Kan ve Kültür Medya türetilen Exosomes saflaştırılması ve microRNA Profil

Bu prosedürün genel amacı, kan veya hücre kültürü ortamından elde edilen eksozomlarda bulunan mikroRNA'ları tanımlamak ve niceliğini belirlemektir. Bu, önce eksozomların diferansiyel santrifüjleme kullanılarak kan veya hücre kültürü ortamından saflaştırılmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, bir nirvana mikro RNA izolasyon kiti kullanarak toplam ekzo omal RNA'yı saflaştırmaktır.

Saflaştırılmış RNA'nın bütünlüğünü ve konsantrasyonunu doğruladıktan sonra, Megaplex ters transkriptaz reaksiyon kitindeki reaktifler kullanılarak CDNA'ya dönüştürülür. Daha sonra, Megaplex preamp primerleri ve attack man preempt master mix kullanılarak bir ön amplifikasyon adımı gerçekleştirilir. MikroRNA'ları amplifiye etmek için son adım, 2 adet 384 kuyulu mikroakışkan kart veya kurutulmuş TAC MAN primer probları içeren TAC man düşük yoğunluklu dizi kartları kullanarak gerçek zamanlı bir PCR reaksiyonu çalıştırmaktır.

Sonuç olarak, bu prosedür bilinen 758'e kadar mikroRNA'nın tespit edilmesini sağlayacaktır. Bu teknik, salgılandıkları kaynağa ve fizyolojik koşullara bağlı olarak ekzozomal mikro RNA içeriğindeki varyasyonları ölçer. Bu benzersiz imzaların niceliksel olarak ölçülmesinin sonuçları, biyobelirteçlerin geliştirilmesine ve yeni terapötik müdahalelere kadar uzanır. Stratejiler.

Bu işleme başlamak için, antikoagülan ajanın karıştırılmasını sağlamak için 10 mililitre tam kan içeren EDTA kaplı bir tüpü beş kez ters çevirin ve oda sıcaklığında 10 ila 60 dakika dik olarak yerleştirin, ardından numuneyi 2000 kez G ve dört santigrat derecede santrifüjleyin kanı ayırmak için 15 dakika. 15 dakika sonra, tüpü santrifüjden çıkarın ve plazmayı 15 mililitrelik yeni bir tüpte toplayın. Plazmayı buzun üzerine yerleştirin ve eşit hacimde PBS ile seyreltin.

Daha sonra numuneyi nazikçe karıştırın ve 30 dakika boyunca 2000 kez G ve dört santigrat derecede santrifüj santrifüjüne yerleştirin. Ardından, numuneyi santrifüjden çıkarın. Yeni bir santrifüj tüpüne aktarın.

24 mililitreye bir XPBS ekleyin ve 45 dakika boyunca 12.000 kez G ve dört santigrat derecede santrifüjleyin. Daha sonra süpernatanı bir ultra santrifüj tüpüne aktarın ve iki saat boyunca 110.000 kez G ve dört santigrat derecede santrifüjleyin. İki saat sonra.

Numuneyi ultradan çıkarın ve süpernatanı bir pipetle dikkatlice çıkarın. Damağı soğutulmuş PBS'de yeniden süspanse edin ve numuneyi tekrar ultrasantrifüje yerleştirin. Santrifüjlemeyi takiben bir saat boyunca 100.000 kez G ve dört santigrat derecede döndürün.

Süpernatanı bir pipetle dikkatlice çıkarın ve damağı 300 mikrolitre RNA lizis tamponunda yeniden süspanse edin. Alternatif olarak, numune PBS veya RIPPA tamponunda askıya alınabilir. Sırasıyla elektron mikroskobu ve western blot analizi için, kişisel koruyucu ekipman giyerek, yüzeyleri ve pipetleri R a's zap ile silerek ve steril filtre uçları ve tüpleri kullanarak RNA'yı izole etmek için alanı hazırlayın.

Daha sonra, 350 nanogramdan daha büyük RNA'ya sahip numuneler için izole RNA'yı bir spektrometre ile ölçerek RNA'nın ön amplifikasyonunun gerekli olup olmadığını belirleyin, ilgilenilen transkript düşük bollukta olmadıkça amp amplifikasyonu gerekli olmayabilir. Ardından, megaplex havuzları kullanarak saflaştırılmış RNA'dan CD NA'yı hazırlayın. Ters transkriptaz primerleri.

Astarları buz üzerinde çözdürerek başlayın. Havuz A ve havuz B, mikroakışkan kart dizisi A ve B üzerindeki mikro RNA'lar için primerler içerirken, iki RNA'yı çözerken, havuz A primerleri veya havuz B primerleri ile ters transkripsiyon için 1.5 mililitrelik tüpleri etiketlerler ve metin protokolünde açıklandığı gibi bileşenlerden ayrı olarak her biri için ana karışımı hazırlarlar. Havuz A ve havuz B astarlarını ayrı tutmaya dikkat edin.

Daha sonra tüpleri ana karışımla altı kez ters çevirin ve santrifüjleyin, kısaca 4.5 mikrolitre RT reaksiyonu pipetleyin, mikro rampanın her bir tüpüne sekiz tüp şeridi karıştırın. Daha sonra, her tüpe bir ila 350 nanogram RNA içeren üç mikrolitre RNA örneği ekleyin. Numuneyi pipet ucuyla karıştırın ve tüplerin kapağını kapatın.

Numuneleri kısa bir süre döndürün ve beş dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. İnkübasyondan sonra, reaksiyon tüplerini PCR makinesine yükleyin ve aşağıdaki koşullar altında çalıştırın. PCR tamamlandığında, CDNA'yı bir haftaya kadar negatif 20 santigrat derecede saklayın veya 350 nanogramdan az olan numuneler için ön amplifikasyona devam edin.

Veya ilgilenilen transkript düşük bolluktaysa, aşağıdaki preem amplifikasyon adımlarını gerçekleştirin: Buz üzerinde A havuzu ve B havuzu için preamp primerlerini takip ederek başlayın ve karıştırmak için ters çevirin. Ardından, raptiye adam preempt master karışımını döndürün ve buz üzerinde tutun. Ayrıca, amplifikasyon ana karışımını hazırlayın.

Daha sonra, CD NA ürününün 2,5 mikrolitresini mikro amper sekiz tüp şeridine pipetleyin ve ardından 22,5 mikrolitre preamp amplifikasyon reaksiyonu ana karışımını ekleyin. Son olarak, tüpleri buz üzerinde beş dakika inkübe edin. Ardından numuneyi PCR makinesine yükleyin ve aşağıdaki koşullar altında çalıştırın.

Preem amplifikasyon reaksiyonu bittikten sonra, tüpleri kısaca santrifüjleyin ve ardından her tüpe 75 mikrolitre 0.1 x tris, EDTA pH 8.0 ekleyin. Ardından, tüpleri kısa bir süre karıştırın ve döndürün. Tach man mikro RNA dizisini yüklemeye devam edin veya seyreltilmiş ürünü eksi 20 santigrat derecede bir haftaya kadar saklayın.

Numuneleri tac MAN mikro RNA dizisine hazırlamak için, 450 mikrolitre tac man evrensel PCR master'ı birleştirin Dokuz mikrolitre seyreltilmiş preamp amplifikasyon ürününü ve 441 mikrolitre nükleaz içermeyen suyu buz üzerinde RNA içermeyen 1,5 mililitrelik bir tüple karıştırın. Daha sonra tüpü altı kez ters çevirerek karıştırın ve numuneyi santrifüjleyin. 100 mikrolitre PCR reaksiyon karışımını tac man mikro RNA dizi kartının her bir portuna kısaca dağıtın.

Ardından, kartı bir dakika boyunca 1000 kez G'de iki kez santrifüjleyin ve ardından kartı kapatın. Ardından, diziyi termocycler'a yükleyin. Ardından, uygulanan Biyosistem 7, 900 HG hızlı gerçek zamanlı PCR sisteminde mRNA analizini çalıştırmak için 384 kuyulu TAC Man düşük yoğunluklu dizi için Uygulamalı Biyosistemler kılavuzundaki primerlerle sağlanan varsayılan termal döngü koşullarını kullanarak numuneleri çalıştırın.

İlk olarak, 96 oyuklu bir plakayı çalıştırmak için ısı bloklarını değiştirin. Solda gösterilen transmisyon elektron mikroskobu görüntüsü, fare kanından izole edilen eksozomlara aittir. Bu videoda açıklanan yöntemleri kullanarak.

Sağdaki görüntü, hücre kültürü ortamından saflaştırılmış eksozomlara aittir ve daha sonra altın etiketli anti CD 81 eksozomların çapı tipik olarak 30 ila 100 nanometre arasında değişir. Kemirgen kanı, insan kanı ve insan aort endotel hücre kültürü Ortamından izole edilen eksozomlarda bulunan normalleştirilmiş mikroRNA'ların nispi bolluğu burada şu şekilde gösterilmektedir: U altı RNA endojen kontrol pozitif delta CT değerlerine normalize edilmiş delta BT değerleri, mikro RNA'nın daha az bol ve negatif olduğunu gösterir. Delta CT değerleri mikro RNA'nın daha bol olduğunu gösterir.

Her numune tipinde tüm mikroRNA'lar mevcut değildir. Örneğin, kemirgen kan eksozomlarında sadece 1 26 tespit edilmemiştir ve H-A-O-E-C eksozomlarında sadece 200 C yoktur. Kalan dört mikroRNA, her üç örnekte de değişen miktarlarda bulunur.

Bu protokol ekzoomal mikroRNA'ları karakterize etmeye odaklansa da, bireysel Mr.NA transkriptleri, tam kandan elde edilen Mr.NA ile karşılaştırıldığında QPCR kullanılarak eksozomlardan da ölçülebilir. Ekzo Omal, RNA, hem TNF Alfa hem de vasküler endotelyal büyüme Faktörü A'nın benzer ekspresyonunu gösterdi. Bu tekniklerin birleştirilmesi, RNA biyolojisi alanındaki araştırmacıların dolaşımdaki RNA'ların işlevini keşfetmelerinin yolunu açmıştır. Gen ekspresyonu değişikliklerine aracılık etmede ve hem normal hem de hastalık durumlarında eksozomlarla ilişkili moleküler imzaların tanımlanmasında.