Tavuk embriyo Omurilik Dilim Kültür Protokolü

Bu prosedürün genel amacı, özellikle spinal motor nöronların normal nöronal gelişimini sürdürmek için tavuk embriyo dilimlerini kültürlemektir. Bu, önce iç organları çıkarmak için tavuk embriyosunun diseke edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, bir agarro bloğuna gömülü embriyoyu hazırlamak ve dilimlemektir.

Daha sonra, embriyo dilimi agarrodan dikkatlice çıkarılır. Son adım, embriyo diliminin 37 santigrat derecede 24 saat inkübe edilen bir kültür ortamına aktarılmasıdır. Sonuç olarak, embriyo diliminin ince kesitleri üzerinde immünofloresan mikroskobu, kültür periyodunu takiben spinal motor nöronların varlığını ve yerini göstermek için kullanılır.

Dolayısıyla bu yöntem, gelişimsel nörobiyoloji alanındaki temel soruların ele alınmasına yardımcı olabilir. Örneğin, spinal motor nöron göçünde rol oynayan mekanizmalar ve moleküller. Genellikle bu yönteme yeni başlayan kişiler, protokolün diseksiyon aşamalarında çok fazla bakıma ihtiyaç duyulduğundan zorlanacaktır.

Döllenmiş 10 yumurtayı, hamburger ve Hamilton aşama 24'e gelene kadar 38 santigrat derecede zorunlu bir taslak kuluçka makinesine en uzun kenarı yatay olarak yerleştirin. Bu genellikle yaklaşık dört günlük kuluçka gerektirir. Kuluçka döneminin ikinci gününde, %70 etanole batırılmış bir kağıt mendil ile silerek yumurta kabuğunu sterilize edin, beş mililitrelik bir şırıngaya bağlı 21 gauge bir iğne kullanarak yumurta kabuğunun düz ucunu dikkatlice delin ve beş mililitre albümini çıkarın.

Bu, embriyoyu kabuktan uzaklaştırır, böylece kabuk açıldığında embriyo zarar görmez. Yumurtaları kuluçka makinesine geri koyun ve iki gün daha kuluçkaya yatırın. İki gün geçtikten sonra köreltilmiş kullanın.

Daha fazlasını yapın. Beş numara, kabuğun üst ortasını dikkatlice delmek ve yaklaşık dokuz santimetre karelik kabuğu çıkarmak için forseps. Embriyonun etrafını kesin ve embriyoyu dikkatlice kaldırın ve HBSS'ye yerleştirin.

Diseksiyon için. Kullanılan tüm embriyolar evre 24'e yakın olmalıdır. Herhangi bir anormallik belirtisi gösteren herhangi bir embriyo atılmalıdır.

Embriyoyu içeren tabağı diseksiyon mikroskobu altına yerleştirin. Amniyon zarını çıkarmak için iki çift numaralı beş forseps kullanın. Alan'dan zara, Alan Tous ve kafa daha sonra embriyonun ventral orta hattını açmak için mikro diseksiyon makası kullanarak tüm iç organları çıkarmak için embriyonun içini boşaltır.

Daha sonra embriyoyu bir çift forseps ile rostral gövde bölgesi etrafında tutun. Bağırsağın ve kalbin rostral kısmını tutun ve çekin. Üç ayda bir. Embriyo somitlerini net bir şekilde görebilmelisiniz.

Şimdi mikrodiseksiyon makası kullanarak torasik vücut duvarını kesin. Daha sonra, embriyoyu üst ve alt ekstremite tomurcukları arasında enine ikiye bölün. Embriyoyu diseksiyon solüsyonundan çıkarmak için iki forseps kullanarak diseke edilmiş embriyonun lomber yarısını nazikçe çıkarın ve yaklaşık beş santimetrelik tek kullanımlık bir makarna pipeti kullanarak kuru bir Petri kabına yerleştirin.

Alttan kesin, hacim başına yaklaşık iki mililitre erimiş% 4 ağırlık aspire edin. PBS'deki Aros, embriyonun üzerine yaklaşık 0,5 mililitre aros pipetler ve ardından embriyo parçasını pipete emer. Embriyoyu ve arosları, aroslarda kabarcıklar oluşturmadan soyulabilir plastik bir kalıba aktarın.

Embriyoyu, göğüs bölümü aşağı bakacak şekilde plastik kalıptaki arosun dibine yavaşça indirin ve embriyonun düz olduğundan emin olmak için 25 gauge iğne kullanın. Agros ayrıca gelişmekte olan uzuvun bir kısmını da içerecektir ve embriyoların aros içinde dikey olarak konumlandırılması, plastik kalıbın yaklaşık iki dakika boyunca buz üzerine yerleştirilmesine izin vermek için önemlidir. Arosları ayarlamak için, embriyonun bu süre zarfında yönünü değiştirmemesine dikkat edin.

VT 1000 S foma benzerini, hazne HBSS ile doldurulacak ve buzla çevrilecek şekilde ayarlayın. Soğuk su. Aros bloğunu Vibram platformuna sabitlemek için süper yapıştırıcı kullanın ve ardından embriyo parçasını çevreleyen bir ila üç milimetre aros ile bırakmak için bloğu bir tıraş bıçağıyla kesin.

Vibratoyu başlatın ve embriyoyu dilimlemeye başlayın. Berrak bir apikal elektrodermal çıkıntıya sahip uzuv tomurcuk bölümlerini içeren dilimler seçilir ve daha sonra bir HBSS kabına aktarılır. Genel olarak, embriyo başına sadece bir ila iki uygun dilim vardır.

İki iğne kullanarak doku dilimlerinin etrafındaki agarozu nazikçe çıkarın. Bunun eksiksiz ve dikkatli bir şekilde yapılması esastır. 24 kuyulu ultra düşük ataşman doku kültürünün gerekli sayıda oyuğuna 500 mikrolitre kültür çözeltisi ekleyin.

Dilimleri HBSS çözeltisinden dikkatlice kuyucuğa aktarın, her bir oyuğa iki veya üç dilim yerleştirin, ardından 24 oyuklu plakayı, kültür periyodunu takiben 24 saat boyunca% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede doku kültürü inkübatörüne yerleştirin, her bir embriyo dilimi oyuğuna 500 mikrolitre tamponsuz sabitleyin ve 20 dakika buz üzerinde bırakın. Daha sonra toplam çözeltiyi dikkatlice aspire edin ve beş dakikalık aralıklarla PBS'de üç kez yıkayın. Daha sonra kuyucuklara PBS'de% 30 sükroz ekleyin ve dilimler batana kadar plakayı yaklaşık altı saat veya daha uzun süre dört santigrat derecede yerleştirin.

Dilimler battıktan sonra, dilimleri 10 santimetrelik temiz bir Petri kabına taşıyın ve ekstra sükroz çözeltisini alın. Sonra bir mililitre OCT ekleyin ve dilimlerin 20 santigrat derecede beş dakika dengelenmesine izin verin. Her dilimi OCT dolgulu bir OCT içine düz bir şekilde monte edin, montajdan sonra plastik kalıbı soyun.

Katılaşması için kalıpları kuru buz üzerine dikey olarak yerleştirin, OCT bloklarını kriyostatın üzerine monte edin ve blokları eksi 24 santigrat derecede yaklaşık 20 dakika dengeleyin. Daha sonra her dilimi 15 mikronluk bölümlere ayırın ve süper donlar artı slaytlar üzerine monte edin. Slaytlar, protokolün metin bölümünde belirtildiği gibi immünofloresan boyama için gerekli olana kadar eksi 80 santigrat derecede saklanabilir, bu görüntü hamburger ve Hamilton evre 24'te lateral motor kolonunun oluşum durumunu gösterir.

Yanal motor kolonunun yanal bölünmesi, sol panelde LH X bir boyama ile görselleştirilir. Yanal motor kolonu, orta panelde bir Fox P ile boyanarak görselleştirilir ve sağ panel iki kanalın birleşimidir. Orta çizgi noktalı bir çizgi olarak gösterilir ve DV burada dorsal ventral ekseni gösterir.

Yanal motor kolonunun yanal bölünme durumu yine sol panelde LH X bir boyama ve yanal motor kolonu, sağda birleştirilmiş görüntü ile orta panelde Fox P bir boyama ile gösterilir. Bu görüntüler 27. aşamadaki gelişimi göstermektedir. Bu görüntüler, ayrışmış kraniyal motor nöron hücresinin sağkalımını destekleyen bir ortamda kültürlenmiş bir dilimin bölümlerinde solda LH X bir ekspresyon ve orta panelde Fox P bir ekspresyon göstermektedir.

LH X one artık motor nöronlarda eksprese edilmemektedir, ancak Fox P bir ekspresyonu ile kanıtlanan LMC hücrelerinin bir miktar hayatta kalması vardır. DV, omuriliğin dorsa ventral ekseninin oryantasyonunu temsil eder ve ML, omurilik lateral motor kolonunun media lateral ekseninin oryantasyonunu temsil eder. Sol panelde ventral boynuzda bir adet LH X için boyanmış ve genel olarak orta panelde bir adet Fox P için boyanmış LMC için boyanmış lateral bölünme hücreleri, %4 civciv serumu ve mililitre CNTF başına 100 nanogram içeren ortamda kültürlenmiş dilimler halinde görülebilir.

Bazı yanal motor kolon yanal bölünme hücrelerinin, sol paneldeki okla gösterildiği gibi ventral boynuzda yanal bir pozisyonda bulunduğuna dikkat edin. Bu görüntü, daha önce gösterilen embriyonun dilim kültürü sırasında OVO'da tutulan bir embriyonun bölümlerinde LH X one ve Fox P one'ın ekspresyon durumunu göstermektedir. Bu histogram, FOX P'yi bir pozitif ve LHX'i bir pozitif ve LHX'i boyayan yanal motor kolon hücrelerine karşı FOX P'yi bir pozitif ve LHX'i boyayan lateral motor kolon hücrelerinin yüzdesinin niceliklemesinin sonuçlarını gösterir.

Kesit kültürlerde bulunan hücreler için farklı koşullarda yapılan hücreler için negatif veriler, ovo içinde tutulan kontrol embriyoları ile karşılaştırıldığında, %100'ü temsil eden veriler öğrenciler T-testi kullanılarak analiz edilmiştir. Üçlü yıldız işareti, bu protokolü denerken 0,01'den daha düşük bir anlamlılık düzeyini temsil eder. Embriyoyu diseke ederken ve agrosları dilimlerden çıkarırken dikkatli olmak önemlidir, çünkü uzuv tomurcuğundaki motor aksonların bütünlüğünü korumak önemlidir.