Içinde Doğuştan gelen ve sirkadiyen Ayarlı Photobehavior Eğitim ışık tercih Testi

Aşağıdaki deneyin genel amacı, bir ışık-karanlık tercih testi aracılığıyla drosophila larvaelerinin doğuştan gelen ve sirkadiyen foto davranışlarını test etmektir. Bu, öncelikle deney larvaelerinin, larvalarda başlangıçta bir sirkadiyen saat oluşturmak için tanımlanmış ışık-karanlık koşulları altında yetiştirilmesiyle gerçekleştirilir. Ardından, larvalar, larval sirkadiyen saatin serbestçe çalışmasına olanak tanıyan sabit karanlığa geçirilir.

L3 beslenme aşamasına gelindiğinde, larva farklı sirkadiyen zaman noktalarındaki ışık tercihlerini test etmek amacıyla gruplara ayrılır. Bir tercih indeksi hesaplanarak zaman noktaları ve deneysel gruplar arasında karşılaştırmalar yapılarak, doğuştan gelen ve sirkadiyen ışık tercihini gösteren sonuçlar elde edilir. Bu yöntem, ışık algılamanın ve fotodavranış işlemenin doğuştan gelen ve sirkadiyen düzenlemesi hakkında bilgi sağlayabildiği gibi; koku alma, kemosensör algı, kemotaksi ve termotaksi gibi diğer sistemlere de uygulanabilir.

Aynı şekilde, öğrenme ve bellek testleri için de modifiye edilebilir. Prosedürü, laboratuvarımdan mezun olan yüksek lisans öğrencileri Alina ve BMA göstereceklerdir. Yumurtaları toplamak için, çiftleşmiş yetişkin sineklerin taze flakonlar üzerinde 12 saat boyunca yumurtlamasına izin verin ve ardından onları yeni flakonlara aktarın. Yetişkinleri, 12 saat ışık ve 12 saat karanlık döngüsü boyunca her 12 saatte bir aktarmaya devam edin.

12 saatlik yumurta toplama örneklerini inkübatörde tutun. Deney için, hayvanları erken L3 larva evresine kadar büyütün. Bunlar, yumurtadan çıktıktan sonra 84 ile 108 saat arasında beslenmeye hazır olanlardır.

LAE'nin doğru evrelemesinin sağlanması, deneyin başarısı için kritik öneme sahiptir. Geç L3 evresinden itibaren LAE, görsel davranışın sirkadiyen bileşenlerini test etmek için foto-davranışı değiştirmiştir. Testten 48 saat önce ve larvaların subjektif şafak vaktinden hemen önce, toplanan larvaları karton bir kutuya yerleştirin.

Ardından, kutuyu 48 saat boyunca sabit karanlık inkübatörüne aktarın; deneye kadar bu larvalar kendilerine ayrılan alanda rahatsız edilmeden tutulmalıdır. Kılavuz olarak, dört çeyreğe bölünmüş 20 santimetrelik bir kare kullanarak dokuz santimetrelik bir Petri kabı kapağı hazırlayın.

Alüminyum folyonun 10 santimetrelik karelerini karşılıklı kadranlara yapıştırın ve üzerlerini siyah bantla kapatın. Kapak kenarını kapladığınızdan emin olun. Ardından, masadaki ışık kaynağının altına dört kadrana bölünmüş 20 santimetrelik bir kare yapıştırın.

Tutarlı bir yerleştirme için kılavuz görevi görmesi amacıyla, bir test tabağının çevresini kağıt üzerine işaretleyin. Bir demir destek ayağı kullanarak Petri tabağının üzerine bir LED lamba yerleştirin. Yüksekliği, tüm test plağının homojen bir şekilde aydınlatılacağı şekilde ayarlayın.

Lamba yüksekliğini daha fazla ayarlayarak veya ayarlanabilir bir güç kaynağı kullanarak, bir test alanındaki ışık yoğunluğunu 350 ile 760 lüks arasına getirin. Deney odasının kırmızı ışıkla aydınlatılması ve hayvanların yetiştirildiği ortamla aynı sıcaklıkta olması gerekir. Tüpler, iki gün boyunca sürekli karanlık altında bekletilmiştir.

Yemlerin üst beş milimetresindeki lavaları bir spatula yardımıyla toplayın. Yemi bir Petri kabı kapağının dış yüzeyine yayın. Yeme bir miktar su ekleyin ve spatula ile nazikçe karıştırın.

Bir resim fırçası kullanarak yeni bir kaba bir damla musluk suyu ekleyin. Larvaları yıkamak için su damlasına aktarın. Ardından, larvaları toplamak için ıslak bir resim fırçası kullanın.

Sadece erken beslenme evresindeki L3 larvaları seçin ve geç gezinti evresindeki L3 larvalarından kaçının. Seçilen larvaları bir test plağının merkezine aktarın. Beslenme evresindeki L3 larvalarının anterior sferülleri açık ve dışa doğru çıkıktır.

Parmak benzeri bir formdadır. Posterior küresel yapılar her birinde üç açıklığa ve dört grup büyük dallanmış kıla sahiptir. Tükürük bezleri ikinci abdominal segmente kadar uzanır.

30 larva test plakasının merkezine yerleştirildikten sonra, plakayı hazırlanan kapakla kapatın. LED lambayı açın. Bir zamanlayıcı başlatın ve larvaların plaka üzerinde beş dakika boyunca serbestçe hareket etmelerine izin verin.

Ardından kapağı hızla çıkarın ve karanlık ile aydınlık kadranlardaki larva sayısını sayın. Her bir larvanın konumunu işaretlemek sayım işlemini kolaylaştırabilir. Hızlıca bir fotoğraf çekmek de yardımcı olabilir; duvarlarda sürünen veya agara gömülen larvalar gibi net bir ışık tercihi göstermeyen larvalar, nötr tercih olarak sayılmalı ve ışık tercih indeksi hesaplanırken toplam larva sayısına eklenmelidir.

Larvaları saydıktan sonra plakayı atın ve bir sonraki deney için yeni bir test plağı kullanın. Genotip başına 10 ila 15 deneme gerçekleştirdikten sonra, protokolü takip ederek analize geçin. Canton ES larvalarının ışık-karanlık tercihi iki farklı sirkadiyen zamanda karşılaştırılmıştır.

CT sıfır ve CT 12'de, subjektif olarak, şafak ve gün batımı larvaları standart koşullar altında 48 saat boyunca tutulmuş ve ardından üç gün boyunca sabit karanlığa geçirilmiştir. 350 lüks altındaki ışık-karanlık testleri, CT sıfırda test edilen larvalarda ışık fotosensitivitesinin CT 12'de test edilen larvalara kıyasla daha yüksek olduğunu ortaya koymuştur. Bu formül kullanıldığında, CT sıfır larvalarının karanlık tercihi 0,52 iken, karşılaştırma grubunda bu değer 0,36 olmuştur.

CT 12 larvalarının indekslerini wilcoxon testi kullanarak karşılaştırmak, 0,023 şeklinde anlamlı bir P değeri üretmektedir. Bu videoyu izledikten sonra, bu amaca yönelik olarak farklı devre ve zaman noktalarında trofik larvaların ışık tercihini nasıl test edeceğiniz konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Evre F üç oph larvalarını entrain edebilmeli, fotofobik davranışlarını test edebilmeli ve istatistiksel karşılaştırma için ışık tercih indeksini hesaplayabilmelisiniz.