Yüksek verim Sıralama için Yüksek Kalite Kromatin Immunoprecipitation DNA Şablon üretimi (ChIP-seq)

Bu prosedürün genel amacı, kromatin yoluyla protein bağlanma bölgelerini tanımlamaktır. Bu, önce proteinin DNA'ya çapraz bağlanmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, DNA'yı kesmektir.

Daha sonra, DNA'ya bağlı hedef protein immüno-çökeltilir ve daha sonra ima edilir. Son adım, çapraz bağı tersine çevirmek ve DNA'yı izole etmektir. Sonuç olarak, kromatin immünopresipitasyonu, genom boyunca protein bağlanmasının lokalizasyonunu göstermek için kullanılır.

Bu yöntem, belirli bir doku veya hücre hattındaki protein DNA etkileşimlerinin tanımlanması ve haritalanması gibi fonksiyonel genomik alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir, Bu prosedür için hücreler 100 x 20 milimetrelik hücre kültürü kaplarında büyütülür. Hücre miktarı, hücre tipine bağlı olarak tabak başına bir ila 10 milyon hücre arasında değişebilir. Hücrelerdeki protein ve kromatini çapraz bağlamak için bir immünopresipitasyon için yaklaşık 2 milyon hücre yeterlidir.

% 1'e formaldehit ekleyin ve 125 milimolar nihai konsantrasyona glisin ekleyerek ve beş dakika inkübe ederek ara sıra sallanan söndürme çapraz bağlama ile oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. Oda sıcaklığında, ikinci yıkamadan sonra hücreleri bir x fosfat tamponlu tuzlu su ile iki kez yıkayın, PBS'yi boşaltın ve plastik hücre kazıyıcı ile 0.2 mililitre taze PBS hasat hücresini bir mikro santrifüj tüpüne ekleyin. Hücreleri 2000 RPM'de dört santigrat derecede beş dakika boyunca döndürün.

Nükleer ekstraksiyon için süpernatanı aspire edin. Hücreleri, bir sonraki segmentte gösterilecek olan tam bir hücre lizatı hazırlamak için bir pelet olarak tutun. SDS lizis tamponundaki resus süspansiyon hücreleri Tüm hücre lizatları, ıslak buz üzerinde sonikasyon ile çapraz bağlı hücrelerden hazırlanır.

My ator kullanma İdeal DNA fragmanı boyutunu elde etmek için, bu prosedür farklı sonikasyon koşulları denenerek optimize edilmelidir. Numuneler prosedür boyunca buz üzerinde kalmalıdır. Her örneği bu ayarlarda, 30 saniye açık ve 45 saniye kapalı, iki genlik ayarında sonikleştirin.

Bu örnekte, ideal parça boyutunu elde etmek için 12 döngüye ihtiyaç vardır. Sonikasyon sonuçlarını kontrol etmek ve nicelik tayini için her numuneden 20 mikrolitre toplayın. Numunenin geri kalanı eksi 80 santigrat derecede saklanabilir.

20 mikrolitrelik numuneyi 30 mikrolitre 0.1 XTE tamponu ekleyerek seyreltin. Daha sonra numuneyi bir saat boyunca 37 santigrat derecede bir mikrolitre RNA A ile muamele edin. Daha sonra, bir mikrolitre proteinaz K ekleyin ve iki saat boyunca 62 santigrat derecede inkübe edin.

Proteinaz K işleminden sonra, numunenin 20 mikrolitresini %2'lik bir agros jeli üzerinde çalıştırın. Numuneler, istenen boyutta DNA'nın büyük kısmı ile bir smear sunmalıdır. Birkaç farklı döngü test edilirse, boyutta kademeli bir azalma görülmelidir.

Döngü sayısı arttıkça, kalan numune miktarı bir kaya quick PCR saflaştırma kiti ile saflaştırılacak ve bu prosedüre başlamak için bir NanoDrop TER spektrumu kullanılarak nicelleştirilecektir. Dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 12.000 RPM'de buz santrifüjünde fava sonikasyonlu kromatin örnekleri. Hemen buzu koyun.

Beyaz bir topak olarak görünen SDS'yi çıkarmak için. Süpernatanı toplayın ve peleti her numuneden atın. Gerekirse numuneleri birleştirin, önceki hesaplamalara göre deney için gereken miktarları bir kenara koyun.

İmmünopresipitasyon başına bir ila 10 mikrogram kromatin gereklidir. Proteinaz inhibitörü ile takviye edilmiş kromatini bir ila 10 inç seyreltme tamponunu seyreltin. İmmünopresipitasyon başına 100 mikrolitre bloke aro hızı ekleyin ve bir saat boyunca dört santigrat derecede döndürün.

Kromatin immünopresipitasyon prosedürüne, numuneleri dört santigrat derecede bir dakika boyunca 800 RPM'de döndürerek ve her bir süpernatanı yeni bir tüpe aktararak başlayın. Süpernatanı 800 RPM'de bir dakika santrifüjleyin ve başka bir temiz tüpe aktarın. Giriş kontrolü olarak hizmet etmek için eksi 20 santigrat derecede 20 mikrolitre süpernatan tasarruf edin.

Daha sonra, kromatinin geri kalanını deneyde gerekli olan immünoçökeltme sayısına alikot edin. Her numuneye, bir ila 10 mikrogram kromatin başına iki mikrogram antikor ekleyin, gece boyunca rotasyonla dört santigrat derecede inkübe edin Ertesi sabah, her immünopresipitasyon örneğine 100 mikrolitre bloke aros boncuk ekleyin. Dört santigrat derecede bir saat inkübe edin ve bir saat sonra döndürün.

Bir dakika boyunca 800 RPM'de döndürerek boncukları peletleyin. Süpernatanı mümkün olduğunca atın. Boncukları yıka.

Düşük tuzlu bağışıklık kompleksi yıkama tamponu ile bir kez, her tüpe bir mililitre tampon ekleyin. Oda sıcaklığında beş ila sekiz dakika döndürün ve ardından süpernatan yıkama boncuklarını bir kez yüksek tuzlu bağışıklık kompleksi yıkama tamponu, bir kez lityum klorür, bağışıklık kompleksi yıkama tamponu ve iki kez TE tamponu ile attıktan sonra bir dakika boyunca 800 RPM'de santrifüjleyin toplam beş yıkama. Daha sonra, her bir immünopresipitasyon örneğinden ve ayrıca girdi örneklerinden DNA ima edilir.

Çapraz bağı tersine çevirmek için, her bir elu ve giriş kontrolünün 200 mikrolitresine sekiz mikrolitre beş molar sodyum klorür ekleyin. Tüpleri param ile kapatın ve gece boyunca 65 santigrat derece su banyosunda inkübe edin. Ertesi gün, her numuneyi 37 santigrat derecede bir saat boyunca bir mikrolitre RNA ile tedavi edin.

Bir saat sonra, her numuneye dört mikrolitre 0.5 molar EDTA ve sekiz mikrolitre bir molar tris HCL ekleyin ve karıştırın. Daha sonra bir mikrolitre proteinaz K ekleyin ve iki saat boyunca 45 santigrat derecede inkübe edin. Kaya hızlı PCR saflaştırma kitini kullanarak numuneleri saflaştırın.

Numuneler, PCR ile incelenene kadar eksi 20 santigrat derecede saklanabilir. Kromatin immünopresipitasyonu ile zenginleştirme, PCR veya gerçek zamanlı PCR ile kontrol edilebilir PCR numuneleri için, bir agros jeli üzerinde elektro referans, ilgilenilen protein için bir antikor kullanan giriş ve çip numune şeritlerinde bantlar olmalıdır, bu durumda transkripsiyon faktörü TCF yedi L ikidir. Buna karşılık, pozitif bağlanma bölgesi için IgG negatif kontrol şeridinde hiçbir şey olmamalı veya en fazla çok soluk bir bant olmamalıdır.

Negatif bağlama bölgesi için. IgG kontrolü ve çip şeritleri için çok zayıf bir bant olmalı veya hiç bant olmamalıdır. Giriş şeridinde bir bant olmalıdır.

Bu şekil, gerçek zamanlı PCR ile incelenen aynı örneklerden elde edilen sonuçları göstermektedir. Önceki sonuçta olduğu gibi. IgG kontrolü üzerinden çip numunesi için pozitif bağlanma bölgesinde önemli bir kat zenginleştirmesi olmalıdır.

Ayrıca negatif bağlanma bölgesinde varsa çok az zenginleştirme olmalıdır. Bu videoyu izledikten sonra, bağlayıcı proteinin bir doku veya hücre hattındaki kromatine nasıl çapraz bağlanacağını ve hedeflenen proteini nasıl çökelteceğinizi ve ardından daha fazla analiz için DNA'yı nasıl izole edeceğinizi iyi anlamalısınız.