Name: Yüksek verim Sıralama için Yüksek Kalite Kromatin Immunoprecipitation DNA Şablon üretimi (ChIP-seq) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: Öğrenin, ChIP-seq yöntemiyle TCF7L2 transkripsiyon faktörü kullanarak protein-DNA etkileşimlerini haritalamayı. Bu protokol, gen regülasyonunu incelemek için yüksek kaliteli DNA şablonu üretir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Çalışma Philadelphia Çocuk Hastanesi bir Enstitüsü Geliştirme Ödülü tarafından desteklenmektedir.

1. Çapraz bağ Kromatin <ol><li> 100x20mm hücre kültürü yemekleri hücreleri büyür. Hücrelerin miktarı, 1 ila hücre tipine bağlı olarak tabak başına 10 milyon hücre arasında olabilir. Yaklaşık 2.000.000 hücre, bir immüno-çökeltme için yeterlidir. </li><li> Zaman sallama ile oda sıcaklığında 10 dakika boyunca% 1 formaldehid ile çapraz bağ hücreleri. </li><li> Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 125 mM Glisin ve inkübe bir nihai konsantrasyon ilave çapraz-bağlama soğutun. </li><li> 1X fosfat hücreleri yıkayın süzün PBS, iki kez Salin (PBS), daha sonra 0.2 ml PBS ilave edin. </li><li> Bir mikrosantrifüj tüpe plastik bir hücre kazıyıcı ile Hasat hücreleri. </li><li> 4 5 dakika için 2.000 devirde hücreleri aşağı Spin ° C </li><li> Süpernatant aspire. Bütün hücre için SDS lizis tamponu içinde tekrar süspansiyon hücreleri (% 1 SDS, 10 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl, pH 8.1) ya da nükleer lizat çıkarılması için bir pelet olarak tutmak. </li><li> Hücreler ° C veya bir immediat devam edebilirsiniz -80 kaydedilebilirsonikasyon ile ely. </li></ol> 2. (Tüm Hücre Lizat için 3,5 Adıma geçin) Çekirdekler hazırlayın <ol><li> 1X Proteinaz İnhibitör her bir deney ile (5 mM BORU pH 8.0, 85 mM KCl,% 0.5 NP-40) Cep Lizis Tampon Ek. </li><li> Yaklaşık 10 kat Hücre Lizis Tampon ile pelet hacmi çözülmüş hücre pelletini tekrar. </li><li> Havan tokmağı ile homojenize Dounce-10 kat daha sonra, 10 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edilir. </li><li> 4 5 dakika ° C için 4.000 rpm örnek santrifüj, süpernatant atmak ve nükleer pelet kaydedin. </li></ol> 3. Sonikasyon * <ol><li> SDS Lizis Tampon ve Proteinaz İnhibitör ile kullanılmak üzere tampon ek miktarda sıcak. </li><li> SDS Lizis Tamponu içinde yeniden süspanse nükleer pelet (1-10 milyon hücre başına tampon, yaklaşık 0.5 mL) </li><li> 10 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. </li><li> Mikrosantrifüj tüplerine örnekleri, 0.5 ml alikotları ekleyin. </li><li> Saniye ve 45 30 saniye ile Misonix sonikatör kullanarak ıslak buz üzerinde sonikasyonkapalı 2 bir genlik ayarında. İdeal parçası boyutu için devir sayısı ilk çeşitli döngüsü numaraları (örneğin 2, 4, 8, 12, 16, ve 20 veya daha fazla döngü) denemek belirlenebilir. Sonikatör farklı bir marka, ancak, koşulları değişecektir kullanılabilir. Döngüleri ve ilgili zaman miktarı sayıda deney ve kapalı ideal koşulları belirlemek için gerçekleştirilmelidir. </li><li> Sonication sonuçları kontrol etmek ve, miktar yapmak için her bir örnek 20 ul toplayın. Numunenin geri kalanı -80 ° C&#39;de saklanabilir </li><li> 0.1x TE Tampon 30 ul ekleyerek örnek 20 ul sulandırmak. </li><li> 1 ul RNaz sahip örnek bir tedavi 1 saat 37 ° C&#39;de daha sonra 2 saat boyunca 62 ° C&#39;de inkübe Proteinaz K ve 1 ul ekleyin. </li><li> % 2 agaroz jeli üzerinde, örnek 20 ul çalıştırın. </li><li> Sonra NanoDrop spektrofotometre kullanarak ölçmek QIAquick PCR Arıtma kiti ile örnek kalan tutar arındırın. </li></ol> * Yerli ChI içinP microccocal nükleaz sindirim kesme DNA alternatif olarak kullanılabilir. 4. Blok Agaroz Boncuk * <ol><li> Boncuk zaten engellenirse, 5.1 adıma geçin. </li><li> Protein A veya Protein G agaroz kullanın. 5 asyonlar için (IP), 50% boncuk bulamaç (300 ul boncuk pelet) 600 ul kullanın </li><li> Boncuk yıkamak için, 4 ° C de 1 dakika boyunca 800 rpm&#39;de onları aşağı spin ve süpernatant atın. Ekle biraz fazla 2 ml ChIP seyreltme tamponu (% 0.01 SDS, 1.2 mM EDTA, 167 mM NaCI,% 1.1 Triton X-100, 16.7 mM Tris-HCl, pH 8.1) ve yavaş yavaş ters tüp 10X ile karıştırılır. 4 ° C de 1 dakika boyunca 800 rpm&#39;de tekrar aşağı Spin ve süpernatant atın. Yıkama 2 kez daha tekrarlayın. </li><li> Çözüm engelleme 4 ° C gecede çevirerek boncuk engelleyin. Engelleme çözüm tarifi için Tablo 1&#39;e bakınız. </li></ol> 5. Ön açık Kromatin <ol><li> Çözülme buz üzerinde kromatin sonicated. </li><li> 12.000 rpm f aşağı Spinveya 4 10 dakika ° C daha sonra SDS (beyaz pelet) kaldırmak için hemen buz koymak. </li><li> Süpernatant toplayın, pelet atmak ve gerekirse örnekleri birleştirir. </li><li> Hesaplamaları (IP başına kromatin 1-10 ug) göre deney için gerekli olan miktarda çıkarın. </li><li> Proteinaz inhibitörü ile desteklenmiş ChIP seyreltme Tampon 10X kromatin sulandırmak. </li><li> IP başına bloke boncuk 100 ul ekleyin. </li><li> 1 saat boyunca 4 ° C&#39;de döndürün. </li></ol> 6. Immunoprecipitation <ol><li> 1 dakika boyunca 800 rpm&#39;de örnekleri aşağı Spin ve yeni bir tüp süpernatant aktarın. </li><li> 1 dakika ve başka bir temiz tüpe transferi için 800 rpm süpernatant aşağı doğru döndürün. </li><li> -20 ° C de, giriş kontrol olarak hizmet etmek, süpernatan 20 ul katılım </li><li> Deney yapılacak IP sayısı kısım kromatin. </li><li> Her bir örnek, kromatin 1-10 ug antikor başına 2 ug ekleyin. </li><li> Rotasyonu ile bir gece süreyle 4 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Her IP örnek bloke boncuk 100 ul ekleyin. </li><li> ° C Dönme, 4 &#39;de 1 saat süreyle inkübe edin. </li><li> Pelet, 1 dakika boyunca 800 rpm&#39;de dönen ve mümkün olduğunca süpernatant kadar atmak ve boncukları. </li><li> Düşük Tuz immün kompleks yıkama tamponu ile bir kez boncuk yıkayın. Her tüpe tampon 1 ml ilave edilir, 5-8 dakika için oda sıcaklığında döndürmek; 1 dakika boyunca 800 rpm&#39;de döndürün sonra supernatant atın. Yüksek Tuz immün kompleks yıkama tamponu ve LiCI, immün kompleks bir kez yıkama tamponu ile yıkayın ve tekrar iki kere 5 yıkama (Tablo 2) toplam TE Tamponu ile. </li></ol> 7. Elüsyon <ol><li> Önceki gün çözülme giriş örnekleri elüsyon ile işlenecek. </li><li> Elüsyon Tampon taze (Tablo 3) olun. </li><li> IP ve giriş kontrol örnekleri artı 1-2 ekstra örnekleri için gerekli yeterli Elüsyon Tampon bir ana karışımı olun. </li><li> Her IP örnek için 100 ul, Seyreltme Tampon maddesi ekleyin ve 15 dakika daha oda sıcaklığında inküberotasyon ile. </li><li> 1 dakika boyunca 800 rpm&#39;de aşağı Spin ve yeni bir tüp süpernatant ekleyin. </li><li> Boncuk her tüpe Elüsyon tamponu, diğer bir 100 ul ekleyin ve rotasyon ile 15 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> Inkübasyondan sonra 15 saniye vorteks, 1 dakika 5.000 rpm&#39;de aşağı spin, daha sonra ilk elüsyon süpernatant ile süpernatant birleştirir. (Hiçbir Süpernatantları boncuk üzerinde orada sol emin olun. Eğer emin değilseniz, 1 dakika 5.000 rpm&#39;de tekrar süpernatant aşağı spin ve yeni bir tüp içinde süpernatant toplamak. </li><li> Giriş kontrol numunelerinin 20 ul Elüsyon Tampon 180 ul ekleyin. </li></ol> 8. Çapraz bağlantı Ters <ol><li> Seyrelticileri ve giriş kontroller için 200 ul 5 M NaCl 8 ul ilave edin. </li><li> 65 ° C gecede de su banyosunda parafilm ve inkübe ile Seal tüpler. </li></ol> 9. DNA Saflaştırma <ol><li> 37 ° C&#39;de 1 saat boyunca, RNaz A 1 ul her bir örnek tedavi ° C </li><li> 4 μ Ekle0.5 M EDTA, 8 ul 1 M Tris-HCl, karışım, l daha sonra 2 saat boyunca 45 ° C&#39;de her bir örnek ve inkübe Proteinaz K 1 ul. </li><li> QIAquick PCR saflaştırma kiti kullanılarak örnekleri arındırın. Numuneler daha sonraki bir tarihte yapılabilir -20 ° C ve PCR check kaydedilebilir. </li></ol> * Alternatif olarak, yonga dereceli manyetik boncuk immüno-çökeltme bölümü için agaroz yerine kullanılabilir. 10. PCR çek <ol><li> PCR kontrolü için, ilgi protein bağlı olduğu bilinen bölgeler için astar kullanın. Ayrıca, negatif kontroller olarak bağlayıcı olmayan bölgeler için primerlerin kullanımı. </li><li> Reaksiyon için reaktifler karıştırılır. 1:100 (Tablo 3) Giriş örnek sulandırmak. </li><li> Reaksiyon çalıştırın. PCR Programı: </li></ol> Adım 1: 94 ° C&#39;de 3 dakika Adım 2: 94 ° C 20 sn 59 ° C 30 sn 72 ° C de 30 sn (En az 30 cycl için Adım 2 tekrarlayınes) Adım 3: 72 ° C&#39;de 2 dakika <ol start="4"><li> % 1 agaroz jel üzerinde örnekleri çalıştırın. </li><li> Zenginleştirme da gerçek zamanlı PCR ile kantitatif tespit edilebilir. </li></ol>

<ol><li>Odom, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+pancreas+and+liver+gene+expression+by+HNF+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Control of pancreas and liver gene expression by HNF transcription factors.</a> Science. 303, 1378-1381 (2004).</li>
<li>Johnson, D. S., Mortazavi, A., Myers, R. M., Wold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+mapping+of+in+vivo+protein-DNA+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions.</a> Science. 316, 1497-1502 (2007).</li>
<li>Robertson, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+profiles+of+STAT1+DNA+association+using+chromatin+immunoprecipitation+and+massively+parallel+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Genome-wide profiles of STAT1 DNA association using chromatin immunoprecipitation and massively parallel sequencing.</a> Nature Methods. 4, 651-657 (2007).</li>
<li>Reich, N. C., Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+STAT+nuclear+traffic%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Tracking STAT nuclear traffic.</a> Nat. Rev. Immunol. 6, 602-612 (2006).</li>
<li>Lodige, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+export+determines+the+cytokine+sensitivity+of+STAT+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Nuclear export determines the cytokine sensitivity of STAT transcription factors.</a> The Journal of Biological Chemistry. 280, 43087-43099 (2005).</li>
<li>Schroder, K., Sweet, M. J., Hume, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+integration+between+IFNgamma+and+TLR+signalling+pathways+in+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Immunobiology%22%5BJournal%5D)">Signal integration between IFNgamma and TLR signalling pathways in macrophages.</a> Immunobiology. 211, 511-524 (2006).</li>
<li>Vinkemeier, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Getting+the+message+across%2C+STAT%21+Design+principles+of+a+molecular+signaling+circuit%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Getting the message across, STAT! Design principles of a molecular signaling circuit.</a> The Journal of Cell Biology. 167, 197-201 (2004).</li>
<li>Brierley, M. M., Fish, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stats%3A+multifaceted+regulators+of+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Interferon+Cytokine+Res%22%5BJournal%5D)">Stats: multifaceted regulators of transcription.</a> J. Interferon Cytokine Res. 25, 733-744 (2005).</li>
<li>Bentley, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-genome+re-sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Genetics+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Whole-genome re-sequencing.</a> Current Opinion in Genetics & Development. 16, 545-552 (2006).</li>
<li>Grant, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variant+of+transcription+factor+7-like+2+%28TCF7L2%29+gene+confers+risk+of+type+2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Variant of transcription factor 7-like 2 (TCF7L2) gene confers risk of type 2 diabetes.</a> Nature Genetics. 38, 320-323 (2006).</li>
<li>Sladek, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genome-wide+association+study+identifies+novel+risk+loci+for+type+2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A genome-wide association study identifies novel risk loci for type 2 diabetes.</a> Nature. 445, 881-885 (2007).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wellcome+Trust+Case+Control+Consortium.+Genome-wide+association+study+of+14%2C000+cases+of+seven+common+diseases+and+3%2C000+shared+controls%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Wellcome Trust Case Control Consortium. Genome-wide association study of 14,000 cases of seven common diseases and 3,000 shared controls.</a> Nature. 447, 661-678 (2007).</li>
<li>Saxena, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+association+analysis+identifies+loci+for+type+2+diabetes+and+triglyceride+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-wide association analysis identifies loci for type 2 diabetes and triglyceride levels.</a> Science. 316, 1331-1336 (2007).</li>
<li>Zeggini, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+of+genome-wide+association+signals+in+UK+samples+reveals+risk+loci+for+type+2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Replication of genome-wide association signals in UK samples reveals risk loci for type 2 diabetes.</a> Science. 316, 1336-1341 (2007).</li>
<li>Scott, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genome-wide+association+study+of+type+2+diabetes+in+Finns+detects+multiple+susceptibility+variants%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A genome-wide association study of type 2 diabetes in Finns detects multiple susceptibility variants.</a> Science. 316, 1341-1345 (2007).</li>
<li>Steinthorsdottir, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+variant+in+CDKAL1+influences+insulin+response+and+risk+of+type+2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">A variant in CDKAL1 influences insulin response and risk of type 2 diabetes.</a> Nature Genetics. 39, 770-775 (2007).</li>
<li>Salonen, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+2+Diabetes+Whole-Genome+Association+Study+in+Four+Populations%3A+The+DiaGen+Consortium%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Type 2 Diabetes Whole-Genome Association Study in Four Populations: The DiaGen Consortium.</a> American Journal of Human Genetics. 81, 338-345 (2007).</li>
<li>Zeggini, E., McCarthy, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TCF7L2%3A+the+biggest+story+in+diabetes+genetics+since+HLA%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">TCF7L2: the biggest story in diabetes genetics since HLA.</a> Diabetologia. 50, 1-4 (2007).</li>
<li>Weedon, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+TCF7L2%5BTitle%5D)+AND+%22Diabet.+Med%22%5BJournal%5D)">The importance of TCF7L2.</a> Diabet. Med. 24, 1062-1066 (2007).</li>
<li>Hattersley, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prime+suspect%3A+the+TCF7L2+gene+and+type+2+diabetes+risk%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Prime suspect: the TCF7L2 gene and type 2 diabetes risk.</a> The Journal of Clinical Investigation. 117, 2077-2079 (2007).</li>
<li>Yochum, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+analysis+of+chromatin+occupancy+identifies+beta-catenin+target+genes+in+colorectal+carcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Serial analysis of chromatin occupancy identifies beta-catenin target genes in colorectal carcinoma cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 3324-3329 (2007).</li>
<li>Duval, A., Busson-Leconiat, M., Berger, R., Hamelin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assignment+of+the+TCF-4+gene+%28TCF7L2%29+to+human+chromosome+band+10q25.3%5BTitle%5D)+AND+%22Cytogenet.+Cell+Genet%22%5BJournal%5D)">Assignment of the TCF-4 gene (TCF7L2) to human chromosome band 10q25.3.</a> Cytogenet. Cell Genet. 88, 264-265 (2000).</li>
<li>Pomerantz, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+8q24+cancer+risk+variant+rs6983267+shows+long-range+interaction+with+MYC+in+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">The 8q24 cancer risk variant rs6983267 shows long-range interaction with MYC in colorectal cancer.</a> Nature Genetics. 41, 882-884 (2009).</li>
<li>Tuupanen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+common+colorectal+cancer+predisposition+SNP+rs6983267+at+chromosome+8q24+confers+potential+to+enhanced+Wnt+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">The common colorectal cancer predisposition SNP rs6983267 at chromosome 8q24 confers potential to enhanced Wnt signaling.</a> Nature Genetics. 41, 885-890 (2009).</li>
<li>Zhao, J., Schug, J., Li, M., Kaestner, K. H., Grant, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease-associated+loci+are+significantly+over-represented+among+genes+bound+by+transcription+factor+7-like+2+%28TCF7L2%29+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Disease-associated loci are significantly over-represented among genes bound by transcription factor 7-like 2 (TCF7L2) in vivo.</a> Diabetologia. 53, 2340-2346 (2010).</li>
<li>Benjamini, Y., Yekutieli, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+trait+Loci+analysis+using+the+false+discovery+rate%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Quantitative trait Loci analysis using the false discovery rate.</a> Genetics. 171, 783-790 (2005).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.

Çok yakın zamanda diğer transkripsiyon faktörleri 2,3 ile gösterilmiştir gibi, şimdi ChIP-seq kullanarak protein-DNA etkileşimleri dernek bir genom profil yürütmek mümkündür. Başarılı bir sıralama sonuç için önemli bir yüksek kaliteli kromatin immunoprecipitation DNA örneğinin nesil. DNA şablonu oluşturulur ve yeterli zenginleştirilmiş tespit edildikten sonra, tek bir daha sonraki dizi analizi için kütüphanesi hazırlanmasında alabilir. Örneğin, bir satıcı, Illumina tarafından sağl...

Uzun yıllar boyunca, özellikle bir protein genom genişliğinde, transkripsiyon faktörü sınıfta olanlar tarafından bağlı ve düzenlenen genlerin kümesini tanımlamak için karşılanmamış bir ihtiyaç olmuştur. Odom ve ark. 1 sistematik insan karaciğer ve pankreas adacık olarak önceden belirlenmiş transkripsiyonel düzenleyiciler tarafından işgal genleri tanımlamak için organizatörü mikroarrayler ile birlikte kromatin immunoprecipitation (ChIP) kullanılır. Daha sonra, Johnson ve ark. 2 kapsamlı tüm memeli genomları arasında protein-DNA etkileşimleri map için doğrudan ultra yüksek verimli DNA dizi (ChIP-seq) dayalı büyük ölçekli kromatin immunoprecipitation testi geliştirdi. Bir test durumu olarak, in vivo insan genomu 1946 yerlere nöron-kısıtlayıcı susturucu faktörü (NRSF) bağlama eşleştirilir. Veriler i hem kolaylaştırdı bağlayıcı konumunun keskin çözünürlük (+ 50 baz çifti), görüntülenirmotif ve NRSF bağlayıcı motifleri ilişkin tanımlamaların çözüm. Bu ChIP-seq veri aynı zamanda yüksek duyarlılık ve özgüllük ve istatistiksel güven (p &lt;10 -4), yeni aday etkileşimleri çıkarım için önemli olan özellikleri vardı. Robertson ve ark. 3 Ayrıca STAT1 hedefleri harita için ChIP-seq kullanılan interferon-γ (IFN-γ) ile uyarılmış ve in vivo insan HeLa S3 hücreleri uyarılmamış. ChIP-seq tarafından, 15,1 ve 12,9 milyon benzersiz eşleştirilir dizisi okur, ve en az 0.001 bir tahmini yanlış keşif oranı kullanılarak, sırasıyla, uyarılmış ve uyarılmamış hücrelerde 41.582 ve 11.004 varsayılan STAT1 bağlayıcı bölgeleri belirledi. STAT1, interferon-duyarlı bağlanma bölgeleri 4-8 içerdiği bilinmektedir 34 lokus, yonga-DİZ 24 (% 71) bulundu. ChIP-seq hedefler bilinen STAT1 bağlayıcı motifleri benzer dizileri zenginleştirildi. Mevcut iki ChIP-PCR verileri ile karşılaştırmalar önerilen ayarlarBu ChIP-seq duyarlılık% 70 ve% 92 ve özgüllük en az% 95 arasında oldu. Ayrıca, ChIP-seq derinlemesine sıralama ile artar düşük analitik karmaşıklık ve duyarlılık hem de sunduğu açıktı. Bu, &quot;yeni nesil&quot; genom dizileme teknolojileri 9 eski teknolojileri üzerinde oluşturulan etkin bir maliyet olabilir dizisi miktarında artış büyüklüğü 1-2 emir sağlamak gibi. ChIP-seq yöntemleri bu nedenle doğrudan memeli protein-DNA etkileşmeleri 3 etkin profil için tam genom kapsama alanı sağlar. 2006 yılında, transkripsiyon faktörü 2 7-benzeri (TCF7L2) tip 2 diyabetli gen varyantları güçlü bir ilişki 10 keşfedildi. Diğer araştırmacılar zaten bağımsız Doğa 11,12 yayınlanan tip 2 diyabet ilk genom çapında ilişki çalışmalar, ilginç, farklı etnik Bu bulgu çoğaltılmış ve var </sbaşka bir yerde&gt;, Bilim 13-15 ve 16,17 kadar, en güçlü dernek TCF7L2 ile gerçekten oldu, bu şimdi 18-20 bugüne kadar tip 2 diyabet en önemli genetik bulgu olarak kabul edilir. Buna ek olarak, kanser riski TCF7L2 21,22 ile bağlantılı olmuştur; kolorektal karsinom da dahil olmak üzere kanser, bir dizi genom genişliğinde ilişki çalışmalarla ortaya 8q24 eğrisi, bir aşırı akış bağlı olduğu gösterilmiştir Gerçekten, bu bağlantıyı daha da belirginleşir TCF7L2-bağlama öğesi MYC 23,24 olan transkripsiyon sürüş. Bu nedenle, bu anahtar transkripsiyon faktörü düzenlenir aşağı genlerin belirlenmesinde büyük ilgi var. Metodolojinin örnek olarak TCF7L2 ile deneyimlere dayanarak, bu kağıt kaliteli ChIP DNA örneğinin oluşturmak için nasıl özetliyor. Çip, yüksek resol oluşturmak amacıyla sekanslanmasını için, kolorektal karsinoma hücre hattı ihtiva eden, HCT116 gerçekleştirilmiştirKarmaşık özelliklerin patogenezinde anahtar rolü için daha fazla fikir elde etmek için bir çaba içinde TCF7L2 25 ile bağlı genlerin ution haritası.

<table><tbody><tr><td>QIAquick PCR Arıtma Kiti</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>EZ-ChIP Kiti </td><td>Millipore</td><td>17-371</td><td></td></tr><tr><td>GoTaq Sıcak Başlangıç Polimeraz </td><td>Promega</td><td>M5001</td><td></td></tr><tr><td>Misonix Sonicator</td><td>Qsonica</td><td>XL-2000</td><td></td></tr><tr><td> NanoDrop 1000 Spektrofotometre </td><td>Termo-Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4"><güçlü>Pozitif kontrol primer dizileri (TCF7L2-1)</güçlü> İleri- 5'-TCGCCCTGTCAATAATCTCC-3' Ters- 5'-GCTCACCTCCTGTGTATCTTCG-3' <güçlü> Negatif kontrol primer dizileri (CTRL-1) İleri-5'-ATGTGGTGTGGCTGTGATGGGAAC-3' Ters- 5'-CGAGCAATCGGTAAATAGGTCTGG-3'</td></tr></tbody></table>

yüksek verim sıralama için yüksek kalite kromatin immunoprecipitation dna Şablon üretimi (chip-seq)

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing (ChIP-seq)

Kromatin immunoprecipitation (ChIP) birleştiren ve güçlü paralel sıralama in vivo transkripsiyon faktörleri ile bağlı memeli DNA dizilerinin repertuar belirlemek için kullanılabilir nerede ChIP-sıralama (ChIP-seq) yöntemleri doğrudan, tam genom kapsama alanı sunuyor. &quot;Yeni nesil&quot; genom dizileme teknolojileri olabilir dizisi miktarında artış büyüklüğü 1-2 siparişleri sağlamak maliyet-etkin böylece doğrudan memeli etkin profil için tam genom kapsama sağlamak için ChIP-seq yöntemleri için izin eski teknolojileri üzerinde oluşturulan protein-DNA etkileşmeleri. Başarılı ChIP-seq yaklaşımlar için, bir yüksek kaliteli ChIP DNA örneğinin en iyi sıralama sonuçları elde etmek için üretmek gerekir. Açıklama en güçlü tip 2 diyabet, yani transkripsiyon faktörü transkripsiyon faktörü 2 7-benzeri (TCF7L2 patogenezinde rol genin protein ürünü ile deneyimine alınmaktadır.) Bu faktör, aynı zamanda çeşitli kanser ile ilişkili bulunmuştur. Boş patogenezinde anahtar rolü daha fazla fikir veren, TCF7L2 bağlı genleri belirlemek için sıralama ile yüksek çözünürlüklü harita oluşturmak için, kolorektal karsinom hücre hattı, HCT116 elde edilen yüksek kaliteli ChIP DNA örneğinin oluşturmak için nasıl Karmaşık özelliklerin.

Kromatin sonicated edilmiş ve RNaz ve proteinaz ile tedavi edildikten sonra,% 2 agaroz jel üzerinde çalışan örnekleri istenilen boyutta DNA büyük bir kısmı bir karalama sunmalıdır. Birkaç farklı devir test edilir ise, boyut olarak bir kademeli azalma devir sayısı arttıkça (Şekil 2) olarak görülmelidir. Protokolün immunoprecipitation bölümü tamamladıktan sonra zenginleştirme ya PCR veya gerçek zamanlı PCR ile kontrol edilebilir. Bir agaroz jel üzerinde çalışan PCR örnekleri i...

Kromatin immunoprecipitation ve ultra-yüksek verimli sıralama (ChIP-seq) kombinasyonu belirli bir doku ya da hücre hattı protein-DNA etkileşimleri belirlemek ve eşleyebilirsiniz. Boş bir örnek olarak transkripsiyon faktörü TCF7L2 ile deneyim kullanıyorsanız sonraki sıralama için yüksek kaliteli ChIP şablonu oluşturmak için nasıl.

Yüksek verim Sıralama için Yüksek Kalite Kromatin Immunoprecipitation DNA Şablon üretimi (ChIP-seq)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly  offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation  (ChIP) and massively parallel ...

Bu prosedürün genel amacı, kromatin aracılığıyla protein bağlanma bölgelerini belirlemektir. Bu işlem, öncelikle proteinin DNA'ya çapraz bağlanmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım ise DNA'nın parçalanmasıdır.Ardından, DNA'ya bağlı hedef protein immünopresipite edilir ve ardından elüe edilir. Son adım, çapraz bağların geri döndürülmesi ve DNA'nın izole edilmesidir. Nihayetinde, kromatin immünopresipitasyonu, protein bağlanmasının genom genelindeki lokalizasyonunu göstermek için kullanılır.Bu yöntem, belirli bir doku veya hücre hattındaki protein-DNA etkileşimlerinin belirlenmesi ve haritalanması gibi fonksiyonel genomik alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu prosedür için hücreler, 100 by 20 milimetrelik hücre kültürü kaplarında büyütülür. Hücre miktarı, hücre tipine bağlı olarak kap başına 1 ile 10 milyon hücre arasında değişebilir. Hücrelerdeki protein ve kromatini çapraz bağlamak için tek bir immünopresipitasyon başına yaklaşık 2 milyon hücre yeterlidir.Formaldehit ekleyerek konsantrasyonu %1'e getirin ve oda sıcaklığında, ara ara sallayarak 10 dakika inkübe edin. Glisin ekleyerek son konsantrasyonu 125 millimolar yapın ve beş dakika inkübe ederek çapraz

generation-high-quality-chromatin-immunoprecipitation-dna-template

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Hi-C yöntemi kromatin etkileşimler (1) tarafsız, genom kimlik sağlar. Hi-C çiftler yakınlık ligasyonu ve güçlü paralel sıralama. Ortaya çıkan veriler farklı ölçeklerde genomik mimarlık eğitimi için kullanılabilir: ilk sonuçlar, kromozom toprakları, segregasyon, açık ve kapalı kromatin ve megabase ölçekte kromatin yapısı gibi özellikleri tespit.

Hi-C: genomların Üç boyutlu Mimari Eğitim Bir Yöntem.

Bu videoda, proteine bağlı kromatin fragmanlarının seçici immünopresipitasyonu yoluyla oligodendrosit öncü hücrelerinin genomik DNA'sının belirli bölgelerindeki protein bağlanma bölgelerini tanımlamak için kromatin immünopresipitasyon tekniğini gösteriyoruz. Bu yöntem, gen regülasyonunda yer alan transkripsiyon faktörleri de dahil olmak üzere çeşitli düzenleyici proteinlerin etkileşimini incelemeye yardımcı olur.

Genomik DNA Üzerindeki Hedef Protein Bağlanma Bölgelerini Belirlemek için Kromatin İmmünopresipitasyonu

İn vivo protein-DNA etkileşimlerini haritalama yöntemleri, genomik araştırmanın her yönü için çok önemli hale geliyor, ancak zahmetli, maliyetli ve zaman alıcı. Burada, sınırlı miktarda hücre ile in vivo protein-DNA etkileşimlerini haritalamak için kromatin immünopresipitasyonunu otomatikleştiren, ticari olarak temin edilebilen bir robotik sıvı işleme sistemi sunulmaktadır.

ChIP-seq Denemeleri otomatikleştirme 10.000 HeLa Hücreleri üzerinde epigenetik Profilleri oluşturmak için

Biz (ChIP-seq) metodolojisi sıralı veri kümeleri micrococcal nükleaz (MNase) erişilebilirlik entegre bir nucleosome yoğunluğu ChIP-seq analitik çerçeve için uygun üretimi için sıralama değiştirilmiş yerli Kromatin immunoprecipitation mevcut Histon değişiklik ölçümleri ile.

Nucleosome yoğunluk analiz için kitaplıklarına sıralama yerli Kromatin Immunoprecipitation nesil

Burada, Kromatin immunoprecipitation (ChIP) ve ChIP-seq Kütüphane hazırlık Protokolü düşük-bereket tavuk embriyonik örnekleri küresel epigenomic profilleri oluşturmak için açıklar.

Kromatin Immunoprecipitation (ChIP) protokolü için düşük-bereket embriyonik örnekleri

Burada, bir en iyi duruma getirilmiş yüksek işlem hacmi ChIP-sıralama Protokolü ve genom çapında Kromatin devlet desenlerini donmuş tümör doku ve hücre hatları belirlenmesi için hesaplama analizleri potansiyel açıklar.

Yüksek işlem hacmi ChIP-sıralama tümör dokularda kullanarak genom geniş eşleme Kromatin devletler için entegre bir Platform

Burada genom çapında bağlamasında oligodendrocyte transkripsiyon faktörü 2 (Olig2) Akut arıtılmış beyin oligodendrocyte öncü hücreleri (OPCs) düşük-hücre Kromatin immunoprecipitation (ChIP) gerçekleştirerek analiz etmek için tasarlanmış bir protokol mevcut , Kütüphane hazırlık, yüksek işlem hacmi sıralama ve bioinformatic veri analizi.

Transkripsiyon faktörü Olig2 genomik bağlayıcı siteleri içinde akut tanımlayan PDGFRα + hücreleri tarafından analiz sıralama düşük hücreli Kromatin Immunoprecipitation saf

Biz tandem kromatin için adım adım bir protokol tarif immunoprecipitation sıralama (tChIP-Seq) hücre türüne özgü genom çapında histon değişiklik çözümleme sağlar.

TChIP-Seq: Hücre türüne özgü Epigenome profil oluşturma

Burada verimli kromatin immunoprecipitation (ChIP) için bir protokol yüksek üretilen iş DNA sıralama (ChIP-seq) kahverengi yağ dokusundan izole bir fare (BAT), ardından açıklayın. Bu iletişim kuralı, hem histon değişiklikler eşleme ve genom çapında yerelleştirme sigara histon proteinleri ilgi içinde vivo, soruşturma için uygundur.

Kromatin Immunoprecipitation fare kahverengi yağ dokusunun

Bu makalede, ChIP sıvı işleyici platformu kullanılarak belirli bir histone modifikasyonu (H3K27ac) ile ilişkili DNA bölgelerinin yarı otomatik, mikro ölçekli ChIP-Seq protokolü ve ardından etiketleme kullanılarak kütüphane hazırlığı açıklanmaktadır. Prosedür, kalite ve nicelik amaçları için kontrol değerlendirmesini içerir ve diğer histone modifikasyonlarına veya transkripsiyon faktörlerine benimsenebilir.

Büyük Ölçekli Epigenetik Çalışmalar için Yarı Otomatik ChIP-Seq Prosedürü

Bu protokol, topolojik olarak ilişkili alanların (TAD'ler) sınırları ve düzenleyici ve diğer DNA dizisi elemanları arasındaki uzun menzilli kromatin etkileşimleri de dahil olmak üzere, mega tabanlı boyutlu hedeflenen genomik bölgelerin 3D organizasyonunu yüksek çözünürlükte karakterize etmek için kullanılan Capture Hi-C yöntemini açıklar.

Yüksek Çözünürlüklü 3D Kromatin Organizasyonunun Capture Hi-C ile Deşifre Edilmesi

Öğrenin, ChIP-seq yöntemiyle TCF7L2 transkripsiyon faktörü kullanarak protein-DNA etkileşimlerini haritalamayı. Bu protokol, gen regülasyonunu incelemek için yüksek kaliteli DNA şablonu üretir.

Yüksek verim Sıralama için Yüksek Kalite Kromatin Immunoprecipitation DNA Şablon üretimi (ChIP-seq)

Daha fazla video keşfet