Görüntüleme ve Patch-Kelepçe Elektrofizyoloji için dev Liposome Hazırlık

Bu prosedürün genel amacı, vezikül zarına dahil edilen zar proteinlerinin fonksiyonel bütünlüğü ile uyumlu bir şekilde dev tek katmanlı veziküller hazırlamaktır. Bu, önce lipitlerin veya küçük lipozomların ITO kaplı bir cam slayt gibi iletken bir yüzeye bırakılmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, iletken yüzey üzerinde homojen bir lipit filmi elde etmek için çözücüyü kontrollü bir şekilde buharlaştırmaktır.

Daha sonra, lipit filmi uygun bir tampon içinde dikkatlice rehidre edin ve elektro oluşum odasını hazırlayın. Son adım, dev unal Miller vezikülleri oluşturmak için lipit film boyunca salınımlı bir voltaj uygulamaktır. Sonuç olarak, veziküller, boyutlarını ve kalitelerini belirlemek ve klasik bir teknik kullanılarak oluşturulan veziküllerle karşılaştırmak için görüntülenecektir.

Bu protokolün görsel olarak gösterilmesi yararlıdır, çünkü lipid birikimine hakim olmak zor olabilir, birçok değişkene bağlıdır ve en iyi görsel inceleme ile test edilir. Bu işleme başlamadan önce, lipitleri eksi 20 santigrat derece veya eksi 80 santigrat derecede depodan çıkarın ve oda sıcaklığına ısıtın. Mümkünse, deneyi torpido gözü gibi inert bir gaz atmosferinde gerçekleştirin.

Daha sonra, lipitleri kuru argon veya nitrojen gazıyla kaplayın ve tüm adımlarda havaya maruz kalmayı en aza indirin. Lipitler organik çözücü içinde sağlanmazsa, mililitre başına 10 miligramda kloroform veya siklo hean içinde 0.3 miligram lipit askıya alın. Üreticilerin belirttiği konsantrasyonların tipik olarak yalnızca nominal olduğunu unutmayın.

2 25 milimetre x 37,5 milimetre ITO kaplı cam kızakların her iki tarafını temizlemek için etanol kullanın. Ardından, floresan görüntüleme için lipitlere yüzde 0.1 daha fazla Texas kırmızı DPPE ekleyin. Cam kızakların ITO kaplı tarafının yukarı baktığını doğrulamak için yüzey direncini bir multimetre ile ölçün, bu da birkaç yüz ohm'luk bir dirençle gösterilir.

Lipitleri, şırınga iğnesi ITO yüzeyine tam olarak temas etmeyecek şekilde solvent dirençli bir şırıngaya aspire edin. İğneyi slayt boyunca ileri geri hareket ettirerek lipiti yavaşça uygulayın. Cam yüzeyde bir gökkuşağı parlaklığı arayarak yüzeyi eşit şekilde örtün.

Bu yeri takiben, slaytlar hızlı bir şekilde bir vakuma kurur ve hazneyi 0,5 ila bir saat boyunca bir tor vakumundan daha azına pompalar. Eser miktarda çözücüyü çıkarmak için. Vakumu inert gazla serbest bırakın.

Silikon contanın her iki tarafına ince bir tabaka silikon gres sürün ve ardından contayı sürgünün üzerine yerleştirin. Slaytın bir ucunda en az beş milimetre açıkta kalan slaytı bırakın. Daha sonra, contanın kenarına 27 gauge şırınga iğnesi yerleştirerek her bir kuyuyu dikkatlice nemlendirin ve her bir contayı üç milimolar yığınla yaklaşık% 10 oranında tampon aşırı doldurun.

Lipitler hidratlandıktan sonra, kalan adımlardan hızlı bir şekilde ilerleyin. Lipid filmler delaminasyona başladığından, slaydın iletken tarafını hemen multimetre ile doğrulayın. Ardından ikinci ITO kayar iletken yüzü contanın üst kısmına uygulayın.

Conta alanının dışında ve ilk çıkıntının karşısında en az beş milimetre çıkıntı olduğundan emin olun ve iyi bir sızdırmazlık sağlamak için hafifçe bastırın. İki çıkıntıyı etanol kullanarak temizleyin. Şimdi ITO sürgülü sandviçi bakır çubuklar veya conta köpüğü gibi elektrik kontaklarına sabitleyin.

Bu grafik, referans olarak haznenin ve kontak tertibatının patlatılmış bir görünümünü gösterir. Ayrıntılı planlar, bir multimetre kullanılarak metin protokolünde bulunabilir. Kontaklar arasında elektriksel kısa devre olmadığını ve kontakların ITO yüzeylerine düzgün şekilde bağlandığını doğrulayın.

Daha sonra, elektro oluşum odasını bir fırına yerleştirin ve odayı mevcut lipitlerin herhangi birinin en yüksek erime sıcaklığının 10 santigrat derece üzerinde ısıtın. Sinüs dalgasının genliğini belirlemek için iki ITO kaplı yüzey arasındaki boşluğu ölçün. Sinüs dalgasının genliği yaklaşık 0,7 volt RMS olmalıdır ITO yüzeyleri arasındaki her milimetre boşluk için, 60 ila 90 dakika boyunca 10 hertz sinüs dalgası uygulayın.

Jeneratörü elektro oluşum odasına bağlayın ve voltajı bir multimetre ile onaylayın. 60 ila 90 dakikalık elektro oluşumundan sonra, dev unal kesecikleri oluşmuş olmalıdır. Lipozomları görüntülemek için Texas kırmızı boyası için bir filtre küpü ile donatılmış ters çevrilmiş bir mikroskop kullanın.

Lipozom küresel olmalı, ağırlıklı olarak gözle Ella'da olmalı ve lipozomdan sarkan ipler gibi kusurlardan arındırılmış olmalıdır. Önceki adımlar, saf lipitlerden dev lipozomların klasik preparatını kapsıyordu. Küçük lipozomlar kullanılarak daha zorlu bir hazırlık gösterilmiştir.

Daha sonra, önce, 20 santigrat derecede% 44 bağıl nemde doymuş bir potasyum karbonat çözeltisi hazırlayın. Üst kapta deliklerle modifiye edilmiş, iç içe geçmiş bir üst kabı olan plastik bir yoğurt ve granola kabı kullanın. Doymuş tuz çözeltisini ve fazla tuzu, iç rafı olan, sıkıca kapatılabilir bir kaba koyun.

Doldurduktan sonra rafı değiştirin ve sıvının rafın beş ila 10 milimetre altında olduğundan emin olun. Kabın yan tarafındaki bir çentiğe bir nem sensörü yerleştirin. ITO kaplı cam kızakların her iki tarafını da etanol ile temizleyin.

Hangi tarafın iletken olduğunu belirlemek için multimetreyi kullanın ve iletken olmayan tarafı numune adıyla etiketleyin. Ardından, bir veya çoklu tutucu silikon contanın her iki tarafını da hafifçe yağlayın. Slaytın iletken kısmını tezgahın üzerine yerleştirin ve silikon contaları lipidin uygulanacağı her slayta uygulayın.

Elektro oluşturma aparatına bağlanmak için bir ucunda en az beş milimetre açıkta kalan slayt olduğundan emin olun. İyi bir sızdırmazlık sağlamak için contayı düzeltin, vezikül preparatını düşük tuzlu izomodik tamponda mililitre başına yaklaşık bir ila iki miligrama kadar seyreltin. Lipidi slayta bir ila 10 mikrolitrelik damlalar halinde uygulayın.

Sürgüyü doymuş tuz çözeltisinin üzerindeki iç rafa yerleştirin ve kabı sıkıca kapatın. Oda sıcaklığında üç saatten gece boyunca bekletin. Slayt artık klasik protokolde daha önce gösterildiği gibi dev lipozomların elektro oluşumu için kullanılabilir.

Bireysel mevduatların gökkuşağı görünümüne dikkat edin. Bu görüntü, kloroformdan biriken lipitlerden oluşan lipozomların elektrosunu göstermektedir, oklar dev lipozomları göstermektedir. Bu görüntüde çok az bulanık alan var ve bu nedenle iyi bir hazırlığı gösteriyor.

Bu sonraki görüntüde birçok bulanık bölge var ve bu nedenle genel olarak zayıf bir hazırlığa işaret ediyor. İkinci okun, ayırt edilemeyen lipozomlara sahip bir bölgeyi gösterdiğini ve üçüncü okla gösterilen alanda hiçbir lipozomun odaklanamayacağını unutmayın. Burada gösterilen, küçük lipozomların dehidrasyonu ile biriken lipitlerden başarıyla elektro olarak oluşturulan lipozomların 10 x büyütmesidir.

Oklar, 40 x büyütmede boyutları yaklaşık beş ila 20 mikrometre arasında değişen üç iyi kaliteli lipozomu göstermektedir. Lipozomun kenarında, tek veya neredeyse lumal bir lipozomu gösteren net bir halka görülebilir. Oluşan dev lipozomlardan eksize edilen lipid membran yamalarında kaydedilen kapsaisin ile aktive edilmiş TR PV on iyonik akımlar burada gösterilmektedir.

Kaçak akım, kapsaisin eklenmeden önce 500 mega sızdırmazlık direncini gösterdi. Doymuş kapsaisin, büyük bir T RRP V bir akımı aktive etti. Bu prosedür denenirken kapsaisin yamadan yıkandığı için akım taban çizgisine yakın geri döner.

Lipitlerin nasıl kuruduğunu ve cam alt tabaka üzerinde eşit bir film oluşturduğunu etkileyen birçok faktör nedeniyle esnek kalmak önemlidir. Çevrimiçi sorun giderme bölümümüze danışın ve en iyi sonuçları elde etmek için sıcaklığı, nemi, lipid konsantrasyonunu ve damlacık boyutunu değiştirin.