Bireysel piramidal nöronlar High Fidelity optogenetic Kontrolü için Bir Yöntem In vivo

Aşağıdaki deneyin genel amacı, genetik olarak tanımlanmış nöronal popülasyonları fizyolojik olarak ilgili bir zaman ölçeğinde hızlı bir şekilde aktive etmek veya susturmaktır. Bu, genetik olarak tanımlanmış nöronlara mavi ışık nöronu aktive edici kanal opsinini veya yeşil ışık nöron susturma salonu opsinini kodlayan transgenleri taşıyan bir viral vektör ileterek elde edilir. İkinci adım olarak, aynı anda ışık dağıtımına ve elektrik kaydına izin veren bir kayıt elektroduna yapıştırılmış bir fiber optikten oluşan bir ışık yayan op yolu inşa edilir.

Daha sonra, TRO konumlandırılır ve Opsin transdüksiyonlu beyin bölgesine indirilir. Kanal opsin ve ha opsin aracılı yanıtları uyandırmak için, tek tek nöronların kaydedilmesine izin veren tek birim kayıt tekniğine dayalı olarak kanal redsin ve ha hallin transdüksiyonlu nöronların ışığa bağlı aktivasyonunu ve inhibisyonunu gösteren sonuçlar elde edilir. Bu yöntem, ışığın milisaniye zaman çözünürlüğü ile nöronal aktiviteyi yönlendirmede ve belirli nöral alt tiplerde tam olarak ne kadar etkili olabileceğini belirlememize izin vererek sinirbilimdeki temel bir ihtiyaca hitap ediyor ve bunu göstermek Chin Nakamura olacak.

Laboratuvarımda bir doktora sonrası Virüs hazırlanırken ve işlenirken biyogüvenlik birinci seviye prosedürlerin izlendiğinden ve hayvanlarla ilgili tüm yerel ve hükümet yönergelerine uyulduğundan emin olun. Stereotaktik enjeksiyondan önce, bir virüs alikotunun buz üzerinde çözülmesine izin verin ve ardından kısa bir süre aşağı dönün. Tezgah üstü bir santrifüjde, bir Hamilton cam şırıngayı ve iğneyi az miktarda silikon veya mineral yağ ile yavaşça doldurun.

Şırınga haznesinde görünür hava kabarcığı olmadığından emin olun. Şırıngayı bir mikro enjektör pompasına yerleştirin ve pompayı doğrudan dikey stereotaksik kola takın. Virüs alikot tüpünü sabit bir konuma getirdikten sonra, iğnenin ucu virüs alikot tüpünün dibine değene kadar stereotaksik kolu indirin.

İstenen hacimde virüsü çekmek için mikro enjektör pompasının denetleyicisini kullanın. Bir sıçanı ketamin ve ksilazin ile uyuşturduktan sonra, standart aseptik yöntemler kullanarak yeterli anestezi derinliğini sağlamak için bir ayak parmağı tutamına refleks tepkisini kontrol edin. Küçük bir cerrahi makas veya neşter ile hayvan kafatasının üstündeki deriden orta hat kesisi yaptıktan sonra hayvanı stereotaksik bir cihaza yerleştirin.

Bağ dokusunu nazikçe ayırın ve kafatasının üst kısmını küçük bir kemik kazıyıcı ile temizleyin. İğneyi indirin ve başın düz olduğunu belirlemek için bgma ve lambda için Z koordinatlarının eşit olduğunu doğrulayın. Daha sonra stereotaksik kolu, ilgilenilen beyin yapısına karşılık gelen koordinatlara hareket ettirin.

Amaçlanan enjeksiyon bölgesini cerrahi bir kalemle işaretleyin. Kafatasını hedef alan üzerinde dikkatlice inceltmek için el tipi bir matkap kullanın. Matkap ucu kafatasının dibine ulaştığında durun ve inceltilmiş kemiği çıkarmak için bir çift ekstra ince forseps kullanın.

Dura açığa çıktıktan sonra, şırınga iğnesini hedef alanın üzerine yerleştirin ve iğneyi duraya değene kadar indirin. Ve z'yi hesaplamak için bu noktayı kullanın. Koordinat şimdi çok yavaş bir şekilde enjeksiyon iğnesini uygun Z pozisyonuna ulaşılana kadar beyne indirin.

Bu protokolde medial prefrontal korteksin limbik öncesi bölgesi hedeflenir. Virüsü dakikada 0.1 mikrolitre oranında enjekte edin. Enjeksiyon tamamlandıktan sonra, virüsün beynin yüzeyine geri akışını önlemek için iğneyi çekmeden önce 10 dakika bekleyin.

Cildi kapatmak için iğne takılı bir dikiş dikişi kullandıktan sonra, yaraya antibiyotik uygulayın. İlk olarak, süper yapıştırıcı kullanarak bir ila 1,5 mega ohm tungsten elektrodu bir cam kılcal tüpe takın. Ardından, çok modlu bir optik fiberin çıplak ucunu ortaya çıkarmak için bir fiber sıyırma aleti kullanın ve fiber ucunu etanol ile çok hafif bir şekilde temizleyin.

Fiber ucunu kama şeklinde bir elmas bıçakla çizin ve fazla elyafı dikkatlice çıkarmak için ince forseps kullanın. Lif, skorda kolayca parçalanmalıdır. Optik fiberin ucundaki lazer yoğunluğunu ölçmek için bir optik güç ölçer kullanın.

İn vivo kayıtlar için, milimetre kare başına 20 ila 100 miliwatt kadar küçük ışık yoğunluğu, sırasıyla nöronal aktivitenin kanal redsin veya hallin aracılı aktivasyonunu veya susturulmasını güvenilir bir şekilde uyandırabilir. Ardından, optik fiberi kılcal boruya yerleştirin. Fiber ucunu tungsten elektrotun ucunun yaklaşık 500 mikron üzerine yerleştirin ve elektrot ve fiber düz olacak şekilde ucun yakınındaki birkaç noktadan iki kez ince bir dikiş ipliği bağlayın.

Elektrotun ucu ile en yakın düğüm arasındaki mesafenin, burada görüldüğü gibi hedef bölgeye yerleştirme için yeterince uzun olduğundan emin olun. Hayvanı daha önce olduğu gibi ameliyata hazırlayın. Daha sonra kafatasında yeni, temiz, küçük bir pencere yapmak için ilk kraniyotomiyi kılavuz olarak kullanın.

Troyu konumlandırmak için. Dura üzerinde küçük bir kesi yapmak için ince bir iğne kullanın. TRO'yu kafatası penceresinden dikkatlice indirin ve bir mikrom manipülatörü kullanarak beynin içine transdüksiyon bölgesine indirin.

Ardından, ışığa duyarlı bir hücre ortaya çıkana kadar offroad'u 10 ila 50 mikronluk adımlarla yavaşça ilerletin. Burada, tek diyot lazeri kontrol etmek ve devam eden nöral aktiviteyi görselleştirmek ve kaydetmek için laboratuvar görünümünde yazılmış özel bir yazılım kullanıcı arayüzü kullanılır. Kaydedilen sinyaller, 0,3 ila sekiz kilohertz'de filtrelenmiş eski bir AMP 20 K amplifikatör bant geçişi ve ulusal bir enstrümanın analogdan dijitale kartı ile yakalanır.

Neuro lux Pro kullanıcı arayüzü, analog girişlerin ve dijital çıkışların seçilmesine izin verir. Nöronal ve transistör, transistör mantığı veya TTL sinyali için iki analog kanal seçin. Örnekleme hızını 20 kilohertz'e, temel ışık öncesi periyodu iki saniyeye ve ışık sonrası periyodu iki saniyeye ayarlayın.

Ardından TTL lazer stimülasyon darbe genişliğini, frekansını ve stimülasyon süresini ayarlayın. Burada frekans 20 hertz ve stimülasyon periyodu 500 milisaniyedir, bu da tanımlanmış darbe genişliğine sahip 10 lazer darbesinin verildiği anlamına gelir. Kullanıcı, sürekli ışık dağıtımını veya tekrarlanan kayıtları seçebilir.

Darbeler arasındaki aralığı ve darbe suşlarının sayısını seçebilirler. Veriler, kaydın ardından diske kaydedilerek veya kaydedilmeden elde edilebilir. Hayvan, onaylanmış prosedürlere göre sakrifiye edilir ve beyin dokusu, burada gösterildiği gibi erode yerleşimini ve opsin ekspresyonunu doğrulamak için işlenir.

Eşzamanlı ışık iletimi ve elektrofizyolojik kayıt için kurulan Neuro LX Pro yazılım arayüzünün bu ekran görüntüsü, Hall Rod Dobson'un 10 saniyelik sürekli 532 nanometre ışık dağıtımına yanıt olarak rap pre limbik parametal hücresinin spontan aktivitesinin susturulmasını gösteriyor. Bu fotoğraf, dorsal ulu'da temsili hallo redsin ifadesini göstermektedir. Sağdaki şema, fotoğrafın çekildiği yeri temsil eder.

Ok ucu, tungsten elektrotun konumunu gösterir ve ok, optik fiberin konumunu gösterir. Bu fotoğraf, pre limbik kortekste temsili kanal opsin ekspresyonunu göstermektedir. Yine sağdaki şema fotoğrafın çekildiği yeri temsil ediyor.

Ok ucu, tungsten elektrotun konumunu gösterir ve ok, optik fiberin konumunu gösterir. Sıçan pre limbik korteksten kaydedilen bu örnek iz, mavi çubukla gösterildiği gibi her biri 10 milisaniye boyunca ışık darbeleri olan mavi 473 nanometrenin 20 hertz iletimine yanıt olarak tetiklenen iki aksiyon potansiyelinde kanal kırmızılarını gösterir. Aşağıda. Raster grafiği, altı temsili nöronda kanal redsin kaynaklı ani yükselmeyi gösterir.

Her birim aktivite bir nokta olarak çizilir. Bu örnek iz, aynı beyin bölgesindeki yeşil çubukla gösterildiği gibi 10 saniye boyunca sürekli yeşil 532 nanometre ışık aydınlatması sırasında spontan aktivitenin hall opsin kaynaklı baskılanmasını göstermektedir. Raster grafiği, altı temsili nöronda haller dosinin neden olduğu susturmayı gösterir.

Her birim aktivite bir nokta olarak çizilir. Bu görüntü, kayıtların başlamasından 0, 30, 60, 90 ve 120 dakika sonra elde edilen ışığın uyarılmış, sivrilen, in-vivo voltaj izlerinin bir sıçan prelimpik parametal nöronunun tekrarlayan 20 hertz kanal opsin tahrikli sivrilmesini göstermektedir. Sağ tarafta, raster çizimi, ışık kaynaklı aktivasyonun 61 tekrarının tümünü gösterir.

Her birim aktivite bir nokta olarak çizilir. Burada in vivo, Haller Dossin transdüksiyonlu sıçan dorsal sicm'den alınan elektrofizyolojik kayıtlar üstte gösterilmektedir. Örnek iz, Hall Dobson'u ifade eden dorsal submun yeşil çubuğu ile gösterilen 10 saniyelik sürekli 532 nanometre aydınlatmanın spontan aktiviteyi ortadan kaldırdığını göstermektedir.

Aşağıda, yukarıdaki izden kaydedilen iki birimin ortalama dalga biçimleri bulunmaktadır. Genlik eşiği, iki farklı nöronu tanımlamak için kullanıldı. Son olarak, raster çizimi, bu birimlerin Haller dozunun neden olduğu susturulmasının beş tekrarını gösterir.

Her birim aktivite bir nokta olarak çizilir. Son olarak, bu görüntü, 0, 30, 60, 90 ve 120 dakika zaman noktalarında elde edilen, uyarılmış, sivrilen ışığın in vivo voltaj izlerini bir sıçan dorsal subular nöronunun tekrarlayan 20 hertz kanal opsin güdümlü sivrilmesini göstermektedir. Kayıtların başlangıcı solda gösterildikten sonra, aşağıdaki iç kısım bu hücrenin tipik patlama etkinliğini gösterir.

Sağdaki raster çizimi, ışık kaynaklı aktivasyonun 61 tekrarının tümünü gösterir. Her birim aktivite bir nokta olarak çizilir. Bu teknik önemlidir, çünkü belirli nöral alt tiplerin uzun süreler boyunca aktive edilebileceğini veya susturulabileceğini gösterir.

Aslında, nöronları iki saatten fazla bir süre boyunca aktive edebileceğimizi ve uyguladığımızı gösterdik. Nihayetinde amaç, bunu dikkat veya hafıza görevlerini yerine getiren hayvanlarda davranan hayvana uygulamak olacaktır, böylece belirli devreleri aktive edebilir ve bunun farklı hafıza fonksiyonlarını nasıl kontrol ettiğini görebiliriz.