Bir ev yapımı Çift kızdırma Lusıferaz Testi kullanarak yüksek verim Fonksiyonel Taraması

Bu prosedürün genel amacı, basit bir yüksek verimli transfeksiyon protokolü ve ev yapımı bir çift kızdırma lusiferaz testi kullanarak ilgilenilen herhangi bir genin transkripsiyonel düzenleyicilerini tanımlamaktır. Bu, önce benzersiz bir çift lusiferaz raportör plazmit setinin tasarlanması ve klonlanmasıyla gerçekleştirilir. Bu plazmitler, bir DNA ekspresyon kütüphanesinden plazmitlerle mikroplaka içinde 2 9 3 T hücrelerine transfekte edilir, böylece her bir kuyucuk tek bir kütüphane plazmidi ile transfekte edilir.

48 saat sonra, Firefly lusiferaz aktivitesi test edilir, ardından vanilya lusiferaz aktivitesi testi yapılır. Son adım, firefly - vanilya lusiferaz aktivite oranlarını hesaplamaktır. Sonuçta, her bir kütüphaneye yanıt olarak ilgilenilen genin göreceli indüksiyonu.

Gen, plaka bazlı normalizasyondan sonra her bir kuyucukta ateşböceğinin vanilya lusiferaz aktivitesine oranı ile çıkarılır. Bu tekniğin mevcut raportör tahlil protokollerine göre en büyük avantajı, minimum insan gücü ve maliyetle çok sayıda gen için hızlı bir şekilde fonksiyonel veri üretme yeteneğidir. Ekranın birinci günü olarak belirlenen transfeksiyondan bir gün önce, 2 9 3 T hücresi 96'ya oturtulur.

Kuyucuk plakaları hücreleri boyutlandırılır, sayılır ve mililitre başına 10 ila beşinci hücrelerin 1.5 katı bir konsantrasyona yeniden süspanse edilir. % 14 FBS içeren DMEM'de hücreleri steril bir rezervuara dökün. Rezervuarı, altı şeffaf tabanlı, 96 oyuklu plakayı ve bir kutu filtre pipet ucunu otomatik sıvı işleyicinin robot güvertesine yerleştirin.

Taranacak her kütüphane plakası için iki hücre plakası oturtulmalıdır. Oyuk başına 1.5 çarp 10 ila dördüncü hücre yoğunluğu için her bir plakanın her bir oyuğuna 100 mikrolitre hücre dağıtın. Bu gösterimde üç kütüphane levhası gösterilecektir.

Bu nedenle, altı hücre plakası hazırlanır, her bir kuyucuk boyunca eşit hücre yoğunluğunu sağlamak için düşük rampa hızları kullanarak hücre plakalarını iki dakika boyunca 50 kez G'de santrifüjleyin. Bu görüntü, kaplanmış hücrelerin santrifüjlemeden sonra nasıl görünmesi gerektiğini göstermektedir. Hücreleri gece boyunca 37 santigrat derecede ve% 10 karbondioksitte inkübe edin.

Ateşböceği ve vanilya raportör plazmitlerini hazırlamak için, 15 mililitrelik konik bir tüpte endotoksin içermeyen suda her birini mikrolitre başına beş nanograma seyreltin. Seyreltmeleri hacimce beş ila üç ateşböceği oranında vanilya plazmidine birleştirin. Kombine plazmitleri, kütüphane plakası başına 17 mikrolitre dağıtan 96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna pipetleyin, ayrıca her bir oyuklu hücreye iki ila 10 mikrolitre fazlalık ekranın ikinci gününde transfekte edilir.

Bu prosedüre başlamak için, her bir kütüphane plakası için 107.5 mikrolitre oda sıcaklığında op kusurunu 4.3 mililitre serum içermeyen ortamla karıştırın, bir polistiren tüpte bir ila 40 seyreltme, oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin, kütüphane plakası başına 44 mikrolitre dağıtın, 96 kuyulu polistiren v tabanlı plakanın her bir oyuğuna. Kütüphane DNA plakasını, seyreltilmiş opt efekt plakasını, raportör plazmid plakasını ve bir kutu pipet ucunu robot güverte aspiratına yerleştirin. 17 mikrolitre raportör plazmit, 43 mikrolitre seyreltilmiş opt etkisi ve 26 mikrolitre kütüphane DNA'sı, her aspirasyon arasına beş mikrolitrelik bir hava boşluğu ekleyerek.

Çapraz kontaminasyonu önlemek için kütüphane DNA'sı en son aspire edilmelidir. Uçların içeriğini yeni bir polistiren v tabanlı plakaya dağıtın, karıştırın, kapatın ve lipid DNA komplekslerinin oluşmasına izin vermek için 20 dakika bekletin. Birden fazla kitaplık plakasını kesiyorsanız, pipet uçlarını ve kitaplık plakasını değiştirin ve 20 dakika sonra tekrarlayın, opt etkili DNA karışım plakasını açın ve tek bir kutu pipet ucu kullanarak 2 9 3 T hücreli iki plaka ile robot güvertesine yerleştirin.

Opt etkisi DNA karışımından 80 mikrolitre aspire edin ve her hücre plakası için kuyu başına 40 mikrolitreyi yavaşça dağıtın. Tüm plakalardaki hücrelere opt etkisi DNA karışımı eklendikten sonra hücrelerin üzerini örtün. Plakaları 30 dakika boyunca 1.200 kez G'de santrifüjleyin.

Plakaları inkübatöre geri koyun ve hücreleri dört ila altı saat inkübe edin. Bu inkübasyon sırasında,% 10 FBS ve mililitre siprofloksin başına 10 mikrogram içeren 12 mililitre DMEM'i karıştırarak taze ortam hazırlayın. Kopyalanan her kütüphane plakası için, taze ortamı steril bir hazneye dökün.

Daha sonra iki kutu robot ucu, tek bir hücre plakası, taze ortam içeren rezervuar ve bir atık haznesini robot güvertesine yerleştirin. Daha sonra hücrelerden 100 mikrolitre ortam aspire edin ve kısmen% 70 etanol ile doldurulmuş atık rezervuarına dağıtın. Taze uçlar kullanarak 100 mikrolitre taze besiyerini aspire edin ve yavaşça hücrelere dağıtın.

Plakaları 48 saat boyunca inkübatöre geri koyun. Ateşböceği ve vanilya lusiferaz tahlilleri yapılır. Her bir kütüphane plakası için ekranın dördüncü gününde transfektten 48 saat sonra, ilgili stok çözeltilerinden sekiz mililitre üç x ateşböceği tahlil tamponu ve 12 mililitre üç x vanilya tahlil tamponu hazırlayın, 82 mikrolitre ateşböceği tahlil tamponu dağıtın her bir kuyucuğuna 96 kuyucuklu V tabanlı bir plaka test edilecek her kütüphane plakası için.

Benzer şekilde, 122 mikrolitre vanilya tahlil tamponunu başka bir 96 kuyu V tabanlı plakanın her bir oyuğuna dağıtın. Tahlil edilecek her plaka için, her iki tahlil tamponunu da bir kenara koyun. Robot güvertesine bir kutu pipet ucu, bir atık haznesi ve aynı kütüphane plakasından transfekte edilmiş iki hücre plakası yerleştirin, her plakadan 60 mikrolitre ortam aspire edin ve kısmen %70 etanol kapak plakaları ile doldurulmuş atık haznesine atın ve bir kenara koyun.

Sonra iki kutu pipet ucu yerleştirin. Üç x ateşböceği tahlil tamponu plakası ve robot güvertesinde bir dizi hücre plakası. 40 mikrolitre üç x ateşböceği tahlil tamponunu aspire edin ve iyice karıştırarak ilk hücre plakasına ekleyin.

Yeni pipet uçlarına geçiş. İkinci hücre plakası için tekrarlayın. Lizizi tamamlamak için hücreleri 10 dakika oda sıcaklığında tutun.

Her bir hücre plakasının her bir oyuğundan gelen lüminesansı, kuyucuk başına bir saniye boyunca kayıt yaparak luminometreye kaydedin. Plakaları robot güvertesine geri koyun. Robot güvertesine iki kutu pipet ucu, üç x tahlil tamponu plakası ve bir dizi hücre plakası yerleştirin.

60 mikrolitre üç x vanilya tahlil tamponunu aspire edin ve ilk hücre plakasına ekleyin. İyice karıştırın. Yeni bir pipet ucu kutusuna geçme.

İkinci hücre plakası için tekrarlayın. Bir luminometredeki tüm plakalardan gelen lüminesansı kaydedin. Her kuyuyu bir saniye boyunca kaydedin.

Tek bir yarım plaka için tipik lusiferaz değerleri bu tablolarda gösterilmiştir. Her bir kuyucuk için ateşböceği yenileme lüminesans oranı veya F iki R oranı, ateşböceği sinyalinin sayımlarının çalışan yenileme sinyalinin sayımlarına bölünmesiyle hesaplanır ve sonuçlar Panel C'de gösterilir. kuyuların en yüksek ve en düşük% 25'i hariç. İndüksiyon değerlerinin, tek bir transfekte edilmiş kütüphane plakası için kopyalar arasında ortalaması alınmalıdır.

Ve alfa sinükleini üç kattan fazla indükleyen veya baskılayan genler isabet olarak kabul edilir. Burada gösterilen bu temsili sonuçtaki H iki kuyusundaki 32 katlı indükleyicinin, H iki kuyusu mavi ile vurgulanmış tek plaka için indüksiyon değerlerinin grafiksel bir temsili olduğuna dikkat edin. Hi.H iki, daha önce alfa sinüklein ekspresyonu ile ilişkili olmayan bir nöronal transkripsiyon faktörüdür.

Ekranın, raportör tahlillerinin doğrusal aralığı içinde gerçekleştirildiğini doğrulamak önemlidir, böylece artan ekspresyona neden olan klonlar, bu uç hücrelere artan miktarlarda ateşböceği ve vanilya lusiferaz plazmitleri ile transfekte edildi. Bu protokol ile ateşböceği aktivitesinin geniş bir değer aralığı boyunca doğrusal kaldığı gözlemlenmiştir. Vanilya aktivitesi eğrisi kuyu başına 15 nanogramın üzerinde düzleşirken.

Substrat tükenmesi nedeniyle doğrusal olmamayı önlemek için testlerin inkübasyon adımından hemen sonra yapılması da önemlidir. Ateşböceği lusiferaz testi için bir bozunma sinyali zaman seyri, bu protokolü kullanarak reaktiflerin eklenmesinden bir saat sonrasına kadar önemli ateşböceği lusiferaz aktivitesi ortaya çıkardı, 7.670 insan geni tarandı ve burada gösterilen temsili sonuçlarda nihai olarak 68 yeni alfa sinüklein düzenleyicisi tanımlandı. Her yatay çizgi, kontrollü bir GFP nötr indükleyiciye kıyasla tek bir gen vuruşunun indüksiyon oranını temsil eder.

Mavi çizgiler pozitif indükleyicileri temsil ederken, tek kırmızı çizgi bir baskılayıcı indüksiyonu temsil eder, değerler alfa sinüklein promotörü sürüş ateşböceği lusiferaz aktivitesinin CMV promotörüne oranı olarak hesaplanır, her isabetin çalıştırılan lusiferaz aktivitesine normalize edilir, bir GFP indükleyicisi kullanılarak aynı lusiferaz yapıları testine normalize edilir. Tanımlanan isabetlerin endojen hedefi düzenlemesini sağlamak için daha fazla aşırı ekspresyon ve knockdown testleri ile birlikte kantitatif PCR gibi diğer yöntemler de gerçekleştirilebilir.