Tavuk embriyo Omurilik Dilim Kültür Protokolü

Bu prosedürün genel amacı, özellikle spinal motor nöronların normal nöronal gelişimini sürdürmek için tavuk embriyosu kesitlerini kültüre etmektir. Bu işlem, öncelikle visceral organları çıkarmak için tavuk embriyosunun diseksiyonu yapılarak gerçekleştirilir. İkinci adım ise agar bloğa gömülmüş embriyonun hazırlanması ve dilimlenmesidir.

Ardından, embriyo kesiti agarrodan dikkatlice çıkarılır. Son adım, embriyo kesitinin 37 °C'de 24 saat boyunca inkübe edilen bir kültür ortamına aktarılmasıdır. Nihayetinde, kültür süresinin ardından spinal motor nöronların varlığını ve konumunu göstermek için embriyo kesitinin ince bölümlerine immünofloresan mikroskopi uygulanır.

Böylece bu yöntem, gelişimsel nörobiyoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Örneğin, spinal motor nöron göçünde rol oynayan mekanizmalar ve moleküller gibi. Genel olarak, bu yönteme yeni başlayanlar, protokolün diseksiyon aşamalarında büyük bir dikkat gerektiği için zorluk yaşayabilirler.

Döllenmiş 10 yumurtayı, en uzun kenarları yatay olacak şekilde, hamburger ve Hamilton evre 24'e ulaşana kadar 38 °C sıcaklıktaki zorlanmış hava akışlı bir inkübatöre yerleştirin. Bu işlem genellikle yaklaşık dört günlük inkübasyon gerektirir. İnkübasyonun ikinci gününde, yumurta kabuğunu %70 Ethanol emdirilmiş bir kağıt havlu ile silerek sterilize edin; beş mililitrelik bir şırıngaya takılı 21 gauge iğne kullanarak yumurta kabuğunun düz ucunu dikkatlice delin ve beş mililitre albumin çıkarın.

Bu işlem, kabuk açıldığında embriyonun zarar görmemesi için embriyoyu kabuktan uzaklaştırır. Yumurtaları inkübatöre geri yerleştirin ve iki gün daha inkübe edin. İki gün geçtikten sonra, küt uçlu olanı kullanın.

Devam edin. Beşinci adım, kabuğun üst orta kısmını dikkatlice delmek için forseps kullanın ve yaklaşık dokuz santimetrekarelik bir kabuk parçasını çıkarın. Embriyonun etrafını kesin, embriyoyu dikkatlice kaldırın ve HBSS içerisine yerleştirin.

Diseksiyon için. Kullanılan tüm embriyolar evre 24'e yakın olmalıdır. Herhangi bir anomali belirtisi gösteren embriyolar ayıklanmalıdır.

Embriyonun bulunduğu petri kabını bir diseksiyon mikroskobunun altına yerleştirin. Amniyon zarını çıkarmak için iki adet 5 numaralı pens kullanın. Koryon zarı, allantois ve baş bölgelerini çıkarın; ardından, embriyonun ventral orta hattını mikro diseksiyon makaslarıyla keserek açın ve tüm iç organları çıkarmak için embriyoyu evisere edin.

Ardından, embriyoyu rostral gövde bölgesinden bir pens ile tutun. Bağırsakların rostral kısmını ve kalbi kavrayıp çekin. Çeyrek şeklinde. Embriyonun somitlerini net bir şekilde görebilmeniz gerekir.

Şimdi mikrodissection makası kullanarak göğüs vücut duvarını kırpın. Ardından, embriyoyu üst ve alt ekstremite tomurcukları arasından transvers olarak ikiye bölün. Diseke edilen embriyonun lomber yarısını, embriyoyu diseksiyon solüsyonundan çıkarmak için iki pens ile nazikçe kavrayarak alın ve yaklaşık beş santimetrelik tek kullanımlık bir pasta pipeti kullanarak kuru bir Petri kabına yerleştirin.

Alttan kesin, yaklaşık iki mililitre erimiş %4 ağırlık/hacim Aros'u PBS ile aspire edin. Embriyonun üzerine yaklaşık 0,5 mililitre Aros damlatın ve ardından embriyo parçasını pipete çekin. Embriyoyu ve Aros'u, Aros içine hava kabarcığı girmesine izin vermeden soyulabilir plastik bir kalıba aktarın.

Embriyoyu, torasik kesimi aşağı bakacak şekilde plastik kalıptaki agarosun tabanına nazikçe indirin ve embriyonun düz olduğundan emin olmak için 25 gauge bir iğne kullanın. Agaros, gelişmekte olan uzvun bir kısmını da içerecektir ve bunun sağlanması için embriyoların agarosta dikey olarak konumlandırılması önemlidir; bu nedenle plastik kalıbı yaklaşık iki dakika boyunca buz üzerinde bekletin. Agarosu sabitlemek için bu süre zarfında embriyonun yönünün değişmemesine dikkat edin.

Kamber HBSS ile doldurulacak ve çevresi buzla kaplanacak şekilde VT 1000 S benzeri bir düzenek kurulur. Soğuk su kullanın. Aros bloğunu Vibram platformuna sabitlemek için hızlı yapıştırıcı kullanın ve ardından, embriyo parçasının etrafında bir ila üç milimetre aros kalacak şekilde bloğu bir jiletle kesin.

Vibratomu çalıştırın ve embriyoyu dilimlemeye başlayın. Net bir apikal elektrodermal sırt içeren uzuv tomurcuğu bölümlerini kapsayan dilimler seçilir ve ardından bir HBSS kabına aktarılır. Genellikle, embriyo başına yalnızca bir veya iki uygun dilim bulunur.

Doku dilimlerinin etrafındaki agarozu iki iğne yardımıyla nazikçe temizleyin. Bu işlemin eksiksiz ve dikkatli bir şekilde yapılması esastır. 24 kuyucuklu ultra düşük yapışmalı bir doku kültürü plağının gerekli sayıda kuyucuğuna 500 µL kültür solüsyonu ekleyin.

Kesitleri HBSS solüsyonundan dikkatlice alarak her kuyuya iki veya üç adet gelecek şekilde yerleştirin; ardından 24 kuyucuklu plakayı 37 °C sıcaklıkta ve %5 karbon dioksit içeren doku kültürü inkübatöründe 24 saat boyunca tutun. Kültürleme süresinin ardından, embriyo kesitlerinin bulunduğu her kuyucuğa 500 µL tamponsuz fiksatif ekleyin ve 20 dakika boyunca buz üzerinde bekletin. Daha sonra toplam solüsyonu dikkatlice aspire edin ve beşer dakikalık aralıklarla PBS ile üç kez yıkayın. Ardından kuyucuklara PBS içinde %30 sükroz ekleyin ve plakayı, kesitler dibe çökeneye kadar yaklaşık altı saat veya daha uzun süre 4 °C'de bekletin.

Kesitler çöktükten sonra, kesitleri temiz bir 10 santimetrelik Petri kabına taşıyın ve fazla sakroz çözeltisini tamponla temizleyin. Ardından bir mililitre OCT ekleyin ve kesitlerin 20 degrees Celsius'ta beş dakika boyunca dengelenmesini sağlayın. Her bir kesiti düz bir şekilde OCT ile dolu, soyulabilir plastik kalıba yerleştirin ve yerleştirme işleminden sonra kalıbı çıkarın.

OCT bloklarını kriyostata sabitlemek için kalıpları dikey olarak kuru buz üzerine yerleştirin ve blokları yaklaşık 20 dakika boyunca -24 °C'de dengeleyin. Ardından her bir kesiti 15 mikron kalınlığında dilimleyin ve super frost plus lamlar üzerine monte edin. Lamlar, protokolün metin kısmında belirtilen immünofloresan boyama işlemi için gerekli olana kadar -80 °C'de saklanabilir; bu görüntü, hamburger ve Hamilton evre 24'teki lateral motor kolon oluşumunun durumunu göstermektedir.

Sol panelde lateral motor kolonun lateral bölünmesi Lhx1 boyaması ile görselleştirilmiştir. Orta panelde lateral motor kolon FoxP1 boyaması ile görselleştirilmiş olup sağ panel iki kanalın birleşimidir. Orta hat noktalı çizgi ile gösterilmiştir ve DV burada dorsal ventral ekseni ifade etmektedir.

Lateral motor kolonun lateral bölünme durumu sol panelde LH X one boyamasıyla, orta panelde ise Fox P one boyamasıyla gösterilmiştir; birleştirilmiş görüntü ise sağda yer almaktadır. Bu görüntüler 27. evredeki gelişimi göstermektedir. Bu görüntüler, disosiye kranial motor nöron hücrelerinin sağkalımını destekleyen bir ortamda kültüre edilmiş bir kesitin bölümlerinde, solda LH X one ekspresyonunu ve orta panelde Fox P one ekspresyonunu göstermektedir.

Fox P one ekspresyonu ile kanıtlanan bazı LMC hücrelerinin sağ kalmasına rağmen, LH X one motor nöronlarda artık eksprese edilmemektedir. DV, omuriliğin dorsal ventral ekseninin yönünü, ML ise omurilik lateral motor kolonun medya lateral ekseninin yönünü temsil eder. Sol panelde ventral kornuda LH X one için boyanmış lateral bölme hücreleri ve orta panelde genel olarak Fox P one için boyanmış LMC, %4 civciv serumu ve 100 ng/mL CNTF içeren ortamda kültüre edilen kesitlerde gözlemlenebilir.

Sol paneldeki okla belirtildiği üzere, bazı lateral motor kolon lateral bölme hücrelerinin ventral boynuzda lateral bir konumda bulunduğuna dikkat ediniz. Bu görüntü, daha önce gösterilen embriyo dilim kültürü sırasında OVO ortamında tutulan bir embriyo kesitlerinde LH X one ve Fox P one ekspresyon durumunu göstermektedir. Bu histogram, FOX P one pozitif ve LHX one pozitif boyanan lateral motor kolon lateral bölme hücrelerinin yüzdesinin, FOX P one pozitif ve LHX one boyanan lateral motor kolon hücrelerine karşı kantifikasyon sonuçlarını göstermektedir.

Kontrol grubu olarak in ovo tutulan ve %100'ü temsil eden embriyolarla karşılaştırıldığında, farklı koşullardaki dilim kültürlerinde bulunan hücreler için negatif veriler gösterilmiştir; veriler Student t-testi kullanılarak analiz edilmiştir. Üç yıldız, 0,01'den düşük bir anlamlılık düzeyini temsil eder. Bu protokol uygulanırken, embriyo diseksiyonu sırasında ve dilimlerden agrosları çıkarırken dikkatli olmak önemlidir; çünkü ekstremite tomurcuğundaki motor aksonların bütünlüğünü korumak kritik öneme sahiptir.