2011).</li>
<li>Lafaire, A. V., Schwarz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage+dependence+of+the+rheogenic+Na%2B%2FK%2B+ATPase+in+the+membrane+of+oocytes+of+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Membr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Voltage dependence of the rheogenic Na+/K+ ATPase in the membrane of oocytes of Xenopus laevis.</a> J. Membr. Biol. 91, 43-51 (1986).</li>
<li>Morth, J. P., Pedersen, B. P., Toustrup-Jensen, M. S., Sorensen, T. L., Petersen, J., Andersen, J. P., Vilsen, B., Nissen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+sodium-potassium+pump%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the sodium-potassium pump.</a> Nature. 450, 1043-1049 (2007).</li>
<li>Toustrup-Jensen, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+C+terminus+of+Na%2B%2CK%2B-ATPase+controls+Na%2B+affinity+on+both+sides+of+the+membrane+through+Arg935%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The C terminus of Na+,K+-ATPase controls Na+ affinity on both sides of the membrane through Arg935.</a> J. Biol. Chem. 284, 18715-18725 (2009).</li>
<li>Morth, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+the+Na%2B%2CK%2B-ATPase+and+mapping+of+isoform+differences+and+disease-related+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Philos.+Trans.+R.+Soc.+Lond.+B.+Biol.+Sci%22%5BJournal%5D)">The structure of the Na+,K+-ATPase and mapping of isoform differences and disease-related mutations.</a> Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 364, 217-227 (2009).</li>
<li>Yaragatupalli, S., Olivera, J. F., Gatto, C., Artigas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+Na%2B+transport+after+an+intracellular+alpha-subunit+deletion+reveals+strict+external+sequential+release+of+Na%2B+from+the+Na%2FK+pump%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Altered Na+ transport after an intracellular alpha-subunit deletion reveals strict external sequential release of Na+ from the Na/K pump.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 15507-15512 (2009).</li>
<li>Meier, S., Tavraz, N. N., Durr, K. L., Friedrich, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperpolarization-activated+inward+leakage+currents+caused+by+deletion+or+mutation+of+carboxy-terminal+tyrosines+of+the+Na%2B%2FK%2B-ATPase+%7Balpha%7D+subunit%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Hyperpolarization-activated inward leakage currents caused by deletion or mutation of carboxy-terminal tyrosines of the Na+/K+-ATPase {alpha} subunit.</a> J. Gen. Physiol. 135, 115-134 (2010).</li>
<li>Vedovato, N., Gadsby, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+two+C-terminal+tyrosines+stabilize+occluded+Na%2FK+pump+conformations+containing+Na+or+K+ions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Physiol%22%5BJournal%5D)">The two C-terminal tyrosines stabilize occluded Na/K pump conformations containing Na or K ions.</a> J. Gen. Physiol. 136, 63-82 (2010).</li>
<li>Chakavarti, B., Chakavarti, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+separation+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic separation of proteins.</a> J. Vis. Exp. (16), e758(2008).</li>
<li>Kamsteeg, E. J., Deen, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Importance+of+aquaporin-2+expression+levels+in+genotype+-phenotype+studies+in+nephrogenic+diabetes+insipidus%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Renal+Physiol%22%5BJournal%5D)">Importance of aquaporin-2 expression levels in genotype -phenotype studies in nephrogenic diabetes insipidus.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 279, 778-784 (2000).</li>
<li>Koenderink, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+analysis+of+the+mutated+Na%2CK-ATPase+cation+binding+pocket%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological analysis of the mutated Na,K-ATPase cation binding pocket.</a> J. Biol. Chem. 278, 51213-51222 (2003).</li>
<li>Gottardi, C. J., Caplan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+requirements+for+the+cell-surface+expression+of+multisubunit+ion-transporting+ATPases.+Identification+of+protein+domains+that+participate+in+Na%2CK-ATPase+and+H%2CK-ATPase+subunit+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Molecular requirements for the cell-surface expression of multisubunit ion-transporting ATPases. Identification of protein domains that participate in Na,K-ATPase and H,K-ATPase subunit assembly.</a> J. Biol. Chem. 268, 14342-14347 (1993).</li>
<li>Mathews, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+structure+and+functional+expression+of+the+mouse+and+frog+alpha-subunit+of+the+gastric+H%2B-K%2B-ATPase%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Primary structure and functional expression of the mouse and frog alpha-subunit of the gastric H+-K+-ATPase.</a> Am. J. Physiol. 268, 1207-1214 (1995).</li>
<li>Horisberger, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+H%2CK-ATPase+beta-subunit+can+act+as+a+surrogate+for+the+beta-subunit+of+Na%2CK-pumps%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The H,K-ATPase beta-subunit can act as a surrogate for the beta-subunit of Na,K-pumps.</a> J. Biol. Chem. 266, 19131-19134 (1991).</li>
<li>Guennoun-Lehmann, S., Fonseca, J. E., Horisberger, J. D., Rakowski, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Palytoxin+acts+on+Na%2B%2CK%2B-ATPase+but+not+nongastric+H%2B%2CK%2B-ATPase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Membr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Palytoxin acts on Na+,K+-ATPase but not nongastric H+,K+-ATPase.</a> J. Membr. Biol. 216, 107-116 (2007).</li>
<li>Horisberger, J. D., Guennoun, S., Burnay, M., Geering, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cation+stoichiometry+and+cation+pathway+in+the+Na%2CK-ATPase+and+nongastric+H%2CK-ATPase%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+N.Y.+Acad.+Sci.%22%5BJournal%5D)">Cation stoichiometry and cation pathway in the Na,K-ATPase and nongastric H,K-ATPase.</a> Ann. N.Y. Acad. Sci.. 986, 127-132 (2003).</li>
</ol>

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Na +, K +- veya H +, K + -ATPaz eksprese eden bireysel Xenopus oositlerine alınan Rb + (veya Li + ) miktarını ölçmek için açıklanan yöntemin, katyona karşı taşınan P-tipi ATPazlar1,4,5,7,8 için taşımanın kinetik veya termodinamik parametrelerini belirlemek için çok yönlü, esnek ve doğru bir teknik olduğu kanıtlanmıştır. Radyoaktif izleyici akı analizlerine güvenli ve güvenilir bir alternatiftir ve oldukça kısa bir süre içinde çok çeşitl...

İzotop laboratuvarlarına erişim, güvenlik gereksinimleri veya - lityum örneğinde olduğu gibi - son derece kısa bozunma süreleri nedeniyle bile kullanılamayabilecek pahalı radyoizotopların kullanımı ile ilgili kısıtlamaları aşmak için iyon yer değiştiren zar proteinlerinin spesifik taşıma aktivitesini araştırmak için radyoaktif izleyici deneylerine hassas, güvenli ve ucuz bir alternatif geliştirmek istedik. Elektronötr olarak çalışan gastrik H +, K + -ATPaz'ın aktivitesini belirlemekle özellikle ilgilendik, çünkü enzim akım üretmez ve bu nedenle aktivitesi elektrofizyolojik yöntemlerle ele alınamaz. Na+, K + - ve H +, K + - ATPaz, Rb + 'yı K + (ve aynı zamanda Li + ) kadar verimli taşıdığından, AAS tekniğinin rubidyum veya lityum için yüksek hassasiyeti, taşıma aktivitesinin hassas tespitini kolaylaştırmalıdır. Atomik absorpsiyon spektrofotometreleri, kimya laboratuvarlarında yaygın olarak dağıtılan ve çok sayıda ilgili bilim insanı tarafından erişilebilir olması gereken yaygın analitik cihazlardır. Ayrıca, tek bir parti içinde protein ekspresyon seviyesi ile ilgili olarak oldukça düşük bir hücreden hücreye değişkenlik elde etmeye izin veren büyük tek hücreleri (yaklaşık 1.0-1.5 mm çapında) kullanan Xenopus oosit ekspresyon sisteminden yararlanmak istedik. Basit bir hesaplama, AAS testinin fizibilitesini gösterir: THGA-AAS tekniği ile rubidyum için tespit limiti (karakteristik kütle) 10 pg veya 1.2·10-13 mol'dür (Rb: 85.47 g/mol), lityum için 5.5 pg veya 7.9·10-13 mol (Li: 6.94 g/mol). Xenopus oositlerinde Na+,K+-ATPaz'ın heterolog ekspresyonu üzerine, 100 nA'lık pompa akımları elde edilebilir (bu, saniyede yaklaşık 6.2·1011 temel yüke veya 1.03·10-12 mol s-1'e eşittir), böylece 1 dakika içinde 6·10-6 C'lik bir yük taşınmasına neden olur. Bir net yükün taşınması, iki Rb+ iyonunun alımına karşılık geldiğinden (3Na+/2K+ stokiyometrisi nedeniyle), 1 dakika boyunca 100 nA akım, 1.2·10-10 mol Rb+'lık bir alıma karşılık gelir. Bu nedenle, 1.000 kat seyreltme (1 ml su içinde yaklaşık 1 μl hacimli bir oositin homojenizasyonu) durumunda bile, tipik bir THGA-AAS numunesi (20 μl) 2.4·10-12 mol Rb + (veya 204 pg) içerir, bu da tespit eşiğinin çok üzerindedir. Bu nedenle, 100 kattan daha düşük taşıma aktivitesine veya plazma zarı ekspresyonuna sahip taşıyıcılar bile, deneyin akı süresini uygun şekilde ayarlayarak teknikle test edilebilir.
Pompalama hızı hassas bir şekilde sıcaklığa bağlı olduğundan (Na+,K+-ATPaz için tipik aktivasyon enerjileri 90 kJ/mol ila 130 kJ/mol1-3 aralığındadır, bu da 20 °C'den 22 °C'ye bir değişiklik üzerine devir hızında yaklaşık %30'luk bir artışa neden olur), akı ölçümlerinin hassas sıcaklık kontrolü (klima) altında iyi dengelenmiş tampon çözeltileri ile yapılması zorunludur. Ayrıca, bir iyon taşıyıcının ifadesi için oositler homojen büyüklüklere göre dikkatli bir şekilde seçilmelidir. Bu önlemlerle, deney koşulu başına yaklaşık 10 hücre ile rutin olarak yüzde 10'dan daha az deneysel standart hatalar elde etmek mümkündür. Bu tekniği kullanarak, örneğin katyon transportu4-6'nın görünür Rb+ afinitelerini, hücre dışı ve hücre içi pH7'nin etkisini ve transport4,8 sırasında katyon koordinasyonunda yer alan kalıntıların mutasyonlarının etkisini belirleyebildik. Tekniğin bir avantajı, iyon akılarının, oositlerin iki elektrotlu voltaj kenetlenmesi ile kombinasyon halinde de belirlenebilmesidir, bu da bir yandan taşıma sırasında membran potansiyelinin doğru bir şekilde kontrol edilmesini sağlarken, diğer yandan iyon akısının membran akımı ile ilişkilendirilmesine izin verir. Böylece, Na+,K+-ATPaz'ın 3Na+/2K+ stokiyometrisini doğrulamak (aşağıdaki örnek sonuçlara bakınız) ve gastrik H+/K+-ATPaz7'nin katyon taşınmasının voltaj bağımlılığını belirlemek mümkün olmuştur.

<table><tbody><tr><td>4.0 Ethicon Vicryl sütür malzemesi</td><td>Johnson Johnson</td><td>V633H</td><td></td></tr><tr><td>Kollajenaz tip 1A, Clostridium hystolyticumSigma'dan</td> <td>Aldrich</td><td>C9891</td><td></td></tr><tr><td>Yüksek Saflıkta PCR Ürün Saflaştırma Kiti</td><td>Roche Uygulamalı Bilim</td><td>11732676001</td><td> </td></tr><tr><td>Nükleaz içermeyen su</td><td>Ambion</td><td>AM9937</td><td></td></tr><tr><td>mMessage mMachine Kit SP6/ T7</td><td>Ambion</td><td>1340, 1344</td><td></td></tr><tr><td>Ouabain oktahidrat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>O3125</td><td></td></tr><tr><td>Trikain (etil 3-aminobenzoat metansülfonat tuzu)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>Tavuk yumurtası akı</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T2011</td><td></td></tr><tr><td>SCH28080</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S4443</td><td></td></tr><tr><td>AAnalyst 800</td><td>Perkin Elmer</td><td>0993-5256</td><td></td></tr><tr><td>WinLab32TM</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biyofotometre</td><td>Eppendorf</td><td>6131 000.012</td><td></td></tr><tr><td>Borosilikat Kılcal Damarlar</td><td>Bilim Ürünleri</td><td>GB150F-8P</td><td></td></tr><tr><td>Hematokrit tüpleri 3.5 "</td><td>Drummond Scientific</td><td>3 000-203-G / X</td><td></td></tr><tr><td>İçi Boş Katot Lambası Lityum</td><td>Fotron</td><td>P929LL</td><td></td></tr><tr><td>İçi Boş Katot Lambası Rubidyum</td><td>Photron</td><td>P945</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipet Çektirme </td><td>Narishige</td><td>Modeli PC-10</td><td></td></tr><tr><td>Oosit Kayıt Odası RC-10</td><td>Warner Instr.</td><td>W4 64-0306</td><td></td></tr><tr><td>Nanoject II Enjeksiyon Pompası</td><td>Drummond Scientific</td><td>3-000-204</td><td></td></tr><tr><td>pCLAMP yazılımı</td><td>Moleküler Cihazlar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polipropilen Numune Kabı (1,2 ml)</td><td>Perkin Elmer</td><td>B0510397</td><td></td></tr><tr><td>Speedvac - Yoğunlaştırıcı modeli 5301</td><td>Eppendorf</td><td>5301 000.210</td><td> </td></tr><tr><td>THGA Tüp</td><td>Perkin Elmer</td><td>B3000641</td><td></td></tr><tr><td>Turbo TEC-10CX Amplifikatör</td><td>NPI Elektroniği</td><td>TEC-10CX</td><td></td></tr></tbody></table>

na, k ve h, k-atpaz bölgesindeki tarafından katyon taşıma Ölçüm<em&gt; xenopus</ematomik absorpsiyon spektrofotometresi ile&gt; oosit: radyoizotop tahliller alternatif bir

Measuring Cation Transport by Na,K- and H,K-ATPase in Xenopus Oocytes by Atomic Absorption Spectrophotometry: An Alternative to Radioisotope Assays

Elektrojenik membran taşıyıcı Na+,K+-ATPaz ile katyon taşınması elektrofizyoloji ile ölçülebilirken, elektronötral olarak çalışan gastrik H+,K+-ATPaz'ın araştırılması daha zordur. Birçok taşıma tahlili, yeterli bir sinyal-gürültü oranı elde etmek için radyoizotopları kullanır, ancak gerekli güvenlik önlemleri, insan maruziyeti veya tahlil tasarımı ile ilgili ciddi kısıtlamalar getirir. Ayrıca, hücre zarları boyunca iyon taşınması, hücre kültüründe veya proteolipozom preparatlarında doğrudan kontrol edilmeyen zar potansiyelinden kritik bir şekilde etkilenir. Burada, tek hücrelerde Na+,K+- veya gastrik H+,K+-ATPaz ile Rb+ veya Li+ taşınmasını ölçmek için atomik absorpsiyon spektrofotometrisinin (AAS) eser miktarda kimyasal elemente karşı olağanüstü hassasiyetinden yararlanıyoruz. Ekspresyon sistemi olarak Xenopus oositlerini kullanarak, bir otomatik örnekleyiciden yüklenen enine ısıtılmış bir grafit atomizer (THGA) fırını ile donatılmış bir AAS cihazında tek oosit homojenat örneklerini ölçerek hücrelere taşınan Rb+ (Li+) miktarını belirleriz. Kontrol oositlerine veya ATPaz'a özgü inhibitörlerin uygulanması sırasında spesifik olmayan Rb + alımının arka planı çok küçük olduğundan, aynı anda çok sayıda deneysel koşulu içeren karmaşık kinetik tahlil şemalarını uygulamak veya bölgeye özgü mutasyona uğramış taşıyıcıların taşıma kapasitesini ve kinetiğini yüksek hassasiyetle karşılaştırmak mümkündür. Ayrıca, katyon alımı tek hücrelerde belirlendiğinden, akı deneyleri, membran potansiyelinin ve akımının doğru kontrolünü sağlamak için iki elektrotlu voltaj kenetleme (TEVC) ile birlikte gerçekleştirilebilir. Bu, örneğin Na+,K+-ATPaz'ın 3Na+/2K+ taşıma stokiyometrisinin kantitatif olarak belirlenmesine izin verdi ve ilk kez elektronötral olarak çalışan gastrik H+,K+-ATPaz tarafından katyon taşınmasının voltaj bağımlılığının araştırılmasını sağladı. Prensip olarak, tahlil, K + taşıyan membran proteinleri ile sınırlı değildir, ancak ağır veya geçiş metali taşıyıcılarının aktivitesini veya endositotik süreçlerle kimyasal elementlerin alımını ele almak için eşit derecede iyi çalışabilir.

Xenopus oosit ekspresyon sisteminde AAS tarafından K+- (veya Rb+)-karşı taşıma yapan P-tipi ATPazlar tarafından Rb+ alımının miktar tayini, enzim kinetik parametrelerinin güvenilir bir şekilde belirlenmesine olanak tanır.
Na+/K+-ATPase'nin taşıma stokiyometrisinin belirlenmesi
Elektrojenik Na+/K+-ATPase için Rb+ akıları, net yük taşınımı (pompa akımının zaman integrali) ile...

Xenopus oositlerindeki enzimlerin heterolog ekspresyonu ve atomik absorpsiyon spektrofotometrisi ile tek tek hücrelere Rb+ veya Li+ alımını ölçerek K+-karşı taşıyıcı P-tipi ATPazların aktivitesini ölçmek için bir yöntem açıklıyoruz. Yöntem, karmaşık kinetik çalışmaları kolaylaştıran radyoizotop akı deneylerine hassas ve güvenli bir alternatiftir.

Na, K ve H, K-ATPaz bölgesindeki tarafından Katyon Taşıma Ölçüm<em&gt; Xenopus</emAtomik Absorpsiyon Spektrofotometresi ile&gt; Oosit: Radyoizotop Tahliller Alternatif Bir

Whereas cation transport by the electrogenic membrane transporter Na+,K+-ATPase can be measured by electrophysiology, the electroneutrally operating ...

Bu prosedür, in vivo ekspresyon sistemi olarak kurbağa sitlerini kullanmaktadır. Potasyum karşı taşıyıcı P-tipi A, TP, ais veya diğer eser element membran taşıyıcılarının taşıma aktivitesini belirlemek için öncelikle taşıyıcı proteini zap lavis sitlerinde eksprese edin. Ardından, hücreleri belirli bir konsantrasyonda taşınan katyon içeren fluks solüsyonu içerisinde sabit bir süre ve sıcaklıkta inkübe ederek katyon alımını uyarın.Alternatif olarak, iki elektrotlu voltaj klemp tekniğini kullanarak membran potansiyel kontrolü altında alım deneyini gerçekleştirin. Hücreleri yıkadıktan sonra, tekil oositleri bir mililitre millipore su içerisinde homojenize edin. Ardından, örnekleri enine ısıtmalı grafit atomizasyon fırını ile donatılmış bir atomik absorbsiyon spektrofotometresinde ölçün.Sonuç olarak, atomik absorbsiyon spektrometrisi ile izleyici akış analizi; taşıma veya inhibitör kinetiklerini, taşımanın voltaj bağımlılığını ve taşıma stokiyometrisini belirlemek için kullanılabilir ve nihayetinde farmakolojik tarama için uygulanabilir. Bu tekniğin temel avantajı, radyoizotoplarla yapılan geleneksel izleyici akış deneylerine karşı doğru, ucuz ve güvenli bir alternatif olmasıdır.Ayrıca,

measuring-cation-transport-nak-hk-atpase-xenopus-oocytes-atomic

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Planta'da besin ve toksik madde akılarının ölçümü, bitki beslenmesi ve toksisitesinin incelenmesi için esastır. Burada, örnek olarak potasyum (K+) ve amonyak/amonyum (NH3/NH4+) akılarını kullanarak, bozulmamış bitki köklerinde akıntı ve akış tayini için radyoizleyici protokollerini ele alıyoruz. Bu tür tekniklerin avantajları ve sınırlamaları tartışılmaktadır.

Radyoaktif izleyiciler ile Bitkilerde Mineral Besin ve Toksikantların Değişimler Ölçme

Bu makalenin ilk bölümü, plazma zarlarında veziküler Na+/H+ değiştiricileri eksprese eden mutant hücre hatlarının nasıl seçileceğini gösterir. İkinci bölüm, bu değiştiricilerin iyon seçiciliğini ve kinetik parametrelerini belirlemek için kullanılan hücre içi pH ölçümlerine ve hızlı iyon alımına dayalı protokoller sağlar.

Na fonksiyonel karakterizasyonu<sup&gt; +</sup&gt; / H<sup&gt; +</sup&gt; Seçim Proton-öldürme Kullanma hücre içi Bölmeler ve Eşanjörleri Plazma Membran Them Express

Hücre zarlarındaki taşıyıcılar, iyonların hücre zarları veya hücre katmanları boyunca diferansiyel ayrışmasına izin verir ve doku fizyolojisi, onarımı ve patolojisi sırasında çok önemli roller oynar. Tek hücrelerde ve dokularda spesifik iyon akışlarının in vivo olarak ölçülmesine izin veren iyon seçici kendinden referanslı mikroelektrotu açıklıyoruz.

İyon seçici Kendinden referans Mikroelektrod Tekniği Ekstraselüler Ion eriticiler Ölçümü

Bu protokol, Drosophila melanogaster izole Malpighian (renal) tübüllerin sıvı sekresyon oranları ölçmek için Ramsay tahlilinin kullanımı açıklanmaktadır. Buna ek olarak, belirli bir iyon elektrotların kullanımı transepitelyal iyon akışının hesaplanmasını sağlayan, salgılanan sıvının içinde sodyum ve potasyum konsantrasyonlarını ölçmek için, tarif edilmektedir.

Ramsay Testi Kullanımı sıvı salgılanması ve İyon Flux fiyatlar Tedbir<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Malpighi Tübül

Bu makale, iyon kanallarındaki yapısal yeniden düzenlenmeleri araştırmak için maleimid boyaları yerine Floresan Doğal olmayan Amino Asitlerin (fUAA) kullanıldığı klasik Voltaj-Kelepçe Florometrisinin (VCF) geliştirilmesini anlatıyor. Prosedür, Xenopus oosit DNA enjeksiyonu, RNA / fUAA koinjeksiyon ve eşzamanlı akım ve flüoresans ölçümlerini içerir.

Voltaj kelepçesi florometrisi<em&gt; Xenopus</emFloresan Doğal Olmayan Amino Asitler Kullanan Oositler

Bu el yazması proton taşıma sistemlerinin etkinliğini ölçmek için proton-seçici elektrot ve yöntemleri sıkma yama uygulamaları açıklar. Bu yöntemleri teknikleri proton taşıma etkinlik, ılımlı duyarlılık, zaman çözünürlüğü ve yetersiz hücre içi ortam denetimi gibi çalışma için yaygın olarak kullanılan bazı sınırlamalarının üstesinden gelir.

Elektrofizyoloji ölçüm uygulanması elektro-tarafsız taşıyıcılar etkinlik çalışması için

Burada, GABAA reseptörleri, fizyoloji ve farmakoloji bağlama, aktif bileşikler keşfetmek için protokolleri mevcut.

Bir Neurotransmission roman bileşikleri bir gama - aminobütirikasit reseptör oransal keşfi için yöntemleri yazın

Bir nikotinamid adenin dinükleotid (NADH)-birleştirilmiş ATPaz tsay küçük molekül miyozin inhibitörleri yarı yüksek iş lenme taraması için adapte edilmiştir. Bu kinetik teşbit, kuyu başına sadece 20 μL toplam reaksiyon hacmine sahip 384 kuyulu bir mikroplaka formatında çalıştırılır. Platform hemen hemen tüm ADP üreten enzimler için geçerli olmalıdır.

Küçük Molekül Inhibitörlerinin Taranması için NADH-Coupled ATPase Tsay'ın Yarı-Yüksek İş-İşLenme Adaptasyonu

Bu protokol, hücresel bir ortamda reseptörlere gerçek zamanlı olarak adenin nükleotid bağlanmasını ölçmek için bir yöntem sunar. Bağlanma, trinitrofenil nükleotid türevleri ile kanonik olmayan, floresan amino asit ile etiketlenmiş protein arasındaki Förster rezonans enerji transferi (FRET) olarak ölçülür.

Sağlam, fonksiyonel membran proteinlerine bağlanan nükleotidin gerçek zamanlı olarak ölçülmesi

Mevcut protokol, nöronal K-Cl ko-transporter KCC2'nin fonksiyonlarını ve aktivitelerini incelemek için batı blotlama tekniğinin uygulanmasını vurgulamaktadır. Protokol, kinaz düzenleyici bölgeler Thr906/1007'de batı lekelenmesi yoluyla KCC2 fosforilasyonunun araştırılmasını açıklamaktadır. Ayrıca, KCC2 etkinliğini doğrulamak için ek yöntemler bu metinde kısaca vurgulanmıştır.

Western Blotting Kullanarak Nöronal K-Cl Co-Transporter KCC2'nin Fonksiyonlarının ve Aktivitelerinin İncelenmesi

Keşfedin P-tipi ATPaz aktivitesini ölçme yöntemini Xenopus oositleri kullanarak atomik absorpsiyon spektrofotometrisi ile. Bu güvenli teknik, radyoizotop deneylerine alternatif olarak iyon taşıma kinetiğini hassas şekilde analiz eder.

Na, K ve H, K-ATPaz bölgesindeki tarafından Katyon Taşıma Ölçüm

Daha fazla video keşfet