Name: Telomer uzunluğu ve Telomeraz Aktivitesi, Hücre Yaşlılık bir Yin ve Yang (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-22T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 8 s
Description: Öğrenin, qRT-PCR kullanarak çeşitli dokularda telomer uzunluğu ve telomeraz aktivitesini nasıl değerlendireceğinizi. Bu yöntem, hücre yaşlanması ve yaşlanmaya bağlı hastalıkların anlaşılmasına katkı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. Telomer uzunluğu Protokol 19 <ol><li> DNA izolasyonu </li></ol> En DNA izolasyon yöntemleri kullanılabilir. Bizim Lab kan kaynakları için Qiagen DNeasy Kiti (# 69506) tercih ediyor. Örneğin bukkal ya da diğer kaynaklardan gelen DNA, bir kaynağına bağlı olarak, farklı bir izolasyon yöntemi de kullanılabilir. <ol start="2"><li> Astarlar: </li></ol> Tüm primerler PCR sınıf suda 100pmoles/μl &#39;lik bir stok konsantrasyonu seyreltildi ve kullanılana kadar -20 ° C&#39;de saklanır. Primerlerin çalışma stokları kısa bir süre için taze yapılmış ve 20 ° C &#39;de muhafaza edilmektedir (bir kaç ay). Standart primerler olarak O&#39;Callaghan ve diğ, telomer ve β-globin, SCG kullanılmıştır. 20 . Primer dizileri: Telo 1: 5&#39;-CGGTTTGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTT-TGGGTTTGGGTT-3 &#39; Telo 2: 5&#39;-GGCTTGCCTTACCCTTACCCTTACCCTTACCCTT-ACCCT-3 &#39; SCG 1: 5&#39;-GCTTCTGACACAACTGTGTTCACTAGC-3 &#39; SCG 2: 5&#39;-CACCAACTTCATCCACGTTC-ACC-3 &#39; Not: Primerler önce reaksiyon karışımına ilave edilmeden, 10pmoles/μl çalışan bir konsantrasyona seyreltilir. <ol start="3"><li> Genomik DNA seri seyreltme: </li></ol> Telo ve tek kopya Gene (SCG) genomik DNA seri seyreltileri tahlili için standart bir eğri oluşturmak Ct değeri oluşturulur. Kullanılan genomik DNA kan örneklerinden lenfositlerden elde edildi. Bu seyreltmeler, aynı genomik DNA kullanılarak seri seyreltme iki set vermek üzere 1.68 faktörüyle her bir konsantrasyonu için PCR sınıf H 2 0, DNA seyreltilerek oluşturulur. Başlangıç ​​konsantrasyonu deneme ve yanılma göre optimize edilmiş ve farklı reaktif madde, araçlar, diğer türler arasından, DNA, hücre tipi ve kullanılan SCG kullanılıyorsa ayarlanması gerekebilir. Not: genomik DNA kullanılarak seri seyreltme yavaşça karıştırılması ve bir saat befo en azından 15 dakika beklendikten sonra yapılırBir sonraki seyreltme için DNA alarak yeniden. Her seyreltme ayırmak için genomik DNA için zaman gerektirir. -80 Depolama için PCR şeritler ° C içine uzun süreli depolama, kısım seri dilüsyonları için Her PCR şerit çözülmüş ve DNA zarar verebilir donma çözülme döngüleri önlemek için bir kez kullanılır. <ol start="4"><li> RT-PCR için Reaksiyon kurulum </li></ol> Kullanılan alet: Roche480 Işık Cycler Reaktif: Roche Işık döngü SYBR-yeşil 10 ng / ml arasında bir nihai konsantrasyona testi DNA örnekleri seyreltilir. Biz Nanodrop veya Qubit kullanarak konsantrasyonu test edin. Biz daha 10ng/μl nihai 5ng/μl için DNA sulandırmak. Biz yine konsantrasyon test yok. Reaksiyon bileşenleri: <table border="1"><tbody><tr><td fo:width="1.5in"> TELO </td><td fo:width="1.5in"> 1x </td><td fo:width=".25in" rowspan="6"></td><td fo:width="1.5in"> SCG </td><td fo:width="1.5in"> 1x </td></tr><tr><td> Y 2 0 &lt;/ Td&gt; <td> 6 ul </td><td> H20 </td><td> 6 ul </td></tr><tr><td> Telo 1 </td><td> 0.2 ul </td><td> 1 SCG </td><td> 0.6 ul </td></tr><tr><td> Telo 2 </td><td> 1.8 ul </td><td> 2 SCG </td><td> 1.4 ul </td></tr><tr><td> Rxn karışımı </td><td> 10 ul </td><td> Rxn karışımı </td><td> 10 ul </td></tr><tr><td> DNA ya da seri seyreltme </td><td> 2 ul </td><td> DNA ya da seri seyreltme </td><td> 2 ul </td></tr></tbody></table> Not: Ana Karışım DNA olmadan ve% 5 ila% 10 arasında bir fazlalığı ile yapılır. Telo ve SCG ikisi de aşağıdaki programı kullanarak aynı plaka üzerinde birlikte işletilmektedir. , Hassas test etmek için en az üç her numunenin çoğaltır ve kontrol çalıştırılmalıdır. Kullanılan primerler değişimler sonuçlarını etkileyebilir. Bizim protokol Roche480 Işık Cycler ve astar üzerinde aşağıdaki gibi çalışmak üzere optimize edilmiştir. Içindeitial denatüre 10 dakika 95 ° C denatüre Bisiklete binme 95 ° C 10 saniye tutun 60 ° C 5 saniye tutun 72 ° C 11 saniye tutun ve tek satın alma Gerektiği gibi 45-55 kez tekrarlayın 2. Kantitatif Telomeraz Algılama (QTD) Protokolü (Müttefik Biyoteknoloji, Inc Kat. No MT3012 tarafından QTD Seti dayanarak) Hazırlık Özü <ol><li> Pelet hücre veya doku. </li><li> 1x bir kez PBS ile yıkayın. </li><li> Repellet ve kaldır 1x PBS. * </li><li> Her 10 5 -10 6 hücre veya doku 40-100 mg 1 x Lizis Tampon 200 ul hücre pelletini. </li><li> 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. </li><li> 4 ° C&#39;de 30 dakika boyunca 12,000 x g&#39;de örnek dönerler </li><li> Yeni bir tüp içine 160 ul süpernatan aktarın ve protein konsantrasyonu belirlenir. </li><li> Kısım ve -80 kuru buz / etanol hızlı dondurma kalan özü, mağaza ° C </li></ol> * T içindeonun durumu, dondurulmuş hücre veya dokularda telomeraz en az bir yıl boyunca stabildir. Kullanım için içine yerleştirildiği zaman, 1 x Liziz Tamponu içinde hücrelerin hemen tekrar süspansiyon. 2.1. Testi Kontroller Isı inaktivasyonu kontrolü: her bir numune için, önceden telomeraz aktivitesi deneyi için 10 dakika boyunca 85 ° C&#39;de inkübe ederek ek kontrol özü tedavi ısı. TSR denetimi şablon için standart eğri: standart bir eğri oluşturmak için kiti ile birlikte telomer astar benzer bir dizi ile TSR, bir oligonükleotid dilüsyonları kullanarak Kantitatif Real-Time PCR gerçekleştirin. <ol><li> Lizis Tampon ile stok TSR konsantrasyon 01:05 seri dilüsyonları (0.5 amoles / ml) hazırlayın </li><li> Stok konsantrasyonu da dahil olmak üzere, her TSR seyreltme 1 ul kullanarak telomeraz algılama standart tahlil gerçekleştirin. Bu seyreltiler, en az 2 hafta boyunca 4 ° C&#39;de muhafaza edilebilir. </li></ol> 2.2. Telomeraz Aktivitesi TestiQTD Real-Time PCR kullanarak <ol><li> Her numune için, bir PCR tüp veya ince duvar PCR plate (toplam hacim 25.0 ul) için aşağıdakileri ekleyin: <ul><li> 2 x QTD Premix 12.5 ul </li><li> Hücre veya Doku Extract 1.0 ul </li><li> PCR Nitelikli Su 11.5 ul </li></ul></li><li> Iyice karıştırın </li><li> Aşağıdaki programa göre Programı Real-Time PCR Tespit Sistemleri: - 25 ° C&#39;de 20 dakika (telomeraz reaksiyonu) için - 95 10 dakika (PCR ilk aktivasyon adım) ° C 35-40 döngüleri: - 95 ° C 30 saniye (denatürasyon) - 60 ° C&#39;de 30 saniye boyunca (tavlama) - 72 ° C 30 saniye (uzatma) </li><li> Termal döngü içinde PCR tüpleri yerleştirin ve bisiklet programını başlatın. </li><li> Döngüleri bitirmek sonra eşik döngüsü veya C T değeri toplayın. Eşik döngüsü ΔRn bir istatistiksel olarak anlamlı artış ilk tespit edildiği döngüdür. </li></ol> 2.3. Veri Analizi <ol><li> Generatadet standart eğri C T okuma kullanarak ve telomeraz aktivitelerini karşılaştırmak. </li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Telomer uzunluğu stresli ve yaşlanma hücre incelemek için eşsiz bir hücresel işaretleyici sağlar ve yaşlanma mekanizmaları irdeliyoruz. Yaşlanma rolü ilk önerilmiştir olmadığından, çalışmalar çok sayıda yaşı telomer uzunluğu ile yapılmıştır, uzun ömürlü, yaş ile ilgili hastalık, kanser ve stres. On yıllardır, telomer uzunluğu ölçümleri altın standart Güney melezleme kullanarak terminal kısıtlama parçası analizi oldu. Ancak, son zamanlarda Cawthon tarafından, ekonomik, hızlı ve gerçekleştirmek için kolay bir yöntem geliş...

Telomer kromozomların uçlarında bulunan DNA hexamer (TTAGGG) dizileri tekrarlıyor. Her hücre çoğaltma, bu kromozom uçları kısalır. Onlar çok kısa kalırsanız, kromozomların telomer sonunda füzyon, anormal rekombinasyon ve bozulma tabi olabilir. Bu nedenle yeterli telomer uzunluğu bakım kromozom istikrar ve hücre koruma 38 önemli bir rol oynar. Telomer uzunluğu bakım da kromozom uçları yanında bulundu genler için çok önemlidir, çünkü DNA replikasyonu kromozom 1-2 sonuna kadar devam edemez. Sonuç olarak, telomer kısalması önlenmesi hücre istikrarı artırabilir. Çeşitli çalışmalar telomer uzunluğu, 3-4, diyabet 5 ve kalp-damar hastalıkları 6,7 kanser gibi bir organizmanın uzun ömür ve hastalıklı devlet ile ilişkili olduğunu bildirmişlerdir. Ayrıca, kısaltılmış telomer aşırı stres ya da bir ile ilişkilendirilmiştirbelki erken hücre yaşlanma ve ölüm 9 teşvik ederek sağlıksız yaşam tarzı 8,. Öte yandan, bazı çalışmalarda hastalık 39, 40, 41 ilgili telomer uzunluğu ve uzun ömür ve yaş arasında anlamlı bir fark olduğunu bulduk. Telomer kısalması korunma hücrenin doğal mekanizmalardan biri kendi enzim telomeraz ters transkriptaz (TERT) aktive gereğidir. Bu enzim ve alt birimi, telomeraz RNA (TERC), bir kodlayıcı olmayan RNA, 10 sona erer kromozom telomer tekrar eklemek için bir şablon olarak telomer kullanın. Telomeraz aktivitesi hücreleri ve diğer mekanizmalar çeşitli telomer uzunluğu bakım katılan eksik olmasına rağmen, artan telomeraz aktivitesi artmış telomer uzunluğu ile ilişkilidir. Telomeraz aktivasyonu hücre hasarına cevap ve stres ve erken yaşlanma ve ölüm önlemek hangi mekanizmalardan biri olarak kurulmuştur. Örneğin, daha uzun telomeres olağanüstü ömrü 11 ile Aşkenazi Yahudilerin bir popülasyonda gösterildi, TERC veya TERT mutasyonlar yaşa bağlı hastalık 13 üzerinde bir etkiye sahip olduğu gösterilmiştir ölümcül hastalığı 12 ve telomeraz epigenetik düzenleme katkıda gösterilmiştir. Yılında keşfedilmesinden bu yana, telomer uzunluğu çeşitli hayvan modellerinde hem de insanlarda sağlık durumu için bir belirteç olarak önerdi, ancak kullanılan yöntem, sıkıcı uzun ve pahalı olduğu için bu ilk çalışmalarda yaygın olarak çoğaltmak için zordu edilmiştir. 2002 daha 2009 yılında ayarlanmış olarak, Cawthon önerilen ve telomer uzunluğu değerlendirmek ve daha fazla yaşlanma ve hastalık 19, hücre biyolojisi çeşitli yönleri rolünü araştırmak için yeni, doğru, hızlı ve basit bir PCR tabanlı protokol gösterdi. Bir çalışma için doğru telomer ölçüm metodu seçilmesi esastır. Şu anda, telomer uzunluğunu ölçmek için kullanılan çeşitli yöntemler kendi her vardıravantaj ve dezavantajları. A: Geleneksel olarak, telomer uzunluğu içerir terminal sınırlama parçaları Southern Blot analizi (TRFs) kullanılarak ölçülür. b TRFs elde etmek için tekrar telomer kesilmiş olmayan kısıtlama enzimleri ile DNA sindirici. Bu TRFs Southern Blot bir telomerik prob 14, 37 kullanılarak ortalama TRF uzunluğunu belirleyerek yapılır. Bu yöntem, bir varyasyon katsayısı ile son derece küçük bir doğru olmasına rağmen, doğrudan bir ölçüsüdür ve uzunluk dağılımı ölçmek için avantajlı olabilir, TRF analizi, emek yoğun maliyetlidir ve DNA bölgesinin en az 3 mg gerektirir. Bu yöntem prob tarafından nedeniyle (TTAGGG) n onlar, 42 15 içeren dizileri gibi tespit edilebilir subtelomerik DNA, karmakarışık hale olabilir kısa telomer ve uzunluk tayin duyarsız. Telomer uzunluğu ölçüm başka bir derece doğru bir yöntem Tek Telomer Uzama Uzunluk Analizi (STELA), bir singl olduğusadece DNA küçük bir miktar gerektirir E molekülü PCR tabanlı bir yöntemdir. Bu yöntemde, primerler kromozom sonunda G-zengin çıkıntı tanımak için ve belirli bir kromozom telomer güçlendirir bir kromozom üzerinde eşsiz bir subtelomerik sekansına bağlanmak için yapılır. Elde edilen amplifikasyon sonra Southern Blot tarafından görüntülenmiştir. Bu yöntem son derece doğru olma avantajına sahiptir ve kısa aykırı telomerlerin 16 tespit edebiliyor. Tüm kromozomlar G-zengin uçları ve kullanılabilir bir subtelomerik dizisi yazık ki, telomer uzunluğu sadece belirli kromozom üzerinde ölçülebilir ve bu ölçümlerin hücre 15 tüm telomer uzunluğu temsil olmayabilir. Uygulanmakta olan diğer bir yöntem telomer uzunluğu tespit etmek için, peptit nükleik asit (PNA) probların kullanılmasıdır. In situ Hibridizasyon Kantitatif floresans (Q-FISH) bize st metafaz sırasında telomerlerin görüntülemenizi sağlarbüyüklüklerine orantılı olarak bir PNA prob ile telomerlerin Aining belirli kromozom arasındaki telomer karşılaştırılması izin verir. Bu yöntem aynı zamanda interfaz hücreleri için de kullanılabilir, ancak burada farklı bir kromozom için telomer uzunluğu 17 yaşlı veya seyrek bölünen hücreleri telomer uzunluğu ölçülürken bir sınırlama getirmektedir ki, tespit edilemez. Akış BALIK yerine akım sitometri kullanır ve şu anda klinik ortamda kan hücrelerinin telomer uzunluğu ölçmek için en hassas yöntemdir, ancak çok yetenekli teknisyenler 18 gerektirir. Şu anda, bizim laboratuvarda ortalama telomer uzunluğu ölçmek için standart bir yöntem hassas, duyarlılık yararlanır ve kantitatif gerçek zamanlı PCR kolaylığı. Bu yöntem, aksi olarak üretilen olurdu primer-dimer-türevi ürünlerin sentezini önlemek yeni primerler gelişimi ile telomer uzunluğu ölçme mümkün oldutelomerlerin tekrar doğası gereği tandard testi. Bu tahlil için, telomer uzunluğunun ölçülmesi tek kopyalı gen sayısı için T / S oranı, telomer tekrar kopya sayısı ile temsil edilir. Telomer uzunluğu ve PCR başlangıç ​​aşamalarında esnasında DNA bağlama telomer etiketli primerlerin sayısı arasında doğru orantılı bir ilişki olduğu için, T / S oranı telomer uzunluğu ile doğrudan orantılıdır. T / S oranı Ct fark karşılaştırılarak ölçülür, örnek floresans birikmiş hangi fraksiyonel döngü sayısı telomer astar ile örnekleri ve astar 19 SCG arasında, taban floresans yukarıda birkaç standart sapma bir eşiği geçer. Bu yöntem, kromozom mükerrer veya kopya sayısı varyasyonları 15 durumunda, yanlış ölçümlere yol açabilir telomer uzunluğu dolaylı ölçümü, örneğin için eleştirilmiştir. Ayrıca, çalışmalar arasında karşılaştırma genellikle di olanfficult, ancak standart oligomerler mutlak telomer uzunluğu 20 ölçmek için geliştirilmiştir. Bu yöntem, tek renkli çok katlı qPCR testi kullanılarak, Cawthon tarafından üzerine geliştirilmiş daha da ileriye edildi. Bu deneyde, PCR primer-dimer bağlanma önlemek için ilk birkaç devir için daha düşük sıcaklıklarda gerçekleştirilir ve telomer ve kontrol geni daha fazla hata önlemek için, aynı PCR tüpü içinde analiz edildi. Ortaya çıkan telomer uzunluğu ölçümleri güçlü TRFs Southern blot analizi ile ölçülen telomer uzunluğu ile ilişkilidir ve yüksek doğruluk 15, 19, 36 oldu. Şu anda, QRT-PCR büyük çaplı test etmek için kullanılabilen tek uygun yöntem olup tek yürütmek için DNA küçük bir miktar gerektirir. Bu yöntemin çok önemli bir bölümü, bu doğru bitince, bu yöntem telomer uzunluğu hakkında değerli karşılaştırmalı bilgi sağlayabilir, böylece kapsamlı kalite kontrol önlemleri olduğunu. Buna ek olarak, bu yöntem ölçmek için lökositlerin dışında kullanım için adapte edilmişfarklı çok çeşitli dokulardan 42 telomer uzunluğu. Ayrıca, daha da telomer boyu bakım ve iki karşıt etkileri (telomeraz enzimi tarafından çoğaltma ve uzama sırasında yani telomer kısalması) arasındaki etkileşimleri arkasındaki biyoloji anlamak için, biz telomeraz aktivitesini ölçer ek yöntemi ile telomer uzunluğu yöntemi eşlik etti. Bu amaçla, bir Telomer Tekrar amplifıkasyon protokolü, bir in vitro deney kullanılabilir. Kısaca, lize, konserve, enzimatik olarak aktif hücrelerin telomeraz kullanılarak bir oligonükleotid alt tabaka üzerine telomerik tekrar sentezlenir ve ürünlerin SYBR Green mevcudiyetinde PCR ile amplifiye edildi. Sonuçlar daha sonra örnek karşılaştırma ve kontrol Ct eşik değerleri ile analiz edildi. Telomeraz bir ısıya duyarlı enzim olduğundan, ek bir ısı kontrol tedavi her bir örnek 21 ile birlikte çalıştırılır. <p class=&quot;Jove_content&quot;&gt; telomer uzunluğu ölçme yaşlanma ve hastalığın patofizyolojisinde telomer uzunluğu olası rolüne değerli bilgiler sağlayabilir iken, telomer uzunluğu bir statik özellik ve daha fazla bilgi değildir telomer fonksiyonu anlamak için gereklidir. Telomeraz aktivite çalışmaları telomer uzunluğu düzenleme mekanizmaları hakkında bilgiler ekleyebilirsiniz. Örneğin, telomeraz kontrollü aktivasyonu telomer uzunluğu ve hücre çoğalmasını sürdürmek olabilir, ancak telomeraz kontrol dışı bir etkinleşme kansere neden olabilir. Birlikte bu iki ucuz ve yalındır yöntemleri telomer uzunluğu ve hücre istikrar arasında bir ilişki doğru daha güçlü kanıtlar değil, aynı zamanda telomer kısalması ve kurtarma olası mekanizmaları içine daha fazla anlayış ile sadece sağladı. Bu yöntemler ile, daha da merkezi mechanis daha iyi anlaşılması nihai hedefi ile yaşlanma ve hücre çoğalması çeşitli devletlere hücrenin cevabı aydınlatmak için umuthücre biyolojisi ms.

<table><tbody><tr><td>Kantitatif Telomeraz Tespiti </td><td>Allied Biotech</td><td>MT3012</td><td></td></tr><tr><td>Qiagen DNeasy Kiti</td><td>Qiagen</td><td>69506</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 480 SYBR Green I Master, LightCycler 480 Instrument Roche Diagnostics 4707516 kullanılarak SYBR Green I tabanlı gerçek zamanlı PCR için kullanıma hazır sıcak başlatma reaksiyon karışımı</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

telomer uzunluğu ve telomeraz aktivitesi, hücre yaşlılık bir yin ve yang

Telomere Length and Telomerase Activity; A Yin and Yang of Cell Senescence

Telomer ucunda DNA dizileri tekrarlıyor uzunluğunda ve insanlarda çeşitlidir kromozom 15.000 baz çifti uzunluğunda ulaşabilirsiniz biter. Telomer her hücre bölünmesi de kromozom yıpratma Bio koruyucu mekanizması olarak hizmet vermektedir. Belirli bir süre de, telomerlerin çoğaltma, kromozom istikrarsızlık ya da hücre ölümüne yol açabilir bir süreç sağlamak için çok kısa olur. Yıpratma ve uzama: telomer uzunluğu iki karşıt mekanizmalarla düzenlenir. Her hücrenin bölünmesinden olarak yıpratma oluşur. Buna karşılık, uzama kromozomların uçlarına tekrar dizileri ekler enzim telomeraz, kısmen modüle edilir. Bu şekilde, telomeraz muhtemelen bir yaşlanma mekanizması ters ve hücre canlılığı gençleştirir olabilir. Bu hücre yaşam sürdürmek çok önemli unsurlardır ve hücresel yaşlanma değerlendirmek için kullanılır. Bu yazıda biz birden fazla dokuda telomer uzunluğu değerlendirmek için doğru, kısa, gelişmiş ve ucuz yöntem anlatacağıms ve tür. Bu yöntem, telomer dizisinin tandem tekrar ve test örneklerinin diferansiyel kopya sayıları tespit etmek için Mah-PCR duyarlılığı, iki temel unsuru yararlanır. Buna ek olarak, telomer uzunluğu için tamamlayıcı bir omurga test olarak telomeraz aktivitesini değerlendirmek için basit bir test tarif edecektir.

Telomer uzunluğu QRT-PCR bir örneği Şekil 1&#39;de gösterilmiştir. Sol üst paneli üzerinde, kırmızı ve yeşil İşaretlenmiş örnekler 96 oyuklu plaka üzerine test deneklerin yeri temsil eder. Sağ üst panelinde, kuvvetlenme eğrisinin gösterilmiştir. Her konuda triplicates yapılır iki testleri (Telomer ve Tek Kopya Gen), tarafından test edilir. Seçilen bireylerin iki tahlil içinde üretilen farklı DNA kopya sayısı nedeniyle, floresans algılama kadar çevrim sayısı ve logaritmik eğrisi tahliller arasında farklı...

Doğru, kısa sofistike ve ucuz bir yöntem birden fazla doku ve Mah-PCR kullanarak türlerde telomer uzunluğu değerlendirir olduğu açıklanmıştır. Buna ek olarak, telomer uzunluğu için tamamlayıcı bir omurga test olarak telomeraz aktivitesini değerlendirmek için basit bir test tarif edecektir.

Telomer uzunluğu ve Telomeraz Aktivitesi, Hücre Yaşlılık bir Yin ve Yang

Telomeres  are repeating DNA sequences at the tip ends of the chromosomes that are diverse  in length and in humans can reach a length of 15,000 base ...

Bu prosedürün genel amacı, birden fazla doku ve türde telomer uzunluğunu ve telomer aktivitesini değerlendirmek için kısa, doğru ve ucuz bir yöntem sağlamaktır. Bu işlem, öncelikle kantitatif gerçek zamanlı PCR kullanarak telomer uzunluğunun belirlenmesi için genomik DNA'nın izole edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım ise, aynı dokunun hücrelerini telomeraz fonksiyonunu koruyan bir tampon çözeltide izole etmek ve liz etmek ve gerçek zamanlı PCR kullanarak telomerazı kantitatif olarak ölçmektir.Nihayetinde, hem telomer uzunluğunun belirlenmesi hem de telomeraz aktivitesinin saptanması; telomer uzunluğu ile hücre yaşlanması, telomer kısalmasının olası mekanizmaları ve yaşlanmaya karşı geri kazanım yanıtları ile hücre proliferasyonu durumları arasındaki ilişkileri bulmak için kullanılır. Telomer uzunluklarını ve telomeraz aktivitesini ölçmek için hızlı ve kolay bir yol ararken bu yöntemlerle ilk kez tanıştım. Bu tekniğin uygulama alanı, organ durumunu ve genel vücut formunu yansıtan hücre durumu hakkında bilgi vermesi nedeniyle, yaşla ilişkili hastalıkların ve erken ölümün teşhisine kadar uzanmaktadır.Bu prosedürü laboratuvar teknisyenim Bay Ur Bogo uygulamalı olarak gösterecek. Bu prosedüre başlamak için, son adımda özellikle kan kaynakları için formüle edilmiş Qiagen DNE kitini kullanarak denekten DNA izole edin. DNA'yı PCR grade suda elüye edin ve konsantrasyonu bir spektrofotometre kullanarak ölçün.Ardından, tek kopya gen veya SCG kontrolü ve telomerler için OC Callahan ve ark. tarafından açıklanan şekilde, primerleri mikrolitre başına 100 pikomol olacak şekilde seyrelterek stok PCR primerlerini hazırlayın. Primerler yeniden hidrate olurken, PCR derecesi su kullanarak izole edilen DNA'nın seri dilüsyonlarını hazırlayın. Stok DNA'yı, telomer reaksiyonları için mikrolitre başına 6,1 nanogram ve mikrolitre başına 1,8 nanogramlık en yüksek konsantrasyonlara ulaşana kadar PCR derecesi su ile seyrelterek başlayın.SCG reaksiyonları için, bir sonrakine geçmeden önce dilüsyonun en az 15 dakika boyunca bekletilmesine izin verin. 15 dakika sonra, burada gösterilen tabloya göre bir sonraki dilüsyonu hazırlayın. Bu işlemi listedeki her dilüsyon için tekrarlayın.Ardından, PCR reaksiyonlarını standart bir PCR plakasına kurun. Her örnek ve SCG kontrolleri üç tekrarlı olarak çalıştırılır. Önce, her kuyucuğa altı µL PCR sınıfı su ekleyin, ardından 10 µL cyber green reaksiyon karışımı ekleyin.Ardından, primerleri burada gösterilen miktarlarda ilgili kuyucuklara ekleyin. Sonra, stok primerlerin her birinden alınan bir alikotu, final konsantrasyon 10 picomoles per microliter olacak şekilde PCR grade su ile on kat daha seyreltin. Son olarak, seri seyreltilmiş DNA'dan iki microliter'ı ilgili kuyucuklara ekleyin ve içeriği mühürlemek için plakayı yapışkanlı plastik bir tabaka ile kapatın.Ardından plakayı real-time PCR cihazına yerleştirin. Sonrasında, Roche LightCycler 480 cihazında, 95 °C'de 10 dakikalık denatürasyon adımıyla başlayan bir program hazırlayın; ardından 95 °C'de 10 saniye, 60 °C'de 5 saniye ve 72 °C'de 11 saniye olacak şekilde döngüyü başlatın.Toplam 50 döngü boyunca, her döngüden sonra cyber green ölçümleri gerçekleştirin. Ardından, termosaykler işlemi tamamladığında programı başlatın. CT hattını eksponansiyel eğrinin başlangıcına ayarlayın ve her örneğin eşik hattını geçtiği döngü değerlerini kaydedin.Ardından, telomer ve tek kopya gen örnekleri arasındaki döngü sayısı oranını hesaplayın. Telomer, her döngüde amplifiye olacak birden fazla bölgeye sahip olduğundan, telomer CT değerleri tek gen kopya sayısından daha küçük olacak ve bu da birden küçük bir oranla sonuçlanacaktır. Son olarak, tek gen kopya oranı birim başına bir telomerin 4.270 ortalama telomer uzunluğuna eşdeğer olduğu Terry ve ark. tarafından yapılan çalışmaya dayanarak telomer uzunluğunu hesaplayın.Lökositlerdeki baz çiftleri için telomeraz aktivite ölçümleri gerçekleştirirken, ölçümlere başlamak için Allied Biotech'in kantitatif telomeraz tespit kitini kullanın; 10⁵ ila 10⁶ adet periferik kan hücresi toplayın ve bunları PBS ile yıkayın. Ardından, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 500 ×g'de çöktürün. Sonrasında, pellet'i assay kitinden gelen 200 µL 1x lizis tamponu içerisinde yeniden süspande edin ve 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin.İnkübasyonun ardından, örnekleri 4 °C'de 30 dakika boyunca 12,000 ×g'de santrifüjleyin. Hücre kalıntılarını çöktürmek için, elde edilen süpernatantın 160 µL'sini yeni bir tüpe aktarın ve geri kalan süpernatantı, tekrar kullanım için -80 °C'de saklamadan önce etanol ve kuru buz banyosunda hızlıca dondurun. Ardından, süpernatantın protein konsantrasyonunu standart BCA analizi ile belirleyin.Toplanan her bir örnek için, telomeraz kitinin çalışma aralığını baz alarak analiz için gereken protein miktarını hesaplayın. Ardından, telomeraz ısıya duyarlı bir enzim olduğundan, negatif kontrol olarak kullanmak amacıyla her örneğin yarısını 85 °C'de 10 dakika inkübe ederek ısı ile inaktive edin. Sonrasında, stok çözeltiyi seri dilüsyona tabi tutarak kantitatif standart eğrisini hazırlayın.TSR Oligonükleotid stok çözeltisini, lizis tamponu kullanarak bir e beşe seyreltme oranında beş kat seyreltin. TSR Oligonükleotidlerin dizileri telomer primerleri ile aynıdır ve konsantrasyonları bilinmektedir. Ardından, örnek başına 12,5 µL iki x kantitatif telomeraz tespit ön karışımı ve 11,5 µL PCR grade su içeren ana karışımı hazırlayıp karıştırın.Ardından, kullanılan her tüpe 24 µL master mix pipetleyin. Master mix dağıtıldıktan sonra, kuyucuklara standart, ısı ile aktive edilmiş örnek veya normal örnekten oluşan her bir şablondan 1 µL ekleyin. Sonrasında, plakayı yapışkan plastik bir örtüyle kapatın ve örnekleri vorteksleyerek karıştırın.Ardından bunları gerçek zamanlı PCR tespit sistemine yerleştirin. PCR programını 25 °C'de 20 dakika boyunca başlayacak şekilde ayarlayın. Bu süre zarfında telomeraz reaksiyonu gerçekleşecektir.İlk PCR aktivasyon adımı için bunu 95 °C'de 10 dakika boyunca uygulayın. Ardından, 25 °C'de 20 dakika boyunca eklenen telomer şablonlarını amplifiye etmek için 95 °C'de 30 saniye, 60 °C'de 30 saniye ve 72 °C'de 30 saniyeden oluşan 40 döngü gerçekleştirin.Son olarak programı çalıştırın ve her bir örnek için eşik döngü değerlerini toplayın. Ardından, CT değerlerini kullanarak bir standart eğri oluşturun ve bunu gösterilen örneklerdeki telomeraz aktivitesini hesaplamak için kullanın.Burada 65 yaşındaki bir deneğin gerçek zamanlı PCR sonuçları yer almaktadır. Parlak kırmızı çizgilerle temsil edilen telomer geni, yaklaşık 27 döngüden sonra eksponansiyel eğrisine ulaşmaktadır. İkinci çizgi seti, genomda yalnızca tek bir kopyası bulunan ve bu nedenle kırmızı çizgilerle temsil edilen telomer örneklerinden daha az kopyaya sahip olan tek kopya gen amplifikasyonunu temsil etmektedir.Ayrıca, tek kopya gen yaklaşık 31 döngüden sonra eksponansiyel eğrisine ulaşır. Kahverengi çizgiler, bilinen örnek konsantrasyonlarının seri dilüsyonuna dayalı 33 standart eğriyi temsil etmektedir. Konsantrasyon logaritmasının eşik değerlerine karşı standart eğrisi burada gösterilmiştir.Düz bir çizgi, seri dilüsyonun doğru şekilde ölçüldüğünü ve yüklendiğini doğrular. Gerçek zamanlı PCR analizinin sonuçları daha sonra telomer uzunluğunu tahmin etmek için kullanılır. Bir telomer/tek gen kopya sayısı oranı birimi, lökositlerde ortalama 4.270 baz çiftlik bir telomer uzunluğuna eşdeğerdir ve bu verilerden elde edilen 0,87'lik oran, bu yaştaki bir kişi için orta uzunlukta olan ortalama 3.715 baz çiftine karşılık gelir.Kantitatif gerçek zamanlı PCR analizlerinden elde edilen sonuçlar kullanılarak, telomer aktivitesi ile telomerin tek gen kopya sayısı oranı arasındaki ilişki açıklanabilir. Bu grafik, geliştirilmesinin ardından iki analiz arasında güçlü bir ilişki olduğunu göstermektedir. Bu teknik, yaşlanma alanındaki araştırmacıların model organizmalarda, hasta demografisinde ve organ sistemlerinde hücresel yaşlanmayı (senesans) incelemelerinin önünü açmıştır.

telomere-length-telomerase-activity-yin-yang-cell

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Telomeraz yenidoğan beyninde ve ayrıca yetişkin beyninin farklı bölgelerinde ifade edilir. Fare beyninin çeşitli bölgelerindeki telomeraz aktivitesinin analizi ve erkek ve dişi fare beyinleri arasındaki telomeraz aktivitesindeki farklılıkların tespiti için toksik olmayan, zaman kazandıran bir TRAP testi sunuyoruz.

Fare Beyin Çeşitli Bölgelerinde Telomeraz Aktivite: Radyoaktif olmayan Telomeraz Amplifikasyon Protokolü tekrarlayın (TRAP) Deneyi

Telomer ve telomeraz yaşlanma ve tümör oluşumunda önemli roller oynar. Bu protokolün amacı, murin ile indüklenebilir iki telomeraz knock-in alelinin nasıl oluşturulacağını ve bunların doku dejenerasyonu/rejenerasyonu ve kanser çalışmalarında nasıl kullanılacağını göstermektir.

Doku Dejenerasyonu / Yenilenme ve Kanser Araştırmaları Murin İndüklenebilir Telomeraz allelleri kullanılması

Bu makalede, telomer uzunluğunun hızlı ve etkin bir şekilde doğrudan ölçülmesini sağlayan, modifiye edilmiş bir terminal kısıtlama fragmanı analizi kullanarak telomer uzunluğunun nicelleştirilmesi için ayrıntılı bir protokol tartışılmıştır. Bu teknik telomer uzunluğunu ölçmek için çeşitli DNA hücreleri kaynaklarına uygulanabilir.

Jel Hibridizasyonunu Kullanarak Telomer Uzunluğunu Nicellemek İçin Modifiye Terminal Restriction Fragment Analysis

Burada, tampon miktarları ve prob konsantrasyonları gibi TAGGG telomer uzunluğu tahlil kitinin çeşitli performans parametrelerinin optimizasyonuna odaklanarak, radyoaktif olmayan kemilüminesan tespiti kullanarak telomer uzunluğunu ölçme protokolünü ayrıntılı olarak açıklıyoruz.

TAGGG Telomer Uzunluk Testi'nin Performans Parametrelerinin Optimizasyonu

Burada, monokrom multipleks kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (MMqPCR) testi kullanılarak bağıl telomer uzunluğunun (TL) ölçümü için bir protokol sunuyoruz. MMqPCR testi, popülasyon temelli çalışmalarda insan DNA'sından TL ölçümü için tekrarlanabilir, verimli ve uygun maliyetli bir yöntemdir.

Monokrom Multipleks Kantitatif PCR Telomer Uzunluğu Ölçümü 

Telomeraz katalitik altbirim izole etmek için çabalar, TERT, yapısal çalışmalar için yeterli miktarda, bir on yıl daha sınırlı bir başarı ile yerine getirildiğini var. Burada, rekombinant Tribolium castaneum TERT izolasyonu (yöntemleri...

Active T. in vitro Sulandırma castaneum Telomeraz

Biz büyük bir tedarik kardiyovasküler onarım için insan kalp atalarıdır ve fonksiyonel kardiyomiyositlerde türetilmesi sağlayan küçük moleküller ile tanımlanmış koşullar altında tutulan pluripotent insan embriyonik kök hücreleri doğrudan cardioblasts indüksiyonu için bir protokol kurduk.

Küçük Molekül İndüksiyon Pluripotent İnsan Embriyonik Kök Hücreleri İnsan Kardiyak Öncüleri ve kardiyomiyositlerde Verimli türetilmesi

ECIS / Taksiler sistemi hücresel kemotaksis ölçer otomatik, gerçek zamanlı bir testtir. Bu deneyde, bir hedef hücreler elektrot varmak için agaroz bir katmanı altındaki hareket eder. Hücresel hareketi AC akım 0 direnç başlangıcı ile ölçülür.

ECIS / Taksiler ile Hücresel Kemotaksis Ölçümü

Yaygın olarak kullanılan, in vitro olarak hücre göçü ve işgali incelenmesi için oldukça erişilebilir yöntemler tarif edilmiştir. Birinci yöntem, hücre motilitesini büyüklüğüne hücre yara kapatma deneyidir. İkinci yöntem kemotaktik ve hücrelerin invaziv kapasitesini değerlendirir transwell göç ve istila testtir.

Vitro Hücre Göç ve Invasion Tahliller

DNA metilasyonu, çeşitli uyaranlara yanıt olarak gen ekspresyonunda dinamik değişikliklere izin vermenin yanı sıra, gen ekspresyonunun stabil seviyelerini koruyabilir. DNA metilasyonundaki gene özgü değişikliklerin ve bu değişikliklerin gen ekspresyonu üzerindeki etkisinin incelenmesine izin veren teknikleri detaylandırıyoruz.

Gen spesifik ifadesi ile DNA Methylation değişiklikler astrositik transkripsiyonel Aktivite ilişkilendirilmesi<em&gt; KCNJ10</em&gt; (Kir4.1)

Öğrenin, qRT-PCR kullanarak çeşitli dokularda telomer uzunluğu ve telomeraz aktivitesini nasıl değerlendireceğinizi. Bu yöntem, hücre yaşlanması ve yaşlanmaya bağlı hastalıkların anlaşılmasına katkı sağlar.

Telomer uzunluğu ve Telomeraz Aktivitesi, Hücre Yaşlılık bir Yin ve Yang

Daha fazla video keşfet