Name: Kuş Embriyonik vestibülokoklear sinir İşitsel Elyaf seçici Aydınger (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-18T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 27 s
Description: Öğrenin, erken tavuk embriyolarında mikrodisseksiyon ve floresan boya enjeksiyonu kullanarak işitsel sinir liflerini seçici olarak izleme yöntemini. Bu teknik, sekizinci kraniyal sinirin gelişimini yüksek çözünürlükle görselleştirmeyi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar erken embriyonik dönemde piliç iç kulak anatomisi üzerine uzmanlık için görüntüleme teknikleri ve Dr Doris Wu ile öneri ve yardım için Dr Candace Hsieh teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma NSF IOS-0642346, NIH T32-DC010775, NIH T32-GM008620, NIH R01-DC010796 ve DOE GAANN P200A120165 tarafından desteklenmiştir.

1. Aşağıdaki Diseksiyon araçları ve Reaktifler hazırlayın <ul><li> Yapay serebrospinal akışkan (aCSF, 130 mM NaCl, 3 mM KCI, 1.2 mM KH 2 PO 4, 20 mM NaHCO 3, 3 mM HEPES, 10 mM glikoz, 2 mM CaCl2, 1.3 mM MgSO4) sürekli olarak% 95 O ile aşılanmış Oda sıcaklığında 2 /% 5 CO2. Infüzyon için 2/3 kapağı açılmış bir delik olan bir 500 ml geniş ağızlı Nalgene kavanoza doldurun. Tank kavanoz kapağı delikten aCSF nüfuz bir bardak kök bubbler için tüp tarafından eklenecektir. Sıvının yaklaşık 1/3 ulaşmak ancak jant üzerine sıçramasına neden olacak kadar güçlü değildir kabarcıklar sabit bir akım elde etmek için baskı ayarlayın. Birbirlerinden ve gaz akışı türbülans tek tek örnekleri ayırmak için Nalgene kavanozun içine daldırın 5 ml cam şişe (6&#39;ya kadar). ACSF herhangi bir doku inkübasyondan önce en azından 20 dakika için oksijenli olmalıdır. </li><li> Küçük silikon diseksiyon çanak (35 mm x 10 mmküçük altıgen polistiren içine yerleştirilen iki diseksiyon işaretçilerine (47 mm alt)) Sylgard Elastomere Kit kullanarak mm Petri kaplı tekne tartın. </li><li> İki ince uçlu forseps, bir eğri uçlu forseps, 50 ml beher, ve doku atıklar için bir kap. </li><li> Cam mikropipet (1.2 OD / 0.9 ID) ucunda açılış yaklaşık 20-50 mikron kadar kırılmış ve bir 6.25% çözüm rodamin dekstran amin (RDA, MW = 3.000, Invitrogen) ile dolu Pulled% 0.4 Triton PBS X-100 . Mikromanipülatör picospritzer ve stabilize etmek için ince tüp ile takın. </li></ul> 2. Mikro-disseksiyon E8 4,5 az Baziler Papilla Ortaya Çıkardı <ol><li> Kavisli bir forseps ile tekne tartmak içinde silikon kaplı diseksiyon çanak üzerine doğrudan başkanı yerleştirerek, sadece beyin sapı aşağıya E8 embriyo kesti. </li><li> Ilgi tarafındaki kulağınızı hafifçe görünür şekilde diseksiyon işaretçilerine kullanarak, bir ventral görünümü ile baş konumlandırmak, başını hafifçe dorsal eğik ve 10-30 derece uzaklıkta ce gelen işaretnter (Şekil 2A). Hemen işaretçilerine ile kafa sabitleyin. Iki taraflı izleme istenirse, merkez 0 derece kafası, ya da bir tam alttan görünüşü her iki taraftan erişilebilir. Sol tarafta ulaşılabilir, böylece Benzer bir şekilde, sol taraflı enjeksiyon için, merkezi -10 ila -30 dereceye kadar kafa sabitleyin. </li><li> 50 ml&#39;lik beher kullanarak, tam doku daldırarak, çanak içine oksijenli aCSF, 30 ml aktarın. </li><li> Hafifçe kavrayın ve ince ucu forseps kullanılarak alt çene aşağı soyma, ardından faiz tarafındaki alt gözkapağı çıkarın. </li><li> Kalan damak ve gırtlak gibi, üstteki damar dokusu çıkarın. Bu yumuşak dokular sıyırın yüzeyinin de farklı vertebral arterler ile chondrocranium geliştirme pürüzsüz bir yüzey ifşa edilmelidir. Bu noktada, karakteristik beyaz otoconial kitle görünür olmalıdır. </li><li> Içinde bırakarak dış meatus, çene eklem kıkırdağı ve orta kulak çevresindeki deri dikkatlice teşrihner kulak sağlam. Yavaşça bu kıkırdak yapıları kesip almak için forseps kullanın. </li><li> Ince forseps ipuçları nazik bir süpürme hareketi ile vertebral arterler ve kan göllenmesi çıkarın. Kan görünüm belirsiz olabilir ve koagülasyon enjeksiyon pipeti açılış fişi olabilir. </li><li> Bitişik duyusal epitel (baziler papilla) ve akustik gangliyon ile koklear kanal chondrocranium 6 altında yer alır ve anterior yakın distal-en uç (apeks) ile, ventral iç kulak uzanan uzunlamasına bir parmak şeklinde projeksiyon olarak görüntülenebilmektedir midline 5. Görselleştirme yardımcı olabilir koklear kanal (Şekil 2B) apekste disseksiyon ve / veya otolithic kireçlenmeler (beyaz) küçük bir kan havuzu (kırmızı) olabilir. Apekste lagenar makula, bir duyu yama vestibüler fonksiyonun 7,8 olduğu düşünülmektedir. </li></ol> 3. CN VIII İşitsel Elyaf seçici Etiketleme <ol><li&gt; Koklear kanal ve baziler papilla bölgede embriyonun yüzeyine yakın enjeksiyon pipeti yerleştirin. </li><li> Yavaş yavaş ilk ponksiyon kafatasına mikropipet indirin. Bu kranial bölgenin çevresindeki alanlarda daha ince ve daha az güç nüfuz gerektirir. Mikropipet şimdi koklea kanal içinde olmalıdır. Opsiyonel: izleme boya küçük bir enjeksiyon baziler papilla görüntülenmesine yardım için burada yapılabilir. </li><li> Mikropipet konumlandırarak olmadan, sadece ihlal koklear kanalın derin sınırına (Şekil 1) kadar düşürerek devam edin. Burada bir enjeksiyon yapın ve vestibüler lagena bulunduğu en proksimal bahşiş hariç, baziler papilla (Şekil 2C, 2D) uzunluğu boyunca birden çok bölgede tekrarlayın. 10-30 psi arasında yer alan picospritzer ile, birden çok enjeksiyon yapılır. Enjekte boya sıvı hacmi değişir ve istenilen etiketlenme ölçüde bağlıdır. Her enjeksiyon floresan boya-la yol açmalıdıryaklaşık 200 Beled nokta - 400 mikron çapında (Şekil 2B). </li><li> Enjeksiyon tamamlandıktan sonra, beyin sapı Yukarıdaki örnek transeksiyonu ve sürekli% 95 O 2 /% 5 CO 2 ile perfüze olan aCSF kapsayıcı içinde küçük bir kavanoza kaudal bölümünü yerleştirmek için bir transfer pipet kullanmak için forseps kullanabilir. </li><li> Her bir embriyo için istenen merkezi izleme ve mesafeye bağlı olarak, boya transferi için 20-30 dk bekleyin. </li><li> Dokular temizlenir ve histolojik kesit için hazırlamak. Burada gösterilen örnekte, doku% 4 paraformaldehit (1X PBS içerisinde) bir karışımı, gece boyunca,% 30 sakaroz (1X PBS içinde) batırılır. </li></ol> 4. Counterstaining ve Analiz <ol><li> Counterstaining orient sıra ilgi belirli bölgelerini belirlemek gibi anatomik konuma gözlemci yardım etmek yararlıdır. Bu preparat içinde etkili bir counterstain kuvvetle l nörofilaman immün (Şekiller 1, 3B, 3E), birAbels akson ve MSS aksonal yollarının çizilmesi için izin verir. </li><li> Çıkıntılar rostro eksen boyunca birkaç yüz mikron ya da daha fazla uzatmak gibi analizi, etiketli bölge boyunca yapılmalıdır. Temel analiz bazı örnekler şunlardır: hedef hata oranları, zamanlama ve / veya projeksiyon modellerinin sapma değişiklikleri. RDA-etiketli aksonlar yüksek çözünürlüklü (Şekil 3A, 3B) ile periferik ve santral sinir sisteminde görüntülenmiştir. </li></ol>

<ol><li>Groves, A. K., Fekete, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shaping+sound+in+space%3A+the+regulation+of+inner+ear+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Shaping sound in space: the regulation of inner ear patterning.</a> Development. 139, 245-257 (2012).</li>
<li>Pflieger, J. F., Cabana, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+vestibular+primary+afferents+and+the+vestibulospinal+projections+in+the+developing+and+adult+opossum%2C+Monodelphis+domestica%5BTitle%5D)+AND+%22Anatomy+and+Embryology%22%5BJournal%5D)">The vestibular primary afferents and the vestibulospinal projections in the developing and adult opossum, Monodelphis domestica.</a> Anatomy and Embryology. 194, 75-88 (1996).</li>
<li>Molea, D., Rubel, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Timing+and+topography+of+nucleus+magnocellularis+innervation+by+the+cochlear+ganglion%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Timing and topography of nucleus magnocellularis innervation by the cochlear ganglion.</a> The Journal of Comparative Neurology. 466, 577-591 (2003).</li>
<li>Bissonnette, J. P., Fekete, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standard+atlas+of+the+gross+anatomy+of+the+developing+inner+ear+of+the+chicken%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Standard atlas of the gross anatomy of the developing inner ear of the chicken.</a> The Journal of Comparative Neurology. 368, 620-630 (1996).</li>
<li>Brigande, J. V., Kiernan, A. E., Gao, X., Iten, L. E., Fekete, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+genetics+of+pattern+formation+in+the+inner+ear%3A+do+compartment+boundaries+play+a+role%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Molecular genetics of pattern formation in the inner ear: do compartment boundaries play a role.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 11700-11706 (1073).</li>
<li>Bellairs, R., Osmond, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBellairs%2C+R+%22The+atlas+of+chick+development%22">The atlas of chick development</a>. , 2nd Edn, Elsevier. (2005).</li>
<li>Manley, G. A., Haeseler, C., Brix, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innervation+patterns+and+spontaneous+activity+of+afferent+fibres+to+the+lagenar+macula+and+apical+basilar+papilla+of+the+chick%27s+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Innervation patterns and spontaneous activity of afferent fibres to the lagenar macula and apical basilar papilla of the chick's cochlea.</a> Hearing Research. 56, 211-226 (1991).</li>
<li>Code, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efferent+neurons+to+the+macular+lagena+in+the+embryonic+chick%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Efferent neurons to the macular lagena in the embryonic chick.</a> Hearing Research. 82, 26-30 (1995).</li>
<li>Maklad, A., Fritzsch, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+vestibular+afferent+projections+into+the+hindbrain+and+their+central+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Development of vestibular afferent projections into the hindbrain and their central targets.</a> Brain Research Bulletin. 60, 497-510 (2003).</li>
<li>Rubel, E. W., Fritzsch, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Auditory+system+development%3A+primary+auditory+neurons+and+their+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Auditory system development: primary auditory neurons and their targets.</a> Annual Review of Neuroscience. 25, 51-101 (2002).</li>
<li>Satoh, T., Fekete, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+analysis+of+inner+ear+cells+using+genomic+tags+for+clonal+identification%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Lineage analysis of inner ear cells using genomic tags for clonal identification.</a> Methods Mol. Biol. 493, 47-63 (2009).</li>
<li>Bok, J., Chang, W., Wu, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterning+and+morphogenesis+of+the+vertebrate+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+Journal+of+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Patterning and morphogenesis of the vertebrate inner ear.</a> The International Journal of Developmental Biology. 51, 521-533 (2007).</li>
<li>Appler, J. M., Goodrich, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connecting+the+ear+to+the+brain%3A+Molecular+mechanisms+of+auditory+circuit+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Connecting the ear to the brain: Molecular mechanisms of auditory circuit assembly.</a> Progress in Neurobiology. 93, 488-508 (2011).</li>
<li>Bulankina, A. V., Moser, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+circuit+development+in+the+mammalian+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology+%28Bethesda%29%22%5BJournal%5D)">Neural circuit development in the mammalian cochlea.</a> Physiology (Bethesda). 27, 100-112 (2012).</li>
<li>Fekete, D. M., Campero, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axon+guidance+in+the+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+Journal+of+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Axon guidance in the inner ear.</a> The International Journal of Developmental Biology. 51, 549-556 (2007).</li>
<li>Momose-Sato, Y., Glover, J. C., Sato, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+functional+synaptic+connections+in+the+auditory+system+visualized+with+optical+recording%3A+afferent-evoked+activity+is+present+from+early+stages%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Development of functional synaptic connections in the auditory system visualized with optical recording: afferent-evoked activity is present from early stages.</a> Journal of Neurophysiology. 96, 1949-1962 (2006).</li>
<li>Marrs, G. S., Spirou, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+assembly+of+auditory+circuits%3A+spiral+ganglion+and+brainstem%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Embryonic assembly of auditory circuits: spiral ganglion and brainstem.</a> The Journal of Physiology. 590, 2391-2408 (2012).</li>
<li>Milo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+analysis+of+the+function+of+the+transcription+factor+gata3+during+development+of+the+mammalian+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Genomic analysis of the function of the transcription factor gata3 during development of the mammalian inner ear.</a> PloS One. 4, e7144(2009).</li>
<li>Fritzsch, B., Eberl, D. F., Beisel, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+bHLH+genes+in+ear+development+and+evolution%3A+revisiting+a+10-year-old+hypothesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences+%3A+CMLS%22%5BJournal%5D)">The role of bHLH genes in ear development and evolution: revisiting a 10-year-old hypothesis.</a> Cellular and Molecular Life Sciences : CMLS. 67, 3089-3099 (2010).</li>
<li>Jahan, I., Kersigo, J., Pan, N., Fritzsch, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurod1+regulates+survival+and+formation+of+connections+in+mouse+ear+and+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Neurod1 regulates survival and formation of connections in mouse ear and brain.</a> Cell and Tissue Research. 341, 95-110 (2010).</li>
<li>Huang, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brn3a+is+a+transcriptional+regulator+of+soma+size%2C+target+field+innervation+and+axon+pathfinding+of+inner+ear+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Brn3a is a transcriptional regulator of soma size, target field innervation and axon pathfinding of inner ear sensory neurons.</a> Development. 128, 2421-2432 (2001).</li>
<li>Jones, J. M., Warchol, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+Gata3+transcription+factor+in+the+acoustic+ganglion+of+the+developing+avian+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Expression of the Gata3 transcription factor in the acoustic ganglion of the developing avian inner ear.</a> The Journal of Comparative Neurology. 516, 507-518 (2009).</li>
<li>Lu, C. C., Appler, J. M., Houseman, E. A., Goodrich, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+profiling+of+spiral+ganglion+neurons+reveals+insights+into+auditory+circuit+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%3A+The+Official+Journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Developmental profiling of spiral ganglion neurons reveals insights into auditory circuit assembly.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 31, 10903-10918 (2011).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan edilir.

VIII.yy. sinirin erken geliştirme çalışmaları nedeniyle birden çok farklı gangliyon kaynaklanan embriyonik aksonlar tanımada zorluk kısmen sınırlı kalmıştır. Çeşitli çalışmalar erken gelişimi sırasında işitsel ve vestibüler duyu hücre ve ganglion hücre kaderi rehberlik moleküler sinyaller, 5,11,12 araştırdı fakat merkezi innervasyon düzenleyen süreçler belirlenecek henüz. Az ilköğretim çekirdekler için projelendirme merkezi süreçleri hakkında bilinenler ise akustik gangliyon hücre projeksiyonlar Raporlar gene...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif / Malzeme Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog Numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> Polistiren Bulaşık tartılır </td><td> Fisher Scientific </td><td> 02-202-101 </td><td></td></tr><tr><td> Petri Dish, 35 X 10 mm </td><td> Fisher Scientific </td><td> 50820644 </td><td> Silikon diseksiyon çanak yapmak için kullanın </td></tr><tr><td> Sylgard Silikon Elastomer Takımı </td><td> Dünya Hassas Aletler </td><td> SYLG184 </td><td> Coat Petri diseksiyon çanak yapmak </td></tr><tr><td> Diseksiyon Pins </td><td> Çeşitli </td><td></td><td> Diseksiyon sırasında embriyo tutar </td></tr><tr><td> NaCL </td><td> Çeşitli </td><td></td><td> aCSF tarifi parçası </td></tr><tr><td> KCl </td><td> Çeşitli </td><td></td><td> aCSF tarifi parçası </td&gt; </tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> Çeşitli </td><td></td><td> aCSF tarifi parçası </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> Çeşitli </td><td></td><td> aCSF tarifi parçası </td></tr><tr><td> Glikoz </td><td> Çeşitli </td><td></td><td> aCSF tarifi parçası </td></tr><tr><td> CaCl2 </td><td> Çeşitli </td><td></td><td> aCSF tarifi parçası </td></tr><tr><td> MgSO4 </td><td> Çeşitli </td><td></td><td> aCSF tarifi parçası </td></tr><tr><td> ACSF için Konteyner. Kapaklı saydam geniş ağız Nalgene kavanoz, 500 ml (16 oz) sonuçları. </td><td> CPLabSafety </td><td> QP-PLC-03717 </td><td> Cam bubling kök için kapağın üst Delik açma sıvı nüfuz </td></tr><tr><td> Boş 5 ml bir cam şişe ya da karşılaştırılabilir saydam şişe </td><td> Amerikan İlaç Ortaklar, Inc </td><td> 6332300105 </td><td&gt; birbirlerinden ve köpüren akışından örnekleri ayrı tutmak aCSF inkübasyon sırasında kullanın </td></tr><tr><td> Carbogen Tank (% 95 O 2 /% 5 CO 2) bubbler için boru ile bağlı </td><td> Çeşitli </td><td></td><td> ACSF içine infüzyon için cam kök bubbler için tüp tarafından takın </td></tr><tr><td> Cam kök bubbler </td><td> Çeşitli </td><td></td><td> ACSF içine carbogen demlenmeye için </td></tr><tr><td> Eğri uçlu forseps </td><td> Dünya Hassas Aletler </td><td> 501008 </td><td> Yumurtadan embriyo baş kaldırmak için </td></tr><tr><td> İki ince uçlu forseps </td><td> Dünya Hassas Aletler </td><td> 501985 </td><td> Mikro diseksiyon için </td></tr><tr><td> 50 ml Beher </td><td> çeşitli </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Rodamin Dekstran Amin (BKİ) </td><td> Invitrogen </td><td> çeşitli </td><td> Floresan akson tracer </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> ICN Biomedicals </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Fosfat (1X PBS), Tamponlu Salin </td><td> Çeşitli </td><td></td><td> Standart laboratuar reaktifi </td></tr><tr><td> İnce Duvarlı Cam kılcal, 1.2 OD, .9 ID 4 &quot;(100 mm) uzunluğu </td><td> Dünya Hassas Aletler </td><td> TW120F-4 </td><td> BKİ ile yükleyin. Her kılcal iki cam mikropipetler yapar </td></tr><tr><td> İğne / Pipet çektirme </td><td> David Kopf Instruments </td><td> Model 720 </td><td> Kullanılan Ayarlar: Isı 16.4, Solenoid 2.2 </td></tr><tr><td> Picospritzer </td><td> Parker Enstrümantasyon </td><td> çeşitli </td><td> Cam mikropipet ince boru ile bağlayın </td></tr><tr><td> Mikromanipülatör </td><td> Narishige </td><td> çeşitli </td><td></td></tr><tr><td> Floresan ile Diseksiyon mikroskobu </td><td> Çeşitli </td><td></td><td></td&gt; </tr><tr><td> 4% Paraformaldehyde </td><td> Çeşitli </td><td></td><td> Standart laboratuar reaktifi </td></tr><tr><td> Anti-Nörofilaman antikor, isteğe bağlı </td><td> Millipore </td><td> AB1991 </td><td> Üretici tarafından önerilen histolojik protokol izleyin </td></tr><tr><td> Kriyostat ve kesit için ilgili maddeler </td><td> Leica </td><td> çeşitli </td><td></td></tr><tr><td> Görüntüleme için Epifluorescent mikroskop </td><td> Çeşitli Zeiss, </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

kuş embriyonik vestibülokoklear sinir İşitsel elyaf seçici aydınger

Selective Tracing of Auditory Fibers in the Avian Embryonic Vestibulocochlear Nerve

Embriyonik civciv periferik ve santral gangliyon hücre projeksiyonlar çalışma için yaygın olarak kullanılan bir modeldir. Işitsel sisteminde, sekizinci kranial sinir olan işitsel akson seçici etiketleme merkezi işitme devre geliştirme çalışması artıracaktır. Iç kulakta birden duyu organları VIII.yy. sinirin 1. katkıda çünkü bu yaklaşım zordur. Ayrıca, güvenilir bir kuş VIII.yy. sinir içinde akson vestibüler gruplar karşısında işitsel ayırt işaretleyicileri tespit edilmesi henüz. Devreler oluşur önce duyu-uyarılmış yanıtlar mevcut değil gibi işitsel ve vestibüler yolları, erken embriyo işlevsel olarak ayırt edilemez. Merkezi projelendirme VIII.yy. sinir aksonlar bazı çalışmalar takip edilmiştir, ama işitsel akson etiketleme diğer VIII.yy. sinir bileşenler 2,3 dan etiketleme eşlik etti. Burada, seçici labe için akustik gangliyondan anterograd izleme için bir yöntem açıklanmaktadırGelişmekte VIII.yy. sinir içinde l işitsel aksonlar. İlk olarak, oksijenli yapay beyin omurilik sıvısına batırılmış bir 8 günlük civciv embriyo ön sefalik bölgede kısmi diseksiyon sonrası, koklear kanal anatomik işaretlemeler ile tanımlanır. Daha sonra, bir ince çekilmiş cam mikropipet akustik ganglion hücreleri bulunan kanal ve komşu bölge içine derin rodamin dekstran amin küçük bir miktar enjekte etmek için konumlandırılmıştır. Enjeksiyonu takiben otuz dakika içinde, işitsel aksonlar arka beyin içine merkezi izlenir ve daha sonra histolojik hazırlanmasını takiben canlandırılabilir. Bu yöntem, merkezi işitsel devre oluşumu periferik gelişimsel çalışmalar için kullanışlı bir araç sağlar.

VIII.yy. sinir ve sinir kendisi anatomisi bileşenleri (Şekil 1, 3), karmaşık ve karışık vardır. Seçici olarak akustik ganglion hücre kaynaklanan lifler izleme tarafından VIII sinir hem de beyin sapı içindeki birincil işitsel afferent kesimleri temiz bir şekilde takip edilebilir ve bunların muadilleri vestibüler (Şekil 2, 3) ayırt edilir. Aynı şekilde, bu tekniğin akustik ganglion hücrelerinin periferik projeksiyonları (Şekil 3G) incelemek için kullanılır, ya da bireysel...

Burada sinir ve arka beyin işitsel akson liflerinin izleme seçici için erken civciv embriyo akustik ganglion içine floresan boya enjeksiyonu takiben mikrodiseksiyon tekniği tarif.

Kuş Embriyonik vestibülokoklear sinir İşitsel Elyaf seçici Aydınger

The embryonic chick is a widely used model for the study of peripheral and central ganglion cell projections. In the auditory system, selective labeling ...

Bu prosedürün amacı, bir embriyoda işitme liflerini periferik sinir sisteminden merkezi sinir sistemine seçici olarak izlemektir. Bu işlem, öncelikle ventral kondrokranyumu açığa çıkarmak ve kuş koklear kanalını tanımlamak için bir mikrodoz kesisi yapılarak gerçekleştirilir. İkinci adım, altta bulunan akustik ganglion hücrelerine ve bunların aksonlarına bir mikroenjeksiyon yapmaktır.Ardından, DIA transferine olanak sağlamak için örnek, 20 dakika boyunca oksijenlendirilmiş yapay BOS içinde inkübe edilir. Son olarak, dokunun histolojik preparasyonu ve kesilmesi, akustik ganglion merkezi projeksiyonlarının mikroskobik olarak görüntülenmesini sağlar. Bu tekniğin mevcut yöntemlere göre temel avantajı, sekizinci sinirin seçici olarak izlenmesine olanak tanımasıdır.Yüksek çözünürlüklü işitsel fiberler, canlı dokuda hızlı boya transferine olanak tanır ve erken gelişim aşamalarında deney yapılmasına imkan verir. Bu yöntem, işitme araştırmaları alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Örneğin, aksonları merkezi hedeflerine yönlendiren moleküller nelerdir?Ya da devreler yaralanmaya veya ototoksik maruziyete nasıl yanıt verir? İlk olarak, 500 mililitrelik geniş ağızlı Nalgene kavanozun üçte ikisi dolana kadar içine yapay beyin omurilik sıvısı ekleyin. Üzerinde delik bulunan kapağı kavanoza geri kapatın.%95 oksijen ve %5 karbondioksit tankına bağlı bir gövde kabarcıklayıcıyı kapaktaki delikten geçirerek A CSF içerisine yerleştirin. Gazı açın ve sıvının yaklaşık üçte birine ulaşan ancak kenarlardan sıçramaya neden olmayacak düzeyde sabit bir kabarcık akışı elde etmek için basıncı ayarlayın. Münferit örnekleri birbirinden ayırmak için kavanoza altı adede kadar beş mililitrelik cam şişe daldırın.Ve gaz akışı türbülansından. A CSF'nin en az 20 dakika boyunca oksijenle doyurulmasına izin verin; A CSF oksijenlenirken cam mikro pipetleri çekin ve mikro pipeti PBS içinde %0,4 Triton XX içeren %6,25 rodine Dexter ve am immune solüsyonu ile doldurun. Mikro pipeti mikro manipülatöre takın ve 20 ila 50 mikronluk bir açıklık oluşturmak için ucu ince bir pensle kırın. Stabilize edilmiş mikro manipülatörü piko püskürtücüye bağlamak için ince tüpler kullanın.Kurulumun geri kalanını tamamlamak için pico spritzer'ı 10 ile 30 PSI arasına ayarlayın. İki diseksiyon iğnesinin küçük altıgen şeklinde yerleştirildiği küçük bir silikon diseksiyon kabının olduğundan emin olun. İki adet ince uçlu pens kullanın.Diseksiyon alanında tek kavisli uçlu pens, 50 mililitrelik bir beher ve doku atıkları için bir kap bulundurun. Tavuk embriyosunu yumurtadan çıkardıktan sonra, başı silikon kaplı disseksiyon tabağına yerleştirin. Whey boat içerisinde, bu vakada ilgi duyulan taraf olan sağ taraftaki kulağı görecek şekilde başı ventral görünümlü olarak konumlandırın.Doğru konuma getirildikten sonra, arka beyin bölgesine dikkat ederek dokuyu disseksiyon iğneleriyle sabitleyin. 50 mililitrelik beheri kullanarak, dokuyu tamamen daldıracak şekilde 30 mililitre oksijenle zenginleştirilmiş A CSF'yi kaba aktarın. Ardından, ince uçlu pensetle alt çeneyi nazikçe kavrayıp aşağı doğru soyun.Ardından, ilgilenilen taraftaki alt göz kapağını kaldırın. Sonrasında, kalan damak ve yutak dahil olmak üzere üzerindeki vasküler ve yumuşak dokuları temizleyin. Bu dokular kaldırıldığında, ventral kraniumun düz yüzeyi ve belirgin vertebral arterler ortaya çıkmalıdır.Dış kulak yolunu, çene eklemi kıkırdağını ve orta kulağı çevreleyen deriyi, iç kulağı sağlam bırakacak şekilde dikkatlice diseke edin. Çene ve orta kulağın kıkırdak yapılarını nazikçe kesip çıkarmak için pens kullanın. Ardından, vertebral arterleri ve biriken kanı temizlemek için ince pens uçlarıyla hafif süpürme hareketleri yapın.Kan görüşü engelleyebileceği ve pıhtılaşma enjeksiyon pipeti ağzını tıkayabileceği için bu nokta önemlidir. Bu aşamada, karakteristik beyaz tial kütle görünür olmalıdır. Bu figürdeki ok, bitişiğindeki duyusal epitel ve akustik ganglion ile birlikte koklear duktu göstermektedir.Chondra cranium'un hemen altında yer alır ve burada görüldüğü gibi, işitme liflerini işaretlemek için iç kulaktan ventral olarak uzanan, apeksi anterior orta hatta yakın, uzatılmış parmak benzeri bir çıkıntı olarak görselleştirilebilir. İlk olarak, enjeksiyon pipetini koklear kanal ve baula papular bölgesindeki embriyo yüzeyine yerleştirin ve kraniyumu delmek için mikro pipeti yavaşça indirin. Kranyumun bu bölgesi çevre alanlara göre daha incedir ve penetrasyon için daha az kuvvet gerektirir.Mikropipet şu an koklear kanalın içinde olmalıdır. Gerekirse, mikropipeti yeniden konumlandırmadan bazilar per pillar yapısının görselleştirilmesine yardımcı olmak için buraya küçük bir miktar izleme boyası enjekte edilebilir; koklear kanalın derin sınırını hemen geçene kadar indirmeye devam edin.Bu görüntü, pipetin akustik ganglionun uygun bölgesindeki ideal konumunu göstermektedir. Bu noktada bir enjeksiyon gerçekleştirin ve ardından basala papillanın uzunluğu boyunca birden fazla bölgede tekrarlayın. İstenen etiketlemenin kapsamına bağlı olarak ve vestibular legina'nın bulunduğu en proksimal uç hariç tutularak işlem yapın.Piko spritzer 10 ila 30 PSI arasına ayarlanmışken, burada görüldüğü üzere her enjeksiyon yaklaşık 200 ila 400 mikron çapında floresan DIA işaretli bir nokta ile sonuçlanmalıdır. Enjeksiyon tamamlandığında, burada gösterildiği gibi pens kullanarak örneği beyinsapının üzerinden kesin ve transfer pipeti yardımıyla kordal kısmı, perfüze edilmiş CSF içeren kaptaki küçük kavanozlardan birine yerleştirin.Her bir embriyo için, istenen merkezi izleme mesafesine bağlı olarak boya transferine 20 ila 30 dakika süre tanıyın. İnkübasyon süresi dolduğunda, dokuyu çıkarın ve histolojik kesit alma işlemi için hazırlayın. Bu aşamada doku, bir gece boyunca 1xPBS içinde %4 paraldehit çözeltisine daldırılır ve ardından bir gece boyunca 1xPBS içinde %30 sakkaroz ilele dehizdrasyon işlemine tabi tutulur.Doku %30 sükroz içinde gece boyunca dengelendikten sonra, koronal düzlemde kriyoseksiyonları alınır. Kesim işleminin ardından, uygun antikorlarla yapılan immün işaretleme, gözlemcinin anatomik konumu belirlemesini ve ilgilenilen özel bölgeleri tanımlamasını sağlar. Bu görüntü, bilateral akustik ganglionları sağlam olan E altı beyin sapının koronal görünümünü göstermektedir.Şematize edilmiş kırmızı pipet, dorsal lateral bir giriş noktasından akustik ganglion hücrelerinin doğru şekilde hedeflenmesini göstermektedir. Aksonal projeksiyonları belirginleştirmek için kesitler anti-nörofilament ile immün boyanmıştır. Vestibüler organlar, gösterilen kesitin rostral kısmında yer almaktadır.Vestibüler koklear sinir ile akustik ganglion ve vestibüler ganglion etiketlenmiştir. Dorsal taraf yukarıdadır, ölçek çubuğu 300 mikrona eşittir. Aşağıda, 25 mikronluk bir E8 embriyosundaki seçici işitsel fiber izlemesinin temsili düşük ve yüksek büyütmeli görüntüleri yer almaktadır.Aynı embriyodan alınan koronal kesitler, burada görüldüğü gibi farklı düzlemleri temsil etmektedir. RDA ile işaretlenmiş aksonlar, ok ucuyla belirtilen enjeksiyon bölgesinden başlayarak, ok ile gösterilen kranial sinir üzerinden ve çift ok ucuyla belirtilen primer işitsel çekirdek hedeflerine doğru takip edilebilmektedir; ölçek çubuğu 300 mikrona eşittir. Anti-nörofilament antikoru ile yapılan immün işaretleme tüm aksonal projeksiyonları belirginleştirmekte olup, önceki görüntüde RDA ile takip edilen liflerin işitsel projeksiyon yolu içerisinde olduğu görülmektedir.AP ve VP, sırasıyla sinir giriş noktasının periferindeki işitsel ve vestibüler bileşenleri göstermektedir. Birleştirilmiş renkli görüntü, RDA ile işaretlenmiş aksonların yerel anatomiye nasıl oturduğunu göstermektedir. Aynı embriyonun daha kordal bir konumdaki yüksek büyütmeli görüntüsü, bir okla belirtilen sinir giriş noktasındaki ve çift ok başıyla belirtilen merkezi yol boyunca liflerin yüksek çözünürlüğünü ortaya koymaktadır.Tüm aksonların nörofilament boyaması, P-N-S-C-N-S'nin yanı sıra muhtemel işitsel ve vestibüler projeksiyonların belirlenmesine olanak tanır. Yine, AP ve VP, sinir giriş noktasının periferindeki ilgili işitsel ve vestibüler bileşenleri; AC ve VC ise sinir giriş noktasının merkezindeki ilgili işitsel ve vestibüler projeksiyonları belirtmektedir. Yine, ayrı kanalların üst üste bindirilmesi renkli bir birleştirme şeklinde gösterilmiştir.Akustik ganglionun histolojik incelemesi, önceki izlemeden gelen işaretli akustik ganglion hücrelerinin konumunu ve yıldızla belirtilen periferik projeksiyonlarını ortaya koymaktadır, A yolu basilar papillaya kadar geriye doğru izlenmiştir. Burada AG akustik ganglionu, bp basilar papillayı ve lm Laina macular'ı ifade eder. Ölçek çubuğu 100 mikrona eşittir.Son olarak, bu görsel E8 aşamasındaki işitsel spesifik sekizinci sinir etiketlemesiyle beklenen 700 mikronluk izleme yolunu göstermektedir. Kırmızı daire ile belirtilen enjeksiyon bölgesi sinir giriş noktasının kordal kısmındadır ve merkezi projeksiyonlar rostral ve quarterly yönde ilerler. Arka beyne ulaşıldığında, buradaki ölçek çubuğu 300 mikrona eşittir.Bu prosedürü uygularken, enjeksiyonlarınızı analiz kriterlerinize en uygun şekilde uyarlayın. Ayrıca, örnekler arasında izlenen aksonların kesin sayısı ve konumu açısından bazı değişkenlikler olacağını unutmayın.

selective-tracing-auditory-fibers-avian-embryonic-vestibulocochlear

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bu video, laboratuvar ortamında kama şeklinde beyin dilimleri hazırlama sürecini göstermektedir. Bir vibratom kullanılarak, bir farenin beyninden kama şeklinde bir dilim, değişen kalınlıklarda hazırlanır. Bu dilim daha kalın uçta yer alan işitme sinir kökünü içerirken, daha ince uçta işitme ile ilgili nöronlar yer alır.

İşitsel Nöronları Görselleştirmek için Kama Beyin Dilimlerinin Hazırlanması

Vestibüler saç hücre fonksiyonu analizi kafatası, petröz temporal kemiğin en zor kısmı içinde derin konumlarına göre karmaşıktır. En işlevsel saç hücre çalışmaları akut izole saç hücrelerinin kullandık. Burada elektrofizyolojik ve iki-fotonlu mikroskop çalışmaları için fare vestibüler epitelyum bir yarı sağlam hazırlanması açıklanmaktadır.

Elektrofizyoloji ve yüksek çözünürlüklü İki foton Mikroskopi için Fare Vestibüler Duyu epiteli bir İzole Yarı sağlam Hazırlık

Embriyonik fare iç kulağından koklear eksplantların izolasyonunu ve kültürünü tanımlayan bir yöntem sunuyoruz.  Ayrıca, kare dalga elektroporasyon yoluyla koklear eksplantlara gen transferi için bir yöntem gösteriyoruz. Gen transfer tekniği ile birleştirilmiş in vitro eksplant kültürü, araştırmacıların gelişim sırasında gen ekspresyonunu değiştirmenin etkilerini incelemelerini sağlar.

Elektroporasyon tarafından Embriyonik Fare Koklear Eksplantlarından Kültür ve Gen Transferi

İşitme organı işitmeye aracılık eder. Burada, gelişmekte olan tavuk işitme organında işitsel progenitör hücre proliferasyonu ve farklılaşmasını incelemek için optimize edilmiş modifiye edilmiş bir in ovo mikro-elektroporasyon yöntemi sunuyoruz.

Tavuk İşitsel Organ gen Transferi tarafından<em&gt; Ovo olarak</em&gt; Mikro-elektroporasyon

Kuş ve memelilerin işitsel beyin sapı nöronları, normal işitme işlevleri için temel bir süreç olan hızlı sinirsel kodlama için uzmanlaşmıştır. Bu nöronlar, embriyonik arka bedenin belirgin öncüllerinden kaynaklanmaktadır. İşitme gelişiminde gen işlevini incelemek için tavuk embriyolarının arka bacasında genleri ifade etmek için elektroporasyon teknikleri sunuyoruz.

Tavuk İşitsel Beyinsapındaki Ovo Elektroporasyonunda

Bu iletişim kuralı İşitsel Beyin Sapı Davranım Odyometrisi postnatal fare pups üzerinden kaydetmek için yöntemler açıklanır. Dış saç hücreleri fonksiyonel gelişimi incelemek için tüm hücreli yama kelepçe dış saç hücreleri izole kayıt deneysel işlemin adım adım açıklanmıştır.

İşitsel Beyin Sapı Davranım Odyometrisi ve dış saç hücre bütün hücreli yama kelepçe kayıt Doğum sonrası sıçanlarda

Burada, bir beyin sapı dilimi içinde tonotopik özelliklerin ve gelişimsel yörüngelerin araştırılması için tavuk embriyosunun koronal olmayan işitsel beyin sapı dilimlerinin elde edilmesine yönelik bir protokol sunuyoruz. Bu dilimler, geleneksel koronal kesitlerin tek bir dilim düzlemi içindeki daha büyük tonotopik bölgeleri kapsayan sagital, yatay ve yatay / enine bölümleri içerir.

Tonotopik gradyanları ve mikrodevreleri değerlendirmek için embriyonik tavuk işitsel beyin sapının dilimlenmesi

Standart işitsel beyin sapı yanıtı (ABR) tekniklerini kullandık ve bunları işitsel işlev için erken bir kuş modeli olan yavru tavuklara uyguladık. Protokol, hayvan hazırlama ve ABR edinme tekniklerini, diğer kuş veya kemirgen modellerine çevrilebilecek adımlarla ayrıntılı olarak özetlemektedir.

Tavuk Yavrularında İşitsel Beyin Sapı Yanıtının Değerlendirilmesi

Civciv, çeşitli çalışmalar için uygun maliyetli, erişilebilir ve yaygın olarak bulunan bir model organizmadır. Burada, kuş iç kulağı gelişimi ve yenilenmesinin altında yatan moleküler mekanizmaları anlamak için bir dizi protokol detaylandırılmıştır.

Ovo ve Ex Ovo'da Kuş İç Kulak Gelişimini İnceleme Yöntemleri

Ovo elektroporasyonunu kullanarak, devre montajının ayrı dönemlerinde kırılgan X mental retardasyon proteininin hücre grubuna özgü bir nakavtını sağlamak için tavuk embriyolarındaki işitsel iç kulağı ve koklear çekirdeği seçici olarak transfekte etmek için bir yöntem geliştirdik.

In Ovo Electroporation tarafından İşitsel Bir Devrede Kırılgan X Mental Retardasyon Proteininin Hücre Otonom Fonksiyonunun Diseksiyonu

Stria vascularis, endokoklear potansiyelin oluşumu için hayati öneme sahiptir. Burada, yetişkin fare stria vascularis'in tek çekirdekli dizileme veya immün boyama için diseksiyonu sunulmuştur.

Tek çekirdekli dizileme veya immün boyama için yetişkin fare stria vascularis'in diseksiyonu

Öğrenin, erken tavuk embriyolarında mikrodisseksiyon ve floresan boya enjeksiyonu kullanarak işitsel sinir liflerini seçici olarak izleme yöntemini. Bu teknik, sekizinci kraniyal sinirin gelişimini yüksek çözünürlükle görselleştirmeyi sağlar.

Kuş Embriyonik vestibülokoklear sinir İşitsel Elyaf seçici Aydınger

Daha fazla video keşfet