Name: Kan ve Kültür Medya türetilen Exosomes saflaştırılması ve microRNA Profil (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-14T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: Öğrenin, kan ve hücre kültür medyasından ekzosomları diferansiyel santrifüjasyonla saflaştırarak mikroRNA profilleme yöntemini. Bu teknik, biyobelirteç keşfi ve terapötik uygulamalar için kritik öneme sahiptir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Rita Allen Vakfı hibe Seena Ajit fon tarafından desteklenmiştir. Yazarlar alet kullanımı, bilimsel ve teknik yardım için Güney Carolina Elektron Mikroskopi Merkezi Üniversitesi&#39;nden Erika Balogh ve Dr Soumitra Ghoshroy kabul etmek istiyorum.

Insan ve kemirgenler kan örnekleri kullanan tüm deneyler ilgili tüm kurallar, düzenlemeler ve düzenleyici kurumlar uygun olarak idam edildi. İnsan konular Tıp Kurumsal Değerlendirme Kurulu Drexel University College ve hayvanlar kullanıldı çalışmaları için tüm prosedürleri Drexel en Kurumsal Hayvan Bakım tarafından onaylanmış ve Kullanım Kurulu edildi onayladığı bilgilendirilmiş onam verdikten sonra alındı. 1. Blood Exosome saflaştırma (~ 5.5 saat) İPUÇLARI <ul><li class="jove_content"> Biz Mirvana miRNA izolasyon kiti 300 ul RNA lizis tamponu kan bir tüp (~ 10 ml insan kanı ve ~ 2 ml fare kan) den exosomes tekrar süspansiyon. </li><li class="jove_content"> Hücre kültürü ortamından exosomes arındırmak için, ortam hücreleri çıkarmak için 10 dakika boyunca 500 xg&#39;de bükülmüş ve 12,000 x g&#39;de santrifüj işleminden sonra 0.22 um bir filtre ile filtre edilir. Hücre kültürü ortamından saflaştırılması exosomePBS, PBS yıkama veya ikinci ultrasantrifugasyon adımda bir seyreltme gerektirmez. </li><li class="jove_content"> Saflaştırılmış exosomes ultrasantrifugasyon aşamasından sonra bir sükroz gradyent santrifügasyonu adım ekleyerek, proteomik çalışmaları için kullanılacak ise protein agregatlarının ve kirletici 15 miktarını azaltacaktır. </li><li class="jove_content"> Exosomes gözlenen morfolojisi, kaynak ve TEM için işlem adımları iki bağlı olarak farklılık gösterebilir. Daha önce numune işleme 9,15 farklılıkları isnat edilmiştir exosomes için fincan şeklinde morfolojisi gözlenmedi. Immunogold etiketleme dahil olmak üzere TEM görüntüleri exosomes 9,16,17 edilen safra ve kortikal kültür kan, dahil olmak üzere farklı kaynaklardan önceki raporlar benzer. </li></ul><ol><li> 10-60 dakika oda sıcaklığında dik 5x ve yer kan içeren EDTA kaplı tüp ters. </li><li> 4 ° C&#39;de 15 dakika boyunca 2000 x g&#39;de santrifüje </li&gt; <li> 15 ml tüpler üst tabaka, plazma, toplayın ve buz üzerinde tutmak. </li><li> PBS eşit bir hacmi ile akışkan seyreltin. 4 az 2,000 x g&#39;de 30 dakika santrifüje ° C </li><li> 4 ° C de, santrifüj tüpleri 24 ml toplam hacmi için 1X PBS ekleyin ve 12,000 x g hızında 45 dakika santrifüj transfer </li><li> 4 ° C&#39;de tüpler ultrasantrifüjdeki ve 110.000 xg 2 saat santrifüj transfer </li><li> PBS içinde yeniden süspanse pelet ve 4 ° C&#39;de 100,000 xg&#39;de 1 saat santrifüj </li><li> Uygun bir tampon içinde süspanse pelet (RNA lizis tamponu). </li><li> Elektron mikroskopisi ve Western blot analizi için sırasıyla PBS veya RIPA tampon içerisinde yeniden süspanse edin. </li></ol> 2. Bir Modifiye Mirvana miRNA İzolasyon Kiti (~ 1 saat) kullanarak RNA Arıtma İPUÇLARI <ul><li class="jove_content"> , Kişisel koruyucu ekipman (KKE) giyerek RNA izole RNaz Zap ile yüzeyleri ve pipetler silme ve steril filtre ipuçları ve borulu için zemin hazırlayın. </li><liclass = &quot;jove_content&quot;&gt; satıcıdan protokol sadece miRNA arıtma seçeneği verir de, her zaman ikimiz de aynı örnekten çalışma böylece mRNA olmak üzere toplam RNA izole ve miRNA. </li><li class="jove_content"> Bir on-sütunu DNase işleme aşamasına eklenmesi mevcut olabilir DNA izlerini ortadan kaldırır. Exosomes kaynağına bağlı olarak, DNA fare ve insan mast hücresi çizgileri 8 aynı kromozomal DNA dizilerinin kültür kardiyomiyositlerde 18. ortamdan saflaştırılmıştır exosomes tespit edilmiştir dahil olmak üzere bazı kaynaklardan saflaştırılmış exosomes katılmamış olduğu bildirilmiştir. </li><li class="jove_content"> Satıcı sadece yeterli bir 700 ul eklenmesi için çözüm 1 yıkayın sağlar çünkü yıkama solüsyonu 1-350 ul (aşağıda Adım 2.4) hacmi azalır. Hacmi azalır değilse tüm kit içeriğini kullanarak için sol yeterli çözüm değildir. Kalan adımları üretici tavsiyelerine göre yapıldı. </li></ul><ol><li> 1/10 vo ekleme10 dakika boyunca buz üzerinde MiRNA homojeni katkı maddesi (30 ul) ve inkübe lume. </li><li> Asit-fenol hacmi ile ektraktlayınız: başlangıç ​​lizat hacmi eşit kloroform yer alır. Santrifüj ve yeni bir tüp içinde üst faz kurtarmak. </li><li> 1.25 hacimleri% 100 etanol (375 ul) ekleyin. Vortex. Kartuş filtre ve 10.000 x g az 15 saniye santrifüj için geçerlidir. </li><li> Tavsiye hacmi miRNA Yıkama Çözeltisi 1 (350 ul) yarısı ekleyin ve 10.000 x g az 15 saniye santrifüj. </li><li> Her bir numune için 10 ml DNase 1-70 ul tampon RDD (Qiagen) ekleyin. Sütun 80 ul ekle ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edilir. </li><li> Çözüm 1 yıkayın (350 ul) ve 10,000 x g&#39;de 15 saniye santrifüj ekleyin. </li><li> Yıkama Çözeltisi ekleme 2/3 (500 ul) ve 10,000 x g&#39;de 15 saniye santrifüj. TEKRAR. </li><li> 40 ul 95 ile Zehir ° C nükleaz içermeyen H 2 O </li><li> RNA konsantrasyonu belirlemek ve 100 ng / ul RNA seyreltin. </li></ol> 3. Bloo gelen Exosomes bir miRNA Profild Taqman Düşük Yoğunluklu Array (TLDA) Kartlar (~ 6.5 saat) kullanarak İPUÇLARI <ul><li class="jove_content"> , KKD giyerek RNA izole RNaz Zap ile yüzeyleri ve pipetler silme ve steril filtre ipuçları ve borulu için zemin hazırlayın. </li><li class="jove_content"> Ön amplifikasyon (pre-amp) adım 1-350 ng RNA (350-1,000 ng örnekleri cDNA sentezi sonra pre-amp adım gerektirmeyen) için önerilir. Bu eşit koşullar altında tüm örnekler tedavi gerekir çünkü pre-amp da örnek için gerekli olup olmadığını belirlemek için önemlidir. Pre-amp adım maliyet ekler ve Ct değerleri daha düşük kabul edilebilir bir kesim kapalı (32 yerine 40) var. </li><li class="jove_content"> Bu, tek bir gün içinde çalıştırılabilir kart sayısı ile ilgili olarak bir levhası yerine şerit tüpler içinde cDNA reaksiyon hazırlamak için yararlıdır. Bu, aynı gün işleme olmayacak edilen cDNA örnekleri arasında donma-çözülme en aza indirecektir. </li><li class="jove_content"> Farklı kaynaklardan toplanan Exosomes yönün varRNA miktarda kira. Bu protokol, cDNA sentezi için reaksiyon için 3 ul RNA şablonu azami izin verir. Kaynağına bağlı olarak, izole edilebilir exosomal RNA miktarı belki de sınırlıdır. Tipik bir doku cDNA, 3 ul hacim içinde 100 ng RNA, insan kanı ya da hücre kültür ortamından exosomes yapılmış olacağı kadar RNA verim olur ise genellikle daha az RNA içeren ve cDNA daha az başlangıç ​​malzemesinden yapılmış olmalıdır. Fare kan exosomes RNA yüksek seviyelerde içeren ve 3 ul içinde, en az 100 ng elde edilebilir. </li></ul><ol><li> Megaplex Havuzları kullanarak RNA saflaştırılmış cDNA hazırlamak için transkriptaz primer (A Grubu ve B Grubu mikroakışkan kartlarında miRNA&#39;lar için astar içeren Dizi A ve B) tersine, buz üzerinde reaksiyon bileşenleri çözülme. </li><li> Etiket RT A Grubu astar veya B Grubu astar ile reaksiyona ve grafik için bileşenleri eklemek için iki RNaz ücretsiz 1.5 ml tüpler. 2 veya daha fazla reaksiyon için bileşenlerin en az bir ekstra hacim ekleme veya t tarafından önerilen bir ana karışımı yapmako satıcı. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> RT reaksiyon Bileşen </td><td> Bileşen Konsantrasyon </td><td> 1 adet numune için hacmi (toplam V / örnek = 4.5 ul) </td></tr><tr><td> Nükleaz içermeyen su </td><td></td><td> 0.20 ul </td></tr><tr><td> Megaplex RT tamponu (10x) </td><td> 1X </td><td> 0.80 ul </td></tr><tr><td> dNTP (100 mM) </td><td> 4.4 mM </td><td> 0.20 ul </td></tr><tr><td> MgCl2 (25 mm) </td><td> 5 mM </td><td> 0.90 ul </td></tr><tr><td> RNaz İnhibitör (20U/μl) </td><td> 2 U </td><td> 0.10 ul </td></tr><tr><td> Megaplex RT Astarlar A veya B (10X) </td><td> 1X </td><td> 0.80 ul </td></tr><tr><td> Ters Transkriptaz MultiScribe </td><td> 75 U </td><td> 1.50 ul </td></tr></tbody></table><ol start="3"><li> Tüpler invert 6 kez ve yüzdekısaca rifuge. Daha sonra, pipet 4,5 MicroAmp içine ul RT reaksiyon karışımı 8-tüp Şeritler veya 96-MicroAmp optik reaksiyon plakası. </li><li> RNA 100 ng ekleyin ve DEPC arıtılmış su ile 3 ul ses seviyesini ayarlamak ya da 3 ul toplam RNA ekleyin, pipet ucu ile karıştırın ve tüpler veya plaka mühür. Kısaca Spin ve 5 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edilir. </li><li> PCR makineye reaksiyon yükleyin ve (gibi Applied Biosystems Megaplex Havuzları protokolü tarafından önerilir) aşağıdaki koşullar altında çalıştırın: </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> Sahne </td><td> Sıcaklık </td><td> Zaman </td></tr><tr><td> Çevrim (40x) </td><td> 16 ° C </td><td> 2 dakika </td></tr><tr><td></td><td> 42 ° C </td><td> 1 dakika </td></tr><tr><td></td><td> 50 ° C </td><td> 1 sn </td></tr><tr><td> Tutmak </td><td> 85 ° C </td><td> 5 dakika </td></tr><tr><td> Tutmak </td><td> 4 ° C </td><td> ∞ </td></tr></tbody></table><ol start="6"><li> -20 ° C&#39;de (en az bir hafta için iyi) cDNA depolamak ya da bir hafta boyunca muhafaza edilebilir ön-ampi adıma devam eder. </li><li> Buz üzerinde A Grubu ve B Grubu için Preamp astar çözülme ve karıştırmak için ters. Girdap Taqman Pre-Amp ana karıştırın ve buz üzerinde tutmak. </li><li> 2 veya daha fazla reaksiyon için bileşenlerin en az bir ekstra hacim ekleme şeması takip veya satıcı tarafından önerilen ana karışımı yapmak. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> Pre-Amp Reaksiyon Bileşen </td><td> 1 örnek için ses </td></tr><tr><td> Nükleaz içermeyen su </td><td> 7.5 ul </td></tr><tr><td> Taqman Preamp Master Mix (2X) </td><td> 12.5 ul </td></tr><tr><td> Megaplex Preamp Astarlar A veya B (10X) </td><td> 2.5 ul </td></tr></tbody></table><ol start="9"><li> Pipet 2.5 ul RT süredenct MicroAmp içine 8-tüp Şeritler veya 96-MicroAmp optik reaksiyon plaka ve her kuyuya 22.5 ul Preamp reaksiyon karışımı dağıtmak. </li><li> Buz 5 dk inkübe plaka, mühür ve daha sonra PCR makineye örnek yükleyin. Aşağıdaki koşullar altında çalıştırın. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> Sahne </td><td> Sıcaklık </td><td> Zaman </td></tr><tr><td> Tutmak </td><td> 95 ° C </td><td> 10 dakika </td></tr><tr><td> Tutmak </td><td> 55 ° C </td><td> 2 dakika </td></tr><tr><td> Tutmak </td><td> 72 ° C </td><td> 2 dakika </td></tr><tr><td> Çevrim (12x) </td><td> 95 ° C </td><td> 15 sn </td></tr><tr><td></td><td> 60 ° C </td><td> 4 dk </td></tr><tr><td> Tutmak </td><td> 99.9 ° C </td><td> 10 dakika </td></tr><tr><td> Tutmak </td><td> 4 ° C </td><td> ∞ </td></tr></tbody></table><ol start="11"><li> Preamp reaksiyon tamamlandıktan sonra, kısa bir süre tüpler veya plaka santrifüj ve sonra her iyi ya da tüp 75 ul 0.1x TE pH 8.0 ekleyin. </li><li> Seal ve karıştırın ve kısaca döndürün. -20 ° C&#39;de bir hafta seyreltilmiş ürün saklayın veya plaka yüklemek için devam. </li><li> Buz üzerinde bir RNaz içermeyen 1.5 ml&#39;lik bir tüp içinde, aşağıdaki birleştirin. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> Bileşen </td><td> 1 kart için ses </td></tr><tr><td> Taqman Evrensel PCR Master Mix, yok AmpErase UNG (2X) </td><td> 450 ul </td></tr><tr><td> Seyreltilmiş preamp ürün </td><td> 9 ul </td></tr><tr><td> Nükleaz içermeyen su </td><td> 441 ul </td></tr></tbody></table><ol start="14"><li> Karıştırın ve kısaca santrifüj için tüp ters. Taqman MicroRNA Dizi kart her portuna 100 ul PCR karışımı koyun. </li><li> 1 dakika boyunca kartı 2 x 1.000 x g&#39;da santrifüj. Kart mühür ve Uygulamalı Biyosistem manuel ve 384 Taqman Düşük Yoğunluklu Array ayarlarında astar birlikte verilen şablonu kullanarak çalıştırın. Biz Uygulamalı Biyosistem 7900HT Hızlı Real-Time PCR sistemi kullanın. </li></ol> 4. Taqman (~ 1.5 saat) ile analiz mRNA <ol><li> QPCR reaksiyon hazırlamak için, grafik sırayla reaksiyon bileşenleri karıştırın. Tüm numuneler normalleştirici gen olarak faiz hem de 18S rRNA geni için astar probları ile analiz edilecektir. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> Taqman Reaksiyon Bileşen </td><td> 1 örnek için ses </td></tr><tr><td> Nükleaz içermeyen su </td><td> 7 ul (bireysel örnek göre ayarlayın) </td></tr><tr><td> Taqman Hızlı Master Mix (2X) </td><td> 10 ul </td></tr><tr><td> Taqman Primer sondalar (20x) </td><td> 1 ul </td></tr><tr><td> 100 ng RNA, cDNA </td><td> 2 ve mu, L (tek tek örnek göre ayarlayın) </td></tr></tbody></table><ol start="2"><li> Üreticisi (Biyosistem 7900HT Hızlı Real-Time PCR Sistemi Uygulamalı) tarafından tavsiye edilen hızlı 96-blok kullanarak 96 plaka çalıştırın. </li></ol>

<ol><li>Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs%3A+target+recognition+and+regulatory+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs: target recognition and regulatory functions.</a> Cell. 136, 215-233 (2009).</li>
<li>Mendell, J. T., Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+in+stress+signaling+and+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs in stress signaling and human disease.</a> Cell. 148, 1172-1187 (2012).</li>
<li>Esteller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-coding+RNAs+in+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Genetics%22%5BJournal%5D)">Non-coding RNAs in human disease.</a> Nature reviews. Genetics. 12, 861-874 (2011).</li>
<li>Mitchell, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+microRNAs+as+stable+blood-based+markers+for+cancer+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 10513-10518 (2008).</li>
<li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+microRNAs+in+serum%3A+a+novel+class+of+biomarkers+for+diagnosis+of+cancer+and+other+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+research%22%5BJournal%5D)">Characterization of microRNAs in serum: a novel class of biomarkers for diagnosis of cancer and other diseases.</a> Cell research. 18, 997-1006 (2008).</li>
<li>Gilad, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+microRNAs+are+promising+novel+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Serum microRNAs are promising novel biomarkers.</a> PloS one. 3, e3148(2008).</li>
<li>Mittelbrunn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unidirectional+transfer+of+microRNA-loaded+exosomes+from+T+cells+to+antigen-presenting+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Unidirectional transfer of microRNA-loaded exosomes from T cells to antigen-presenting cells.</a> Nature. 2, 282(2011).</li>
<li>Valadi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosome-mediated+transfer+of+mRNAs+and+microRNAs+is+a+novel+mechanism+of+genetic+exchange+between+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells.</a> Nat Cell Biol. 9, 654-659 (2007).</li>
<li>Gyorgy, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+vesicles%2C+current+state-of-the-art%3A+emerging+role+of+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Membrane vesicles, current state-of-the-art: emerging role of extracellular vesicles.</a> Cell Mol Life Sci. 68, 2667-2688 (2011).</li>
<li>Mathivanan, S., Ji, H., Simpson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes%3A+extracellular+organelles+important+in+intercellular+communication%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Exosomes: extracellular organelles important in intercellular communication.</a> J. Proteomics. 73, 1907-1920 (2010).</li>
<li>Ramachandran, S., Palanisamy, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Horizontal+transfer+of+RNAs%3A+exosomes+as+mediators+of+intercellular+communication%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdiscip+Rev.+RNA%22%5BJournal%5D)">Horizontal transfer of RNAs: exosomes as mediators of intercellular communication.</a> Wiley Interdiscip Rev. RNA. , (2011).</li>
<li>Record, M., Subra, C., Silvente-Poirot, S., Poirot, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+as+intercellular+signalosomes+and+pharmacological+effectors%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Exosomes as intercellular signalosomes and pharmacological effectors.</a> Biochem Pharmacol. 81, 1171-1182 (2011).</li>
<li>Thery, C., Ostrowski, M., Segura, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+vesicles+as+conveyors+of+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Membrane vesicles as conveyors of immune responses.</a> Nat Rev Immunol. 9, 581-593 (2009).</li>
<li>Ludwig, A. K., Giebel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes%3A+small+vesicles+participating+in+intercellular+communication%5BTitle%5D)+AND+%22The+international+journal+of+biochemistry+%26+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Exosomes: small vesicles participating in intercellular communication.</a> The international journal of biochemistry & cell biology. 44, 11-15 (2012).</li>
<li>Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+exosomes+from+cell+culture+supernatants+and+biological+fluids%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids.</a> Curr. Protoc. Cell Biol. Chapter 3, Unit 3 22(2006).</li>
<li>Masyuk, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biliary+exosomes+influence+cholangiocyte+regulatory+mechanisms+and+proliferation+through+interaction+with+primary+cilia%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+physiology.+Gastrointestinal+and+liver+physiology%22%5BJournal%5D)">Biliary exosomes influence cholangiocyte regulatory mechanisms and proliferation through interaction with primary cilia.</a> American journal of physiology. Gastrointestinal and liver physiology. 299, G990-G999 (2010).</li>
<li>Fauré, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+are+released+by+cultured+cortical+neurones%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Exosomes are released by cultured cortical neurones.</a> Molecular and Cellular Neuroscience. 31, 642-648 (2006).</li>
<li>Waldenstrom, A., Genneback, N., Hellman, U., Ronquist, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiomyocyte+microvesicles+contain+DNA%2FRNA+and+convey+biological+messages+to+target+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Cardiomyocyte microvesicles contain DNA/RNA and convey biological messages to target cells.</a> PloS one. 7, e34653(2012).</li>
<li>Simpson, R. J., Lim, J. W., Moritz, R. L., Mathivanan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes%3A+proteomic+insights+and+diagnostic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Exosomes: proteomic insights and diagnostic potential.</a> Expert Rev Proteomics. 6, 267-283 (2009).</li>
<li>Turchinovich, A., Weiz, L., Langheinz, A., Burwinkel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+extracellular+circulating+microRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">Characterization of extracellular circulating microRNA.</a> Nucleic acids research. 39, 7223-7233 (2011).</li>
<li>El-Andaloussi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosome-mediated+delivery+of+siRNA+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Exosome-mediated delivery of siRNA in vitro and in vivo.</a> Nature. 7, 2112-2126 (2012).</li>
<li>Singh, P. P., Smith, V. L., Karakousis, P. C., Schorey, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+isolated+from+mycobacteria-infected+mice+or+cultured+macrophages+can+recruit+and+activate+immune+cells+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Exosomes isolated from mycobacteria-infected mice or cultured macrophages can recruit and activate immune cells in vitro and in vivo.</a> J. Immunol. 189, 777-785 (2012).</li>
<li>Etheridge, A., Lee, I., Hood, L., Galas, D., Wang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+microRNA%3A+A+new+source+of+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat.+Res%22%5BJournal%5D)">Extracellular microRNA: A new source of biomarkers.</a> Mutat. Res. , (2011).</li>
<li>Stenvang, J., Silahtaroglu, A. N., Lindow, M., Elmen, J., Kauppinen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+utility+of+LNA+in+microRNA-based+cancer+diagnostics+and+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+cancer+biology%22%5BJournal%5D)">The utility of LNA in microRNA-based cancer diagnostics and therapeutics.</a> Seminars in cancer biology. 18, 89-102 (2008).</li>
<li>Mathivanan, S., Fahner, C. J., Reid, G. E., Simpson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ExoCarta+2012%3A+database+of+exosomal+proteins%2C+RNA+and+lipids%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">ExoCarta 2012: database of exosomal proteins, RNA and lipids.</a> Nucleic acids research. 40, D1241-D1244 (2012).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Bu protokol, kan ve kültür ortamından diferansiyel santrifüj saflaştırılmış exosomes gelen miRNA&#39;lar ve mRNA miktarının gösterir. Exosomes kökenlerine bağlı çeşitli bileşenleri ve immün yanıt, antijen sunumu, hücre içi iletişim ve RNA ve protein 9,11,12,19,20 devri de dahil olmak üzere biyolojik fonksiyonları, bir dizi olarak katılıyor. Büyüklüğü ve şekli exosome saflık belirleyici iken EM exosomes veri gösteren bir dizi çalışma, bu veziküller da tespit için kullanılan yöntemi hem de salgılanan kaynak ve ...

Kısa noncoding miRNA&#39;lar hedef mRNA bağlanarak gen modüle. ~ 7 baz çifti tamamlayıcılığı tohum sırası çevirinin engellenmesi ya da hedef proteinin 1 azalmış ekspresyonu neden olabilir, her ikisi de mRNA, kararlılığını azalma ile sonuçlanan hedef mRNA bağlamak için MiRNA sağlar. Son on yılda Araştırma tümden hücresel fonksiyonları aracılık miRNA&#39;lar için temel bir rol kanıtlamıştır. Ayrıca çeşitli hastalıklar 2,3 altında yatan miRNA aracılı moleküler değişiklikler diseksiyon yönelik önemli çaba olmuştur. Ayrıca, vücut sıvıları 4-6 istikrarlı miRNA&#39;lar son belirlenmesi klinik tanı için uygun yeni biyolojik olarak kendi kullanımı için yolu açtı. Vücut sıvıları içinde miRNA ulaşım bir mod sistemik kan dolaşımdaki ile alıcı hücrelere exosomes, mRNA taşıyan küçük kesecikler, protein, lipid arabulucular ve miRNA&#39;lar üzerinden gerçekleştiriliriyon 7-14. Alıcı hücrelerde gen ifadesinin modülasyonunda ve bu sonuçlar hücresel iletişim için yeni bir mekanizmayı temsil etmektedir. Örneğin, hücre büyüme faktörü-β5 (TGFβ5) dönüşüm, salgılayan ve / veya interlökin-1β (IL1β), tümör nekroz faktörü-α (TNF) gibi inflamasyon dahil biyomoleküllerin içeren emici exosomes tarafından immün-düzenleyici işlemleri modüle ve olabilir Bu genlerin 13 düzenleyen miRNA&#39;lar. Anormal miRNA ifade insan hastalıklarının çeşitli ortak bir özelliktir gibi, bu moleküller yeni tedavi hedefleri 2 keşif ve doğrulama için heyecan verici yeni fırsatlar sunmaktadır. Dolaşım miRNA&#39;ların tüm vücut sıvılarında mevcut olan ve exosomes kompozisyonu, serbest bırakıldıktan hangi kaynak hücrelere göre farklı olduğu bilinmektedir. Böylece, hücrelerin fizyolojik durumunu incelemek için bir yol sunar ve nasıl hücrelerde bile sinyal değişiklik gösterecektirhastalıklar da dahil olmak üzere strese yanıt olarak ts. Exosome kompozisyon değişiklikler okuyan sinyal iletimi ilişkin bilgi sağlar ve biyolojik ya da terapötik müdahale yolları olarak potansiyellerini programını araştırabilirsiniz. Burada yayınlanan protokollere dayalı birden fazla kaynaktan exosomes en arıtma gösterecektir. Bu exosomes exosomes mevcut miRNAs seviyelerini tespit etmek ve ölçmek için QPCR ardından RNA izolasyonu için kullanılır.

<table><tbody><tr><td>EDTA kaplı vakutainer (10 ml tüpler)</td><td>BD Diagnostics</td><td>366643</td><td>İnsan kanından eksozom saflaştırması için</td></tr><tr><td>EDTA kaplı vakutainer (2 ml tüpler)</td><td>BD Diagnostics</td><td>367841</td><td>Fare kanından eksozom saflaştırması için</td></tr><tr><td>PAXgene Kan RNA Tüpü</td><td>BD Teşhis</td><td>762165</td><td>Toplam kandan miRNA izolasyonu için miRVana</td></tr><tr><td>mikroRNA izolasyon kiti</td><td>Ambion</td><td>AM1561</td><td></td></tr><tr><td>Asit-Fenol: CHCl3</td><td>Ambion</td><td>9721G</td><td></td></tr><tr><td>DNase 1</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Universal PCR Master Mix, AmpErase Yok UNG</td><td>TLDA kartları için</td><td>Uygulamalı Biyosistemler</td><td>4326614</td></tr><tr><td>Megaplex RT kemirgen Havuz Seti v3.0</td><td>Uygulamalı Biyosistemler</td><td>4444746</td><td></td></tr><tr><td>Megaplex preamp kemirgen Havuz seti v3.0</td><td>Uygulamalı Biyosistemler</td><td></td><td></td>4444747</tr><tr><td>Taqman Dizisi Kemirgen MicroRNA A+B seti V3.0</td><td>Uygulamalı Biyosistemler</td><td>4444909</td><td></td></tr><tr><td>Megaplex RT İnsan Havuzu seti V3.0</td><td>Uygulamalı Biyosistemler</td><td>4444745</td><td></td></tr><tr><td>Megaplex Preamp İnsan Havuzu Seti v3.0</td><td>Uygulamalı Biyosistemler</td><td>4444748</td><td></td></tr><tr><td>Taqman Dizisi İnsan MicroRNA A+B Kartları Seti v3.0</td><td>Uygulamalı Biyosistemler</td><td>4444913</td><td></td></tr><tr><td>Taqman MicroRNA RT kiti</td><td>Uygulamalı Biyosistemler</td><td>4366596</td><td></td></tr><tr><td>Taqman hızlı evrensel PCR ana karışımı </td><td>mRNA qRT-PCR için</td> <td>Uygulamalı Biyosistemler</td><td>4366072</td></tr><tr><td>Tümör nekroz faktörü (primer probu)</td><td>Uygulanan Biyosistemler</td><td>Hs01113624_g1</td><td></td></tr><tr><td>Vasküler endotelyal büyüme faktörü A (primer probu)</td><td>Uygulanan Biyosistemler</td><td>Hs00900055_m1</td><td></td></tr><tr><td>Maxima First Strand cDNA RT-qPCR Thermo</td><td>Scientific</td><td>K1642</td> için <td>Sentez Kiti mRNA</td></tr><tr><td>HSP70 antikoru</td><td>için Abcam</td><td>ab94368</td><td>Batı lekesi için</td></tr><tr><td>Anti-tavşan IgG-Altın</td><td>Sigma</td><td>G7402</td><td>Elektron mikroskobu için</td></tr><tr><td>Tavşan-anti CD81</td><td>Sigma</td><td>SAB3500454</td><td></td></tr><tr><td>Nikel 300 mesh karbon formvar ızgaraları</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td>FCF300-Ni</td><td></td></tr><tr><td>Bakır 300 gözenekli karbon formvar ızgaraları</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td>FCF300-Cu</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Tablo 1. Spesifik reaktifler tablosu.</td></tr></tbody></table>

kan ve kültür medya türetilen exosomes saflaştırılması ve microrna profil

Purification and microRNA Profiling of Exosomes Derived from Blood and Culture Media

Kararlı miRNA&#39;lar tüm vücut sıvılarında bulunan ve bazı dolaşan miRNA&#39;lar exosomes adı verilen küçük kesecikler içinde haciz tarafından bozulması korunur. Exosomes hedef hücre RNA ve protein aktarımı ile sonuçlanan plazma zarı ile birleştirebilirler. Onların biyolojik fonksiyonları immün yanıt, antijen sunumu, ve hücre içi iletişim içerir. Kan yoluyla alıcı hücrelerde gen ifadesini düzenler miRNA&#39;lar teslimi hedef müdahale için yeni yollar açtı. Ilaç veya RNA terapötik ajanların teslimat için bir strateji sunan ek olarak, exosomal içeriği tedavi seçenekleri ve prognoz belirlenmesinde, tanıda yardımcı olabilir biyolojik olarak hizmet verebilir. Burada kantitatif kan ve hücre kültür ortamı içinde salgılanan exosomes gelen miRNA&#39;lar ve haberci RNA&#39;lar (mRNA) analiz için prosedür anlatacağız. Saf exosomes exos için western blot analizi ile karakterize olacakilgi mRNA için OMAL işaretleri ve PCR. Transmisyon elektron mikroskobu (TEM) ve immunogold etiketleme exosomal morfolojisi ve bütünlüğünü doğrulamak için kullanılacaktır. Toplam RNA biz aynı örnekten mRNA ve miRNA hem eğitim sağlamak için bu exosomes arınmış olacaktır. Bioanalyzer RNA bütünlüğünü doğrulayarak sonra, Taqman Alçak Yoğunluk Array (TLDA) kartları ve ilgi transkript için gen ekspresyon çalışmaları kullanarak exosomal miRNA tanımlamak için orta düzeyde kantitatif gerçek zamanlı PCR (qPCR) gerçekleştirir. Bu protokoller, farmakolojik müdahale öncesi ve sonrasında, kemirgen modelleri ve hücre kültür ortamı içinde exosomal miRNAs değişiklikleri ölçmek için kullanılabilir. Exosomal içeriği nedeniyle kökenli kaynağı ve salgılayan exosomes bu hücrelerin fizyolojik koşullara değişir. Bu varyasyonlar hücreler ve sistemler stres veya fizyolojik değişimleri ile baş nasıl fikir sağlayabilir. Bizim temsilcisi veri v gösteriyormiRNA&#39;lar içinde ariations fare kan, insan kanı ve insan hücre kültürü ortamı arındırılmış exosomes mevcut. Burada kantitatif kan ve hücre kültür ortamı içinde salgılanan exosomes gelen miRNA&#39;lar ve haberci RNA&#39;lar (mRNA) analiz için prosedür anlatacağız. Saf exosomes ilgi mRNA için exosomal işaretleri ve PCR için western blot analizi ile karakterize edilecektir. Transmisyon elektron mikroskobu (TEM) ve immunogold etiketleme exosomal morfolojisi ve bütünlüğünü doğrulamak için kullanılacaktır. Toplam RNA biz aynı örnekten mRNA ve miRNA hem eğitim sağlamak için bu exosomes arınmış olacaktır. Bioanalyzer RNA bütünlüğünü doğrulayarak sonra, Taqman Alçak Yoğunluk Array (TLDA) kartları ve ilgi transkript için gen ekspresyon çalışmaları kullanarak exosomal miRNA tanımlamak için orta düzeyde kantitatif gerçek zamanlı PCR (qPCR) gerçekleştirir. Bu protokoller exosomal miRNAs değişiklikleri ölçmek için kullanılabilir ifarmakolojik müdahale öncesi ve sonrası n hasta, kemirgen modelleri ve hücre kültür ortamı. Exosomal içeriği nedeniyle kökenli kaynağı ve salgılayan exosomes bu hücrelerin fizyolojik koşullara değişir. Bu varyasyonlar hücreler ve sistemler stres veya fizyolojik değişimleri ile baş nasıl fikir sağlayabilir. Bizim temsilcisi veri miRNA&#39;lar farklılıklar fare kan, insan kanı ve insan hücre kültürü ortamı arındırılmış exosomes mevcut göstermek

Kan ya da hücre kültür ortamından izole exosomes sonra exosomes saflığı elektron mikroskopisi (EM) ve Western Blot (Şekil 1A ve 1B) ile test edilebilir. Biz EM ve birden fazla antikor kullanarak western blot ile çeşitli kaynaklardan bizim exosome hazırlıkları doğruladı. Şekil 1A exosomes ~ çapında 30 -100 nm ile sağlam ve immunogold etiketleme ile CD81 içeren teyit EM görüntüleri gösterir. Yaygın olarak kullanılan exosomal işaretleri Hsp70 ve tetraspannin aile glikoprot...

Exosomes istikrarlı microRNA (miRNA&#39;lar) varlığı biyolojik olarak ve terapötik müdahale için bir yol olarak potansiyel programı için, hücreler arası iletişim yeni bir mod olarak büyük ilgi üretti. Burada taşınmaları miRNAs tespit etmek kantitatif PCR tarafından takip edilir ve kan kültür ortamından saflaştırılması exosome göstermektedir.

Kan ve Kültür Medya türetilen Exosomes saflaştırılması ve microRNA Profil

Stable miRNAs are present in all body fluids and some circulating miRNAs  are protected from degradation by sequestration in small vesicles called  ...

Bu prosedürün genel amacı, kandan veya hücre kültürü ortamlarından elde edilen eksozomlarda bulunan mikroRNA'ları tanımlamak ve miktarlarını belirlemektir. Bu işlem, öncelikle diferansiyel santrifüjasyon kullanılarak kan veya hücre kültürü ortamından eksozomların saflaştırılmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım ise bir nirvana micro RNA izolasyon kiti kullanarak toplam eksozomal RNA'nın saflaştırılmasıdır.Saflaştırılmış RNA'nın bütünlüğü ve konsantrasyonu doğrulandıktan sonra, Megaplex ters transkriptaz reaksiyon kitindeki reaktifler kullanılarak cDNA'ya dönüştürülür. Ardından, Megaplex preamp primerleri ve TaqMan preamp master mix kullanılarak bir ön amplifikasyon adımı gerçekleştirilir. MikroRNA'ları amplifiye etmek için son adım, 384 kuyucuklu mikroakışkan kartlar veya kurutulmuş TaqMan primer probları içeren TaqMan düşük yoğunluklu dizi (LDA) kartları kullanılarak bir gerçek zamanlı PCR reaksiyonu yürütmektir.Nihayetinde, bu prosedür 758'e kadar bilinen mikroRNA'nın tespit edilmesini sağlayacaktır. Bu teknik, ekzosomal mikroRNA içeriğindeki, salgılanma kaynağına ve fizyolojik koşullara bağlı olan varyasyonları ölçer. Bu benzersiz imzaların miktarının belirlenmesinin etkileri, b

purification-microrna-profiling-exosomes-derived-from-blood-culture

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu kağıt, izolasyon, saflaştırma ve exosomes tespiti, moleküler içerik analizi teknikleri gibi yöntemleri gösteriyor. Bu yöntemler, hücre kültürü medya ve biyolojik sıvılarda exosome izolasyonu için uyarlanabilir ve moleküler içerik analizi ötesinde işlevsel çalışmalarda da yararlı olabilir.

RNA İçeren Exosomes İzolasyonu ve Karakterizasyonu

İnsan immün yetmezlik virüsü (HIV) partiküllerinden eksozomları ayırmak için bir gradyan prosedürünü tanımlayan teknikler açıklanmıştır. Bu prosedür, HIV ile enfekte olmuş bireylerden insan plazmasındaki HIV partiküllerinden eksozomları izole etmek için kullanıldı. İzole edilen eksozomlar sitokin / kemokin içeriği açısından analiz edildi.

HIV-1 pozitif Bireylerin Plazma eksozomlann izolasyonu

Safra sıvısı, potansiyel olarak önemli biyobelirteçler içeren hücre dışı veziküller/eksozomlar için değerli bir kaynaktır. Bu protokol, miRNA profillemesi de dahil olmak üzere daha ileri analizler için eksozomları insan safrasından izole etmek için sağlam bir yöntemi temsil eder.

İzolasyon ve profil MicroRNA içeren İnsan Bile dan ekzozomlar

MikroRNA'lar önemli bir düzenleyici rol oynar ve çeşitli insan hastalıkları için yeni bir terapötik hedef olarak ortaya çıkmaktadır. MiRNA'ların yüksek yoğunluklu lipoprotein taşınmaktadır gösterilmiştir. Hızla insan plazmasından MiRNA analizi için uygun, saflaştırılmış HDL izole edilmesi için basit bir yöntem geliştirdik.

Yüksek Saf Yüksek Yoğunluklu Lipoprotein gelen miRNA Yüksek koymak Through-İzolasyon için hızlı ve basitleştirilmiş Yöntemi

Kanda bulunan hücre dışı veziküller çeşitli hastalıklar için yeni biyobelirteçler olarak önerilmiştir. Burada, periferik kan örneklerinden büyük plazma zarından türetilmiş mikroparçacıkların izolasyonu ve bunların konvansiyonel akış sitometrisi ve Western Blot ile müteakip analizleri için bir protokol sunuyoruz.

Periferik kan Microvesicles izolasyonu ve özelliklerinin belirlenmesi

Burada, exosomes plazma ve serum exosomal kan proteinleri azaltılmış ortak arıtma ile arındırmak için bir protokol mevcut. En iyi duruma getirilmiş iletişim kuralı Ultrafiltrasyon, proteaz tedavi ve boyutu dışlama Kromatografi içerir. Exosomes yararları aşağı akım analizleri veziküller ve proteomik karakterizasyonu daha doğru miktar dahil olmak üzere, geliştirilmiş arıtma.

Protein sindirimi, Ultrafiltrasyon ve boyutu dışlama Kromatografi insan kan plazması ve Serum Exosomes yalıtım en iyi duruma getirmek için

Burada, iki hücre dışı vezikül yalıtım protokol, Ultrafiltrasyon Santrifüjü ve ultrasantrifüj ile yoğunluk gradient Santrifüjü ekstraselüler veziküller fare bronchoalveolar lavaj sıvı örneklerinden izole etmek, açıklamak. Fare bronchoalveolar lavaj sıvı her iki yöntem tarafından türetilmiş hücre dışı veziküller sayılabilir ve karakterize.

Üzerinden Ultrafiltrasyon tekniği Santrifüjü kullanarak fare Bronchoalveolar lavaj sıvı ekstrasellüler veziküller yalıtım

Bu iletişim kuralı, hücre kültür ortamından küçük RNA Kütüphane inşaat ve sonraki nesil sıralama ekstraselüler mikroRNA'lar arındırmak gösterilmiştir. Çeşitli kalite kontrol denetim noktaları ne exRNAs gibi düşük giriş örnekleri ile çalışırken olacağını anlamak okuyucuların izin açıklanmıştır.

İzole, sıralama ve insan Mezenkimal Kök hücreleri ekstrasellüler mikroRNA'lar analiz

Bir eksozom ilaç teslim taşıyıcıları yeni nesil olduğunu. Bir eksozom yalıtım protokolü ile yüksek verim ve saflık siRNA teslimat için kurduk. Biz de fluorescently etiketli non-spesifik siRNA exosomes kapsüllenir ve siRNA yüklü exosomes kanser hücreleri hücresel alımını araştırıldı.

SiRNA kanser hücrelerinin teslim için Exosomes hazırlanması

Bu protokol, 1) yetişkin fare gastroknemius kasından primer fibroblastların izolasyonunu ve kültürünü ve ayrıca 2) sükroz yoğunluk gradyanları ile birlikte diferansiyel bir ultrasantrifüj yöntemi kullanılarak eksozomların saflaştırılmasını ve karakterizasyonunu ve ardından western blot analizlerini göstermektedir.

İskelet Kası Fibroblastlarından Eksozomların İzolasyonu ve Karakterizasyonu

Öğrenin, kan ve hücre kültür medyasından ekzosomları diferansiyel santrifüjasyonla saflaştırarak mikroRNA profilleme yöntemini. Bu teknik, biyobelirteç keşfi ve terapötik uygulamalar için kritik öneme sahiptir.

Kan ve Kültür Medya türetilen Exosomes saflaştırılması ve microRNA Profil

Daha fazla video keşfet