Kullanarak İzleme Dendritik Hücre Göç ¹⁹ F / ¹ H Manyetik Rezonans Görüntüleme

Aşağıdaki deneyin genel amacı, konvansiyonel proton MRG ile kombinasyon halinde non-invaziv flor manyetik rezonans görüntüleme veya MRG kullanarak dendritik hücrelerin drenaj lenf noduna göçünü görselleştirmektir. Bu, önce murin kemik iliği türevli dendritik hücrelerin hazırlanması ve tamamen farklılaşmış hücrelerin flor açısından zengin partiküllerle işaretlenmesiyle elde edilir. İkinci aşamada, flor etiketli hücreler, bir farenin arka bacaklarına deri içi olarak uygulanır ve uygulanan hücrelerin verimli bir şekilde transmigrasyonunu sağlar.

Daha sonra, ilgilenilen anatomik bölge, dendritik hücrelerin deriden drenaj lenf düğümlerine göçünü izlemek için flor, proton MRI ile görüntülenir. Sonuç olarak, uygulama alanından drene lenf noduna dendritik hücre göçü flor MRG ile görüntülenebilir. Bu yöntemin, demir oksit nanopartikülleri gerektirenler gibi diğer hücre izleme tekniklerine göre en büyük avantajı, karbon bağlı döşemenin tüm canlı organizmalarda neredeyse hiç olmamasıdır.

Bu, flor etiketli hücrelerin in vivo olarak uygulanmasının ardından tam arka plansız görüntüler ve tam bir hücre seçiciliği sağlar. Bu yöntem, in vivo olarak dendritik hücrelerin göçünde moleküler adayların etkisinin ne olduğu gibi immünoloji alanındaki soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Yöntemi gösteren, teknisyen Yulia Kovski ve laboratuvarımdan kıdemli bir bilim adamı olan Helma VII'ler Kemik iliği dendritik hücre kültürünün 10. gününde.

Dendritik hücreleri 24 saat boyunca LPS ile aktive edin. Dendritik hücrelerin başarılı bir şekilde etiketlendiğini doğrulamak için bu süre zarfında da floro 15 taç beş eter parçacığı başına bir milimolar flor açısından zengin bir milimolar flor ile etiketleyin, akış sitometrisi kullanarak hücrelerin fiziksel kimyasal özelliklerini kontrol edin. Flor etiketli hücreler burada ileri ve yana doğru saçılma grafiğinde kırmızı olaylar olarak gösterilir ve etiketlenmemiş hücreler mavi olaylar olarak gösterilir.

Bir sonraki pozisyonda, bir tutucuya bir C 57 siyah altı fare yerleştirin ve ardından 50 ila 100 mikrolitrelik bir hacimde floresan etiketli dendritik hücrelere sahip 26 buçuk gauge iğne ile 0,5 mililitrelik bir tüberkülin şırıngası yükleyin. Şimdi iğneyi, hücreleri uygulamak için hayvanın arka bacaklarının her birindeki derinin üst katmanlarına dikkatlice yerleştirin. Fareyi uyuşturduktan sonra, hayvanı küçük hayvan MR Scanner'ın fare yatağına yüzüstü yatırın.

Hayvanı görüntüleme tutucusuna ve izleme sistemine olan bağlantılara sabitledikten sonra, hayvanın ve tarayıcının doğru konumlandırıldığını doğrulamak için tutucuyu proton flor RF bobininin merkezine getirin. Ve daha sonra görüntü dilimi geometrisinin planlanması. MR Tarayıcı yazılımında hızlı ve düşük çözünürlüklü görüntü elde etme yöntemlerini kullanarak üç standart oryantasyonda keşif görüntüleri elde edin.

RF bobinini proton rezonans frekansına ve flor rezonans frekansına ayarlayın. Bobinin karakteristik empedansını 50 ohm ile eşleştirmek için hayvan MR Tarayıcının ayar monitörünü kullanın. Ardından, RF'yi protonlar ve referans kazancı için MR sisteminin spesifik LA frekansına ayarlamak için manyetik alan sistemi frekans ayarlarının homojenliğine ince ayar yapmak için şimleme dahil olmak üzere gerekli otomatik sistem ayarlarını yapın.

RF genliğini ayarlamak için, proton taraması için 1500 milisaniyelik bir TR ve 53 milisaniyelik TE, 400 x 200 x 200'lük bir matris ve 16'lık nadir bir faktör kullanarak turbo nadir bir 3D protokolü ayarlayın. Keşif görüntülerinin yardımıyla görüş alanını ayarlayın. Ardından taramayı başlatın.

TR değeri en az 1000 milisaniye olan tek bir darbeli FID dizisi yükleyin ve ardından düzenleme taramasını açın ve araç kutusunun düzenleme yönteminde çekirdeği flor olarak ayarlayın. Go kurulumunu kullanarak otomatik referans kazancının seçimini kaldırın. Gerçek zamanlı olarak bir MR sinyali görüntülemek için verileri kaydetmeden ölçümü başlatın.

Edinme penceresinde flor spektral tepe noktasını sıfır hertz'de ortalamak için temel frekansı ayarlayın. Ardından seçin, temel frekansı uygulayın ve şimdi durdur'a basın. Önceki proton taramasından turbo nadir 3D protokolünü klonlayın.

Düzenleme yöntemine gidin ve ardından düzenleme taramasında gösterildiği gibi otomatik referans kazancının seçimini kaldırın. Flor çekirdeğini ayarlayın ve ardından matrisi 1 28 x 64 x 64 ve nadir faktörü en az 40 olarak değiştirin. Taramalar bittiğinde, fare tutucuyu MR tarayıcıdan geri çekin ve flor görüntülerini proton görüntülerine yerleştirmek için görünüm menüsünü kullanın.

Fareyi kurban ettikten sonra, ilgilenilen popal lenf düğümünü çıkarın ve 100 mikrolitre% 2 PFA içeren beş milimetrelik bir NMR tüpüne yerleştirin. Ardından, tüpü bir flor spektroskopisi bobininin içine yerleştirin ve bobini mıknatısın ISO merkezine hareket ettirin. RF bobinini flor rezonans frekansına ayarlayın ve ardından hayvan MR Tarayıcısının ayar monitöründe, bobinin karakteristik empedansını şimleme araç kutusu içinde 50 ohm ile eşleştirin.

Tüm dolgu parametrelerini sıfıra ayarlayın ve uygula'ya basın. Ardından, en az 1000 milisaniyelik bir TR ile tek bir darbe FID dizisi yükleyin. Açmak, düzenlemek, taramak ve çekirdeği flor olarak ayarlayın.

Şimdi go kurulumunu kullanarak, diziyi başlatın, temel frekansı, flor spektral tepe noktası sıfır hertz'de alım penceresinin merkezinde olacak şekilde ayarlayın ve temel frekansı uygulayın. Ardından, 90 derecelik uyarmaya ulaşmak için sinyali en üst düzeye çıkarmak için nabız zayıflatıcısını tekrar ayarlayın. Sinyal maksimuma ulaştığında durdur düğmesine basın.

Son olarak, düzenleme yönteminde, sinyale bağlı olarak ortalamaları 64 ile 256 arasında ayarlayın ve ardından go pipeline'ı kullanın. Deri içi uygulamadan 18 ila 21 saat sonra alıma başlayın. Flor işaretli dendritik hücreler, drene olan popal lenf noduna göç eder.

Dendritik hücrelerin lenfatik kanallar yoluyla drene olan publical lenf noduna hareketi, proton anatomik görüntülerinin flor dendritik hücrelerle üst üste bindirilmesiyle takdir edilebilir. Görüntülerde, dendritik hücreler flor MR olarak gösterilmiştir. Sinyal kırmızı renktedir, lenf düğümleri ve lenfatik kanallar ise proton anatomik MR görüntüsünde gri ölçekte gösterilmiştir. Boşaltılan lenf düğümlerine dendritik hücre göçünün derecesini ölçmek için, lenf düğümleri ekstrakte edilir ve her bir lenf düğümünden elde edilen flor sinyali, bu kalibrasyon eğrisi ile gösterildiği gibi floro başına 15 taç beş eter partikülü ile etiketlenmiş farklı sayıda dendritik hücreden elde edilen flor sinyali ile karşılaştırıldığında, gösterildiği gibi flor MRS gerçekleştirilir, Bu temsili deney için boşaltılan lenf noduna ulaşan flor işaretli dendritik hücrelerin sayısı çıkarılabilir.

Antijen yüklü olmayan dendritik hücrelerin 7.5 katı 10 üzeri dördüncü dendritik hücrelerin sol lenf noduna, 3.6 kere 10 üzeri beşinci antijen yüklü dendritik hücrelerin ise sağ lenf noduna ulaştığı tahmin edilebilir. Bu konular, normal koşullar altında bağışıklık hücresi göçünün moleküler mekanizmaları hakkında fikir verebilse de, otoimmün hastalıklar gibi hayvan modellerinde de kullanılabilir. Ayrıca, bu tekniğin etkileri kanser tedavisi alanına kadar uzanır.

Tanımlanmış herhangi bir moleküler hedef, tümör tedavisi için dendritik hücreleri manipüle etmek için kullanılabilir.