Mikroplaka Okuyucuya Giriş
Mikroplaka okuyucu, çeşitli deneylerin aynı anda gerçekleştirilmesine ve ölçülmesine olanak tanıyan çok modlu bir cihazdır. Mikroplaka okuyucular abso…
Mikroplaka okuyucu, sanki birçok küçük deney aynı anda gerçekleştiriliyormuş gibi, birçok örneğin eş zamanlı olarak ölçülmesine olanak tanıyan yaygın olarak kullanılan bir cihazdır.
Bu aparat, 96 kuyucuklu plaka gibi çok kuyucuklu plakalarla birlikte kullanılır.
Mikroplaka okuyucu ile yürütülen deneyin türü ne olursa olsun, deneysel örneklerin değerlerini belirlemek için genellikle standart eğrilerin yanı sıra pozitif ve negatif kontroller de kullanılır.
Mikroplaka okuyucular farklı şekil, boyut ve kurulumlarda bulunur. Birçok mikroplaka okuyucu, birçok farklı analizin gerçekleştirilmesine olanak tanıyan çok modlu yeteneklere sahiptir. Bu modlar; absorpsiyon, floresan ve lüminesans ölçümleri gibi farklı ölçüm türlerini gerçekleştirme yeteneğini içerir.
Çok kuyucuklu plakalar, mikroplaka okuyucunun ayrılmaz bileşenleridir ve makine tarafından ölçülen numuneleri tutmak için kullanılırlar. Bu plakalar farklı boyutlarda olabilir, farklı kuyucuk tabanı türlerine ve farklı sayıda kuyucuğa sahip olabilirler. Kullanılan plaka türü, yapılan analize bağlıdır.
Yükleme tepsisi, 96 kuyucuklu plakanın makineye yerleştirilmesi için kullanılır.
Plaka okuyucuyu çalıştırmak ve dalga boyu ile mod gibi ayarlarını ve parametrelerini kontrol etmek için tipik olarak bir bilgisayar arayüzü kullanılır. Plaka okuyucu yazılımı, hangi kuyucukların numunelerle yüklendiğini seçmenize olanak tanıyan, plakanın grafiksel bir kullanıcı arayüzüne sahiptir.
Çok kanallı pipetler genellikle çok kuyucuklu plakaları doldurmak için kullanılır. Rezervuarlar, çok kanallı pipet için çözeltileri tutar.
Kuyucuklar bazen standart tek kanallı bir pipet kullanılarak da doldurulabilir.
Pipetleme hatalarını hesaba katmak için numuneler ve standartlar ya duplika ya da triplika olarak yüklenir. Burada triplika olarak doldurulmuş bir plaka görülmektedir.
Standart eğri, farklı absorbans değerleri veren bilinen konsantrasyonlardaki numuneleri kullanır. Bu veriler daha sonra, en uygun doğrunun oluşturulduğu bir grafik oluşturmak için kullanılır.
Kör (blank), ölçümünüzün deneysel olarak ilgili olmayan ve numunenizin seyreltildiği tamponlardan veya numunenizin maruz kaldığı reaktiflerden kaynaklanan kısmını belirlemek için kullanılır. Bu ölçümlerden elde edilen değerlere "arka plan" denir. Kör numune herhangi bir örnek içermez.
Pozitif kontrol, analizinin düzgün çalışıp çalışmadığını gösterir ve iyi bir sonuç verir. Negatif kontrol ise herhangi bir ölçüm veya etkinin gözlemlenmesinin beklenmediği bir kontrol değişkenidir. Herhangi bir sonuç vermemesi gerekir.
Plaka hazırlandıktan sonra, numuneleri yükleme zamanı gelmiştir. Yanlış numunelerin ölçülmesini veya plakanın yanlış şekilde doldurulmasını önlemek için, plakanın yükleme tepsisinde doğru şekilde yönlendirilmesi kritik önem taşır. Tepsi cihazın içine zorlanmamak veya uzuvların cihazın içinde sıkışmaması için numuneler tepsiye yüklenirken dikkatli olunması gerektiğini unutmayın.
Tepsi yüklendikten sonra, plaka okunmadan önce mod, dalga boyu ve kuyucuk yükleme sırası gibi parametreler yazılımda ayarlanır.
Parametreler ayarlandıktan sonra plaka okunur ve okuyucu, yazılım içinde değerlerin bir çıktısını oluşturur.
Plaka okunduktan sonra, standart eğri dahil tüm numunelerden arka planı çıkarmak için kör numunelerin ortalama değerini kullanın.
Okuma işleminden sonra, standartlar için bilinen konsantrasyon değerleri, karşılarındaki ölçülen değerlere, bu durumda absorbansa karşı grafiğe dökülür.
Değerler grafiğe döküldüğünde, lineer regresyon kullanılarak en uygun doğru hesaplanabilir. Bu işlem, bir hesap çizelgesi programı kullanılarak kolayca yapılabilir.
Doğrunun gerçek veri noktalarını ne kadar iyi tahmin ettiğinin istatistiksel bir ölçüsü olan belirleme katsayısı 0,90-0,99 arasında olmalıdır; 0,99 en iyi değer olarak kabul edilir ve doğrunun verilere mükemmel şekilde uyduğunu belirtir.
En uygun doğruyu kullanarak, Y için absorbans değerini yerleştirip ardından denklemi X için çözerek her bir kuyucuktaki deneysel numunelerin veya kontrollerin konsantrasyon değerlerini hesaplayabiliriz. Konsantrasyon değerleri ayrıca Y eksenindeki absorbans değerinden en uygun doğruya ve oradan X eksenine bir çizgi çizilerek de tahmin edilebilir.
Birçok mikroplaka okuyucu tipi, bir nesne üzerine düşen ışığın nesne tarafından geçirilen ışığa olan logaritmik oranı olarak tanımlanan absorbansı ölçer.
Bradford testi, protein örneklerinin "Bradford" reaktifi ile birlikte plakaya eklendiği absorbans tabanlı bir mikroplaka okuyucu testi örneğidir. Bu bileşik, örnekteki proteinlere bağlanır ve absorbansında bir kaymaya neden olur.
Floresan tabanlı testlerde, bir florokrom belirli bir ışık dalga boyu ile aktive edilir ve bu da florokromun uyarılmasına yol açarak farklı bir dalga boyunda ışık yaymasına neden olur.
Işığa duyarlı reaktiflerle çalışırken, fotobeyazlamayı önlemek ve deneyi bozmamak için onları kapalı tuttuğunuzdan emin olun.
Lüminesans testleri, kimyasal bir reaksiyon yoluyla ışık yayar ve sıklıkla lusiferaz kullanır. Lusiferaz, ateş böcekleri gibi birçok kaynaktan elde edilir. Bir lusiferaz reaksiyonunda ışık; lusiferazın bir dizi reaksiyonla oksijen, ATP ve magnezyum ile karşılaştığında yayılır.
Lüminesans testlerinin birçok farklı uygulaması vardır. Bu uygulamalardan bir örnek, kanserlerde reaktif oksijen türlerinin üretiminin ölçülmesi ve tespit edilmesidir.
Mikroplaka okuyucuların kullanıldığı diğer uygulamalar arasında, 384 ve 1536 kuyucuklu yüksek kapasiteli testler yer alır. Bu testlerde plakalar bir robot tarafından yüklenir. Hayır, bildiğiniz türden bir robot değil; son derece hassas örnek işlemeyi otomatize eden programlanabilir bir robot.
JoVE'nin mikroplaka okuyucuya giriş videosunu izlediniz. Bu videoda, mikroplaka okuyucunun ne olduğunu(A), nasıl kullanıldığını(B), bu cihazın nasıl çalıştırılacağını(C), mikroplaka okuyucu verilerinin nasıl yorumlanacağını ve mikroplaka okuyucu kullanılarak gerçekleştirilen bazı uygulamaları(D) gösterdik. İzlediğiniz için teşekkür ederiz.
Mikroplaka okuyucu, sanki birçok küçük deney aynı anda gerçekleştiriliyormuş gibi, birçok örneğin eş zamanlı olarak ölçülmesine olanak tanıyan yaygın olarak kullanılan bir cihazdır.
Bu aparat, 96 kuyucuklu plaka gibi çok kuyucuklu plakalarla birlikte kullanılır.
Mikroplaka okuyucu ile yürütülen deneyin türü ne olursa olsun, deneysel örneklerin değerlerini belirlemek için genellikle standart eğrilerin yanı sıra pozitif ve negatif kontroller de kullanılır.
Mikroplaka okuyucular farklı şekil, boyut ve kurulumlarda bulunur. Birçok mikroplaka okuyucu, birçok farklı analizin gerçekleştirilmesine olanak tanıyan çok modlu yeteneklere sahiptir. Bu modlar; absorpsiyon, floresan ve lüminesans ölçümleri gibi farklı ölçüm türlerini gerçekleştirme yeteneğini içerir.
Çok kuyucuklu plakalar, mikroplaka okuyucunun ayrılmaz bileşenleridir ve makine tarafından ölçülen numuneleri tutmak için kullanılırlar. Bu plakalar farklı boyutlarda olabilir, farklı kuyucuk tabanı türlerine ve farklı sayıda kuyucuğa sahip olabilirler. Kullanılan plaka türü, yapılan analize bağlıdır.
Yükleme tepsisi, 96 kuyucuklu plakanın makineye yerleştirilmesi için kullanılır.
Plaka okuyucuyu çalıştırmak ve dalga boyu ile mod gibi ayarlarını ve parametrelerini kontrol etmek için tipik olarak bir bilgisayar arayüzü kullanılır. Plaka okuyucu yazılımı, hangi kuyucukların numunelerle yüklendiğini seçmenize olanak tanıyan, plakanın grafiksel bir kullanıcı arayüzüne sahiptir.
Çok kanallı pipetler genellikle çok kuyucuklu plakaları doldurmak için kullanılır. Rezervuarlar, çok kanallı pipet için çözeltileri tutar.
Kuyucuklar bazen standart tek kanallı bir pipet kullanılarak da doldurulabilir.
Pipetleme hatalarını hesaba katmak için numuneler ve standartlar ya duplika ya da triplika olarak yüklenir. Burada triplika olarak doldurulmuş bir plaka görülmektedir.
Standart eğri, farklı absorbans değerleri veren bilinen konsantrasyonlardaki numuneleri kullanır. Bu veriler daha sonra, en uygun doğrunun oluşturulduğu bir grafik oluşturmak için kullanılır.
Kör (blank), ölçümünüzün deneysel olarak ilgili olmayan ve numunenizin seyreltildiği tamponlardan veya numunenizin maruz kaldığı reaktiflerden kaynaklanan kısmını belirlemek için kullanılır. Bu ölçümlerden elde edilen değerlere "arka plan" denir. Kör numune herhangi bir örnek içermez.
Pozitif kontrol, analizinin düzgün çalışıp çalışmadığını gösterir ve iyi bir sonuç verir. Negatif kontrol ise herhangi bir ölçüm veya etkinin gözlemlenmesinin beklenmediği bir kontrol değişkenidir. Herhangi bir sonuç vermemesi gerekir.
Plaka hazırlandıktan sonra, numuneleri yükleme zamanı gelmiştir. Yanlış numunelerin ölçülmesini veya plakanın yanlış şekilde doldurulmasını önlemek için, plakanın yükleme tepsisinde doğru şekilde yönlendirilmesi kritik önem taşır. Tepsi cihazın içine zorlanmamak veya uzuvların cihazın içinde sıkışmaması için numuneler tepsiye yüklenirken dikkatli olunması gerektiğini unutmayın.
Tepsi yüklendikten sonra, plaka okunmadan önce mod, dalga boyu ve kuyucuk yükleme sırası gibi parametreler yazılımda ayarlanır.
Parametreler ayarlandıktan sonra plaka okunur ve okuyucu, yazılım içinde değerlerin bir çıktısını oluşturur.
Plaka okunduktan sonra, standart eğri dahil tüm numunelerden arka planı çıkarmak için kör numunelerin ortalama değerini kullanın.
Okuma işleminden sonra, standartlar için bilinen konsantrasyon değerleri, karşılarındaki ölçülen değerlere, bu durumda absorbansa karşı grafiğe dökülür.
Değerler grafiğe döküldüğünde, lineer regresyon kullanılarak en uygun doğru hesaplanabilir. Bu işlem, bir hesap çizelgesi programı kullanılarak kolayca yapılabilir.
Doğrunun gerçek veri noktalarını ne kadar iyi tahmin ettiğinin istatistiksel bir ölçüsü olan belirleme katsayısı 0,90-0,99 arasında olmalıdır; 0,99 en iyi değer olarak kabul edilir ve doğrunun verilere mükemmel şekilde uyduğunu belirtir.
En uygun doğruyu kullanarak, Y için absorbans değerini yerleştirip ardından denklemi X için çözerek her bir kuyucuktaki deneysel numunelerin veya kontrollerin konsantrasyon değerlerini hesaplayabiliriz. Konsantrasyon değerleri ayrıca Y eksenindeki absorbans değerinden en uygun doğruya ve oradan X eksenine bir çizgi çizilerek de tahmin edilebilir.
Birçok mikroplaka okuyucu tipi, bir nesne üzerine düşen ışığın nesne tarafından geçirilen ışığa olan logaritmik oranı olarak tanımlanan absorbansı ölçer.
Bradford testi, protein örneklerinin "Bradford" reaktifi ile birlikte plakaya eklendiği absorbans tabanlı bir mikroplaka okuyucu testi örneğidir. Bu bileşik, örnekteki proteinlere bağlanır ve absorbansında bir kaymaya neden olur.
Floresan tabanlı testlerde, bir florokrom belirli bir ışık dalga boyu ile aktive edilir ve bu da florokromun uyarılmasına yol açarak farklı bir dalga boyunda ışık yaymasına neden olur.
Işığa duyarlı reaktiflerle çalışırken, fotobeyazlamayı önlemek ve deneyi bozmamak için onları kapalı tuttuğunuzdan emin olun.
Lüminesans testleri, kimyasal bir reaksiyon yoluyla ışık yayar ve sıklıkla lusiferaz kullanır. Lusiferaz, ateş böcekleri gibi birçok kaynaktan elde edilir. Bir lusiferaz reaksiyonunda ışık; lusiferazın bir dizi reaksiyonla oksijen, ATP ve magnezyum ile karşılaştığında yayılır.
Lüminesans testlerinin birçok farklı uygulaması vardır. Bu uygulamalardan bir örnek, kanserlerde reaktif oksijen türlerinin üretiminin ölçülmesi ve tespit edilmesidir.
Mikroplaka okuyucuların kullanıldığı diğer uygulamalar arasında, 384 ve 1536 kuyucuklu yüksek kapasiteli testler yer alır. Bu testlerde plakalar bir robot tarafından yüklenir. Hayır, bildiğiniz türden bir robot değil; son derece hassas örnek işlemeyi otomatize eden programlanabilir bir robot.
JoVE'nin mikroplaka okuyucuya giriş videosunu izlediniz. Bu videoda, mikroplaka okuyucunun ne olduğunu(A), nasıl kullanıldığını(B), bu cihazın nasıl çalıştırılacağını(C), mikroplaka okuyucu verilerinin nasıl yorumlanacağını ve mikroplaka okuyucu kullanılarak gerçekleştirilen bazı uygulamaları(D) gösterdik. İzlediğiniz için teşekkür ederiz.
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: What is a microplate reader and how does it work?
A microplate reader is an instrument that simultaneously measures many samples using multiwell plates, such as 96-well plates. It performs multiple miniature experiments at once by detecting different types of measurements including absorbance, fluorescence, and luminescence. The computer interface controls settings like wavelength and mode to automate sample analysis across all wells.
Q2: Why are standard curves used in microplate reader assays?
Standard curves determine experimental sample values by using samples with known concentrations that yield different absorbance values. A line of best fit is generated from this data, allowing unknown sample concentrations to be calculated or estimated. The coefficient of determination should be between 0.90-0.99 to ensure the line accurately predicts actual data points.
Q3: What role do controls play in microplate reader experiments?
Blanks determine background measurement not related to the experiment, using buffers or reagents without samples. Positive controls confirm the assay worked properly by yielding expected results. Negative controls show no measurement or effect should occur. Together, these controls validate assay accuracy and identify any experimental errors or contamination.
Q4: How should samples be loaded into a microplate for accurate results?
Samples and standards are loaded in duplicate or triplicate to account for pipetting errors. Multichannel pipettes are often used for efficient loading, though single-channel pipettes work for individual wells. Proper plate orientation in the loading tray is critical to prevent measuring wrong samples. Exercise caution when loading to avoid forcing the tray or catching extremities in the instrument.
Q5: What are the different measurement types available on multimodal microplate readers?
Multimodal microplate readers can perform absorbance measurements, which detect light transmitted through samples; fluorescence measurements, where a fluorochrome is excited by light and emits at a different wavelength; and luminescence measurements, which detect light from chemical reactions like luciferase. Light-sensitive reagents must be kept covered to prevent photobleaching and preserve experiment integrity.
Q6: How is background subtraction performed after reading a microplate?
After the plate is read, the average value of blank samples is calculated and subtracted from all sample measurements, including the standard curve. This removes background noise caused by buffers or reagents not related to the experiment. Background subtraction ensures that measured values reflect only the experimental signal of interest.
Q7: What are common applications of microplate readers in research?
Microplate readers quantify protein levels, measure gene expression, and detect metabolic processes such as reactive oxygen species production in cancer research and calcium flux. High-throughput assays using 384- and 1536-well plates employ programmable robots for automated, precise sample handling. These applications enable rapid analysis of thousands of samples simultaneously.