Name: Tek Hücrelerde Zebra balığı Segmentasyon Clock Görüntüleme Dağınık Presomitic Mesoderm Hücre Kültürleri Üretimi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 41 s
Description: Öğrenin, transgenik Danio rerio embriyolarından presomitik mezoderm dokusunu disseke ederek tek hücreli segmentasyon saati salınımlarını uzun süreli görüntüleme yöntemini. Bu teknik, gelişimsel biyolojide gen ifadesi dinamiklerini gerçek zamanlı izlemeyi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışma, bir EMBO Uzun süreli araştırma bursu (ABW) tarafından desteklenen, Ulusal Bilim Vakfı Uluslararası Doktora Sonrası Araştırma Bursu (ABW), Max Planck Gesellschaft (ABW, DS, JS, ACO), bir kazılar-BB bursu (AO), ve (ACO DS) Avrupa Toplulukları Yedinci Çerçeve Programı STG-207634 altında Avrupa Araştırma Konseyi. Biz yazının yararlı yorumlar için Ravi Desai teşekkür ederim. Biz de Zebra balığı Fibronectin1 fragmanı, bakım ve bizim balık hatları ve görüntüleme desteği için MPI-CBG ışık mikroskobu tesisin bakımı için MPI-CBG balık tesisi personelinin üretimi için MPI-CBG protein ekspresyon tesis teşekkür etmek istiyorum.

1.. Diseksiyon önce <ol><li> Diseksiyon bir gün önce, transgenik allel için heterozigos zebra balığı çiftleri incross embriyolar elde edilir. <ol><li> 28 o C de metilen mavisi olmadan E3 ortamda embriyolar kaldırın kalkan aşamasında (6 saat sonrası fertilizasyon) kadar. </li><li> 20 o CO / N. metilen mavisi olmadan E3 ortamda embriyolar transfer Onlar tailbud aşamaya ulaştığında, 20 o C, embriyolar saat başına 1 hücre gruplarının oluşturacaktır. O 20 ° C&#39;de 17-20 saat O / N sonra, embriyolar diseksiyon protokol başında ertesi sabah sahne 5-8 hücre gruplarının olmalıdır. </li></ol></li><li> Araçları ve diseksiyon için gerekli reaktifleri birleştirin. <ol><li> Embriyo ve doku transferi için yangın parlatılmış cam pipet </li><li> Embriyolardan chorions çıkarılması için ince forseps çifti </li><li> Diseksiyon için Sylgard kaplı 35 mm çanak - 35 mm çanak içine Slygard polimer dökün ve 37 ° C O / N tedavi Iyi kullanarak diseksiyon yapmaktedavi polimerin küçük bir hacmini çıkarmak için bir iğne ucu. Çanak temizlenmiş ve daha sonra tekrar edilebilir. </li><li> PSM doku manipülasyon için bilenmiş, basık tungsten tel araçları </li><li> Kültüre PSM istenilen parçalar kesmek için mikro-neşter </li><li> Tripsin inkübasyon için 35 mm plastik tabak </li><li> % 10 fetal inek serumu ihtiva eden ortam L15 </li><li> % 0.25 tripsin / EDTA solüsyonu </li><li> Dağıtmaya sigmacoted jel yükleme ipuçları </li><li> Metilen mavisi olmadan E3 ortamı içeren plastik petri. </li></ol></li><li> Fibronectin1 alt-tabaka (PBS içerisinde 10 ug / ml) ile cam-alt görüntüleme çanak örtün. Diseksiyon sırasında kat bankta çanak bırakın. </li><li> Tanımlamak için uygun floresan filtre ve sıralama pozitif transgenik embriyolar (5-8 somite evre) ile Stereoskop kullanın. <ol><li> Floresan kanal altında YFP ekspresyon için presomitic mezoderm (PSM) (Şekil 1A) incelenerek transgenik embriyolar belirlenmesi. Floresan shoULD tailbud son oluşturulan hücre gruplarının arasındaki bölgede görünür. Parlak sinyal embriyo seçin; Yavruların% 25 Transgenin 2 kopyalarını taşıyan homozigot embriyolar olmalıdır. Gerekli tespit embriyo sayısı deney göre değişir. Bir disseke tailbud parça ortalama 1.000 hücreleri verecektir. Tipik olarak, birkaç ek olumlu embriyolar durumda hatalar diseksiyonu sırasında yapılan yararlıdır. </li><li> Sinyal, özellikle yumurta sarısı hücrede, bir otoflüoresanı ayırt etmek için bir konum referansı olarak iletilen ışık kullanın. </li><li> Metilen mavisi olmadan E3 ortamı içeren ayrı bir plastik petri olumlu embriyolar transfer. </li></ol></li></ol> 2.. PSM Diseksiyon ve Dağılma <ol><li> Diseksiyon için embriyolar hazırlayın. <ol><li> Diseksiyon mikroskobu altında, ince forseps kullanarak, dikkatli bir şekilde E3 ortamda her embriyo koryon çıkarın. Embriyo zarar veya sarısı hücreyi bozmak için değil emin olun. </li&gt; <li> Dolgu serum ile L15 orta ile diseksiyon çanak Sylgard kaplı. Forseps ya da başka düz aracını kullanarak, Sylgard yüzeyinden hava kabarcıkları. </li><li> Diseksiyon çanak yangın parlatılmış cam pipet kullanarak dechorionated embriyolar transfer. </li><li> Tel araçlarını kullanma, diseksiyon çanak bir tarafında tüm embriyoları taşımak. </li></ol></li><li> Tek embriyo PSM ayır. <ol><li> Orient de kesme çanak (Şekil 1 B) içindeki Sylgard katmanda yapılan küçük yan yüzeyi üzerinde tek bir embriyo. </li><li> Embriyo ve yumurta sarısı hücresi boyunca mikro-neşter, dilim kullanarak sadece arka beyin ve (kırmızı çizgi noktalı Şekil 1B) embriyonun ventral kutbu üzerinden anterior. </li><li> Yemeğin tarafına onu hareket, kuyudan embriyo ön parçasını çıkarın ve sonra da PSM da dahil olmak üzere arka bölümünden uzakta kalan yumurta sarısı hücre granüller kazımak için tel araçları. </li><li>Sarısı kazınarak edildikten sonra, düzleştirmek ve uzak deneyci işaret eden ön ucu ile PSM ve deneyci (Şekil 1C) doğru işaret posterior yönlendirin. </li><li> Ektoderm ince tabaka bu noktada çıkardı değilse, uzak PSM dokusunun üst onu soymak için tel araçlarını kullanın. </li><li> Mikro neşteri kullanarak uzak doku (kırmızı noktalı çizgi Şekil 1C) geri kalanından tailbud, Notokordun sonunun PSM&#39;sinin en arka ucu, kesti. Not: PSM gelen doku diğer parçaları, örneğin, ön PSM için yakın son hücre gruplarının oluşturduğu için, aynı deneysel soruna bağlı olarak, kültüre alınabilir. </li><li> Uzakta Diseksiyon alanından yemeğin bir köşesine tailbud taşı. Diseksiyon alanında herhangi bir enkaz ve istenmeyen embriyo doku temizlemek için tel araçlarını kullanın. </li><li> Sonraki embriyo ile tekrarlayın. </li></ol></li><li> Birden fazla e Havuz tailbud parçalarmbryos, deney için gerekli olacak kaç hücre bağlı olarak değişir. Ortalama olarak, tailbud doku tek bir parça 1000 hücreleri elde edilir. </li><li> Tripsin-EDTA küçük bir hacim ile boş 35-mm plastik çanak doldurun. </li><li> Yangın parlatılmış cam pipet kullanarak, tripsin / EDTA içeren çanak içine diseksiyon çanak dan tailbud parçaları aktarmak. Oda sıcaklığında 20 dakika boyunca tripsin / EDTA içinde tailbud parçaları inkübe edin. </li><li> Doku tripsin inkübe edilirken, cam tabanlı bir görüntüleme çanağından Fibronectin1 uzaklaştırın. <ol><li> MilliQ su ile cam 3 kez çözeltisi yıkayın. Her yıkama kaldırmak ve çanak tamamen kuru olduğundan emin olmak için emme kullanın. </li></ol></li><li> Görüntüleme için bir ortam içinde tailbud parçaları dağıtılır. <ol><li> Görüntüleme çanak içine serum ile L15 orta 100 ul pipet. </li><li> Kaplanmış bir jel ucunu kullanarak, mümkün olduğu kadar küçük bir hacim içinde tripsin / EDTA tailbud parçaları çıkarın. </li><li> Içindeki ortam içine tailbud parçaları Pipetgörüntüleme çanak. Birbirinden kırmak ve orta hücreleri askıya yukarı ve aşağı birden çok kez adet Pipet. Hava kabarcıkları tanıtmak için dikkatli olun. Mikroskop altında hücre kümeleri için kontrol edin ve gerekiyorsa daha fazla dağılırlar. </li><li> Süspansiyon içinde dağılmış hücreler oda sıcaklığında 20 dakika boyunca Fibronectin1 kaplı cam üzerine yerleşmek için izin verin. </li></ol></li><li> Görüntüleme başlamadan önce, hücrelere serum ilave L15 ortamı küçük bir hacim. Yerleşik hücreleri bozmak için değil dikkatli olun. </li><li> Deney sorun dikkate alındığında, kültüre bir tamamlayıcı ya da ilaç tedavisi ekleyin. </li></ol> Dağınık PSM hücrelerinin 3. Görüntüleme <ol><li> Time-lapse görüntüleme mikroskobu sıcaklık odasında görüntüleme çanak kurmak. Deney için istenen sıcaklığa Warner odası ayarlayın. Çanak görüntü elde etme başlamadan önce en az 30 dakika boyunca dengelenmeye bırakın. Gerekirse, dış sıcaklık probu ile Crosscheck sıcaklık, çanak içine yerleştirilmiştir. NOT: Nedeniylesıcaklık ve somitogenesis oranı 21 stabil sıcaklık kontrolü arasındaki ilişki tek PSM hücrelerinde dönemin hassas ölçümler için gereklidir. </li><li> Maruz kalma süresi ve kazanç gürültü düzeyleri için iyi bir sinyal sağlamak için doygunluk olmadan şiddetlerinin geniş bir dinamik aralığı sağlamak olduğunu kontrol etmek için floresan kanal test görüntü kazanır. Bu protokolü kullanarak bizim hatları oluşturulan dağılmış hücrelerden alınan tipik bir floresan görüntü 85 EM Kazancı çalışan bir EMCCD kamera ile iletilen ışık görüntü için 400 msn ve 40 msn gerektirir. Gelen ek olarak, pre-amp kazancı ve okuma hızı Kamera aynı zamanda gürültü üzerinden sinyal üst düzeye çıkarmak için gereklidir. </li><li> Iletilen ışık kanalını kullanarak, time-lapse edinimi için hücrelerin alanları seçin. </li><li> Zaman istenilen uzunlukta için time-lapse edinimi protokolü çalıştırın. <ol><li> Bir iletilen ışık ve alan başına bir floresan görüntü kazanır. NOT: iktisap ro arasındaki aralığı ayarlayınhücrelerde genişletilmiş görüntüleme veya uyaran toksisite üzerinde fotoğraf çizmeden zamansal dinamiklerini yakalamak olacaktır unds. Bu protokol 2 dk aralığını kullanır. </li></ol></li><li> Hücreler, herhangi bir yazılım veya donanım hataları, vb odak içinde kalmasını sağlamak için kayıt sırasında zaman zaman atlamalı set Check-up </li></ol> Edinsel Time-lapse Filmler 4. Görüntü İşleme <ol><li> Açık film bir görüntü işleme yazılımı kazanılmış bir alan için dosya. NOT: Bu protokol Fiji tüm işlem için kullanılmıştır. <ol><li> Bölünmüş görüntülerin 2 yığınlar oluşturmak için tek bir alandan ışık ve floresan çerçeveleri iletilir. </li></ol></li><li> Iletilen ışık kanalda bir tek hücre izlemek. <ol><li> Iletilen ışık kanalında ilk çerçevede seçilen hücrenin etrafında dairesel bir ROI (region of interest) yerleştirin. . NOT:. 1. kaydın sonunda sağlıklı Yalnızca hücreler, 2 alanın dışında hareket etmiyor ve 3 diğer ce ile temas yoktur.lls izlenir. </li><li> Bir ROI ROI yöneticisi her birkaç kare kaydedin. Son kareye kadar hücre izlemek. </li></ol></li><li> Floresan kanalda kayıtlı İB&#39;leri kullanarak yoğunluğunu ölçün. <ol><li> Floresan yığını seçin ve kaydedilen ROI&#39;ler ile zamanla izlenen hücre yoğunluğunu ölçmek için özel daire interpolator plug-in ve makro kullanabilirsiniz. </li><li> Makro çıkış izi kontrol edin. Iz niteliksel floresan time-lapse özelliklerini yakalar, bir Excel çalışma sayfasına değerleri ihracat. </li><li> Hücre için ROI listesini kaydedin. </li></ol></li><li> Iletilen kanal izleme ve alandaki diğer hücreler için floresan kanal ölçme tekrarlayın. </li><li> Deneyden ek alanlar için tüm adımları tekrarlayın. </li></ol>

<ol><li>Cooke, J., Zeeman, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+clock+and+wavefront+model+for+control+of+the+number+of+repeated+structures+during+animal+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Theor+Biol%22%5BJournal%5D)">A clock and wavefront model for control of the number of repeated structures during animal morphogenesis.</a> J Theor Biol. 58, 455-476 (1976).</li>
<li>Oates, A. C., Morelli, L. G., Ares, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterning+embryos+with+oscillations%3A+structure%2C+function+and+dynamics+of+the+vertebrate+segmentation+clock%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Patterning embryos with oscillations: structure, function and dynamics of the vertebrate segmentation clock.</a> Development. 139, 625-639 (2012).</li>
<li>Dequeant, M. L., Pourquie, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Segmental+patterning+of+the+vertebrate+embryonic+axis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Segmental patterning of the vertebrate embryonic axis.</a> Nat Rev Genet. 9, 370-382 (2008).</li>
<li>Oates, A. C., Gorfinkiel, N., Gonzalez-Gaitan, M., Heisenberg, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+approaches+in+developmental+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Quantitative approaches in developmental biology.</a> Nat Rev Genet. 10, 517-530 (2009).</li>
<li>Oates, A. C., Ho, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hairy%2FE%28spl%29-related+%28Her%29+genes+are+central+components+of+the+segmentation+oscillator+and+display+redundancy+with+the+Delta%2FNotch+signaling+pathway+in+the+formation+of+anterior+segmental+boundaries+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Hairy/E(spl)-related (Her) genes are central components of the segmentation oscillator and display redundancy with the Delta/Notch signaling pathway in the formation of anterior segmental boundaries in the zebrafish.</a> Development. 129, 2929-2946 (2002).</li>
<li>Lewis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoinhibition+with+transcriptional+delay%3A+a+simple+mechanism+for+the+zebrafish+somitogenesis+oscillator%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Autoinhibition with transcriptional delay: a simple mechanism for the zebrafish somitogenesis oscillator.</a> Curr Biol. 13, 1398-1408 (2003).</li>
<li>Schroter, C., Oates, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Segment+Number+and+Axial+Identity+in+a+Segmentation+Clock+Period+Mutant%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Segment Number and Axial Identity in a Segmentation Clock Period Mutant.</a> Curr Biol. 20, 1254-1258 (2010).</li>
<li>Riedel-Kruse, I. H., Muller, C., Oates, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synchrony+dynamics+during+initiation%2C+failure%2C+and+rescue+of+the+segmentation+clock%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Synchrony dynamics during initiation, failure, and rescue of the segmentation clock.</a> Science. 317, 1911-1915 (2007).</li>
<li>Ozbudak, E. M., Lewis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+signalling+synchronizes+the+zebrafish+segmentation+clock+but+is+not+needed+to+create+somite+boundaries%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Notch signalling synchronizes the zebrafish segmentation clock but is not needed to create somite boundaries.</a> PLoS Genet. 4, e15(2008).</li>
<li>Herrgen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intercellular+Coupling+Regulates+the+Period+of+the+Segmentation+Clock%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Intercellular Coupling Regulates the Period of the Segmentation Clock.</a> Curr Biol. 20, 1244-1253 (2010).</li>
<li>Sawada, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fgf%2FMAPK+signalling+is+a+crucial+positional+cue+in+somite+boundary+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Fgf/MAPK signalling is a crucial positional cue in somite boundary formation.</a> Development. 128, 4873-4880 (2001).</li>
<li>Giudicelli, F., Ozbudak, E. M., Wright, G. J., Lewis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Setting+the+tempo+in+development%3A+an+investigation+of+the+zebrafish+somite+clock+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Setting the tempo in development: an investigation of the zebrafish somite clock mechanism.</a> PLoS Biol. 5, e150(2007).</li>
<li>Herrgen, L., Schroter, C., Bajard, L., Oates, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+embryo+time-lapse+imaging+of+zebrafish+development%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Multiple embryo time-lapse imaging of zebrafish development.</a> Methods Mol Biol. 546, 243-254 (2009).</li>
<li>Hirata, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oscillatory+expression+of+the+bHLH+factor+Hes1+regulated+by+a+negative+feedback+loop%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Oscillatory expression of the bHLH factor Hes1 regulated by a negative feedback loop.</a> Science. 298, 840-843 (2002).</li>
<li>Maroto, M., Dale, J. K., Dequeant, M. L., Petit, A. C., Pourquie, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synchronised+cycling+gene+oscillations+in+presomitic+mesoderm+cells+require+cell-cell+contact%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Synchronised cycling gene oscillations in presomitic mesoderm cells require cell-cell contact.</a> Int J Dev Biol. 49, 309-315 (2005).</li>
<li>Reppert, S. M., Weaver, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordination+of+circadian+timing+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Coordination of circadian timing in mammals.</a> Nature. 418, 935-941 (2002).</li>
<li>Welsh, D. K., Imaizumi, T., Kay, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+reporting+of+circadian-regulated+gene+expression+by+luciferase+imaging+in+plants+and+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Real-time reporting of circadian-regulated gene expression by luciferase imaging in plants and mammalian cells.</a> Methods Enzymol. 393, 269-288 (2005).</li>
<li>Soroldoni, D., Oates, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+transgenic+reporters+of+the+vertebrate+embryo%27s+Segmentation+Clock%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Live transgenic reporters of the vertebrate embryo's Segmentation Clock.</a> Curr Opin Genet Dev. 21, 600-605 (2011).</li>
<li>Masamizu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+imaging+of+the+somite+segmentation+clock%3A+revelation+of+unstable+oscillators+in+the+individual+presomitic+mesoderm+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Real-time imaging of the somite segmentation clock: revelation of unstable oscillators in the individual presomitic mesoderm cells.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 103, 1313-1318 (2006).</li>
<li>Soroldoni, D., Hogan, B. M., Oates, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+and+efficient+transgenesis+with+meganuclease+constructs+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Simple and efficient transgenesis with meganuclease constructs in zebrafish.</a> Methods in molecular biology. 546, 117-130 (2009).</li>
<li>Schroter, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+zebrafish+somitogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Dynamics of zebrafish somitogenesis.</a> Dev Dyn. 237, 545-553 (2008).</li>
<li>Picker, A., Roellig, D., Pourquie, O., Oates, A. C., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+micromanipulation+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Tissue micromanipulation in zebrafish embryos.</a> Methods in molecular biology. 546, 153-172 (2009).</li>
<li>Mould, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+multiple+integrin+beta1+homologs+in+zebrafish+%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Identification of multiple integrin beta1 homologs in zebrafish (Danio rerio).</a> BMC Cell Biol. 7, 24(2006).</li>
<li>Mould, A. P., Koper, E. J., Byron, A., Zahn, G., Humphries, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+the+ligand-binding+pocket+of+integrin+alpha5beta1+using+a+gain-of-function+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Mapping the ligand-binding pocket of integrin alpha5beta1 using a gain-of-function approach.</a> Biochem J. 424, 179-189 (2009).</li>
<li>Zhao, Q., Liu, X., Collodi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+a+novel+fibronectin+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of a novel fibronectin in zebrafish.</a> Exp Cell Res. 268, 211-219 (2001).</li>
<li>Westerfield, M. In The zebrafish book : a guide for the laboratory use of zebrafish (Brachydanio rerio). , (1993).</li>
<li>Vallone, D., Santoriello, C., Gondi, S. B., Foulkes, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+protocols+for+zebrafish+cell+lines%3A+maintenance+and+transfection%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Basic protocols for zebrafish cell lines: maintenance and transfection.</a> Methods Mol Biol. 362, 429-441 (2007).</li>
<li>Carr, A. J., Whitmore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+single+light-responsive+clock+cells+reveals+fluctuating+free-running+periods%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Imaging of single light-responsive clock cells reveals fluctuating free-running periods.</a> Nat Cell Biol. 7, 319-321 (2005).</li>
<li>Whitmore, D., Foulkes, N. S., Sassone-Corsi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+acts+directly+on+organs+and+cells+in+culture+to+set+the+vertebrate+circadian+clock%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Light acts directly on organs and cells in culture to set the vertebrate circadian clock.</a> Nature. 404, 87-91 (2000).</li>
<li>Soroldoni, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Doppler+effect+in+embryonic+pattern+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A Doppler effect in embryonic pattern formation.</a> Science. 345, DOI. 222-225 (1126).</li>
</ol>

Yazar Katılımlar: ABW geliştirilen ve dağılma, kültür, görüntüleme ve hücre izleme protokolleri rafine. DS transgenik hatları oluşturulur ve bu protokolde kullanılan time-lapse floresan mikroskop tasarımını yönetti. AO ayırmak için ilk kanıt-prensibi deney öncülük ve kültür görüntü PSM hücreler. JS time-lapse film floresan yoğunluğunu ölçmek için kullanılan Fiji daire interpolator eklenti aracı yazdı. ABW ve ACO el yazması yazdı.

Embriyonik gelişim boyunca yer alan bir hücresel süreç çalışma için, biyologlar tipik olarak tüm embriyo bağlamında bir yaklaşımı kullanır. Ancak, tam bir tek hücre gelişimsel bir zaman çerçevesinde nasıl davrandığını anlamak, incelemek ve izolasyon bireysel hücrelerin perturb bir yöntem de son derece faydalıdır. Transgenik zebra balığı embriyoları kullanılarak dağıtıldı PSM hücre kültürleri üreterek artık doğrudan bir nicel şekilde segmentasyon saat genetik salınımlarının hücre özerk doğasını incelemek için bir araç var. Bu, çeşitli koşullar altında hücre yüzlerce bizim floresan haberci olarak salınım dinamiği ölçmek mümkündür. Kültür içinde tek hücre gözlenen süre sağlam embriyo somitogenesis süresinden daha uzundur. Bu kültürde, bozulmamış bir PSM eksplant da tha düşündüren, dokunulmamış embriyo (veriler gösterilmemiştir) daha yavaş salınımların sergiler gözlemlemekt izole edilmiş hücrelerde gözlemlenen daha uzun bir süre dağılımı gelen hasara karşı sadece bağlı değildir. Bir değişken periyodu ve genliği bizim tek hücreli zaman serilerinin çoğunda görülmektedir. Bu değişkenlik kaynağı bilinmiyor, ancak segmentasyon saatin hızı verme devreleri hakkında önemli ayrıntılar ortaya koymalıdır. Bu yöntem ile biz bütün embriyo incelemek için zorlu genetik hücresel düzeyde segmentasyon bileşenleri ve adres çalışma soruları olabilir. Örneğin, kültürlere gelişen embriyonun bulunan bilinen sinyal molekülleri kontrollü eklenmesiyle, bir sağlam ve tekrarlanabilir bir deneyde bir PSM hücre osilatör üzerindeki etkilerini incelemek. Bizim PSM kültür sistemi bu titreşimleri engelleyen faktörler neler, yalnız, faktörleri, veya birlikte, bu hücrelerde salınımı teşvik ne bir titiz değerlendirme için kapıyı açar, ve bu tür moleküller arasındaki etkileşimi test etmek. Elinde Bu araçları ile, biz hedefliyoruzBütün embriyo test edilebilir tahminler üretmek için tek bir hücre içinde yayınlanan doku düzey veri yanı sıra, kullanım sonuçlarına dayalı somitogenesis mevcut modellerini değerlendirir. Bildiğimiz kadarıyla, bu tek hücre floresan akut time-lapse kayıt için ilk Zebrafish birincil hücre kültürü protokolü; Bu protokolün daha da geliştirilmesi ve arıtma mümkün kuşkusuz. Diğer protokoller genellikle muhabir ile transfekte edilmiş ve uzun süreli görüntüleme 27-29 için kullanılabilecek kararlı hücre kuşaklarının üretilmesi için zebra balığı embriyolar kullanın. Kararlı çizgiler gibi sirkadiyen saati geliştirme zamanlaması, bağlı olmayan bir süreç görüntüleme için yararlı olmakla birlikte, hücreler salınımlı, öncül devlet hala iken, embriyonik segmentasyon soru acil görüntüleme gerektirir. Hücreler salınan durdurmak sonra, onlar dokuda, bir hücre gruplarının dahil olacağını zaman bir farklılaşmış hücre kaderi varsayalım, ve. Bu poDoğru faktörü veya in vitro olarak mevcut faktörler ile önemli ölçüde daha uzun vadeli gözlemler, birden çok ardışık bozulmaları, ya da yüksek verimli tarama sağlayan titreşimli kalacağını PSM-benzeri zebra balığı hücre kültür hatları oluşturmak olabilir ssible. Biz zaman atlamalı görüntüleme için dağılmış hücrelerden primer kültürü hazırlama, bu yöntem kararlı Zebrafish hücre hatları kullanılarak ulaşılabilir değildir gelişimsel bir zaman dilimi içinde meydana gelen herhangi bir hücresel sürecin çalışması için çok uygun olduğunu düşünüyoruz. Diseksiyon ile veya FACS ile ya da uygun bir transgenik raportör hatlardan farklı gelişim aşamalarında farklı hücre tiplerinin izolasyonu embriyonik ayrıldıktan sonra, başlangıç ​​hücreleri sağlayabilir. Hücrelerin embriyo tarafından yönlendirilen kültür koşulları, bazı optimizasyonu, gerekli olabilir. Transgenik zebrafish hızla büyüyen koleksiyonu ile bu esnek ve hassas protokol birleştirerekçizgiler, biz klasik genetik ve embriyolojik yöntemlere tamamlayıcı olan bir in vitro gelişim biyoloji yaklaşımı kolaylaştırmak istedik.

Omurgalı vücut ekseni, ya da somitogenesis boyunca bölümlerinin periyodik oluşumu, gelişmekte olan embriyonun bir mekansal ve zamansal osilatör kanıtıdır. Somitogenesis kontrol tercih mekanizması kavramsal şimdi hücre siklik genlerin 2 bir dizi ritmik ifadesi tarafından tahrik edilmesi düşünülen hücresel osilatörler oluşan &quot;saat&quot;, oluşumunu kapalı keneler buradaki bir &quot;saat ve Wavefront&quot; modeli 1, tarafından açıklanan bir Somitlerin presomitic mezoderm (PSM) dan. Embriyo geliştikçe, PSM bir olgunlaşma &quot;Wavefront&quot; yavaşlatma ve 3 geçer gibi hücresel osilatörler tutuklanması, posterior doğru gerileyen dokusu ile uyum içinde hareket eder. Birlikte, bu spatiotemporally dinamik sistem bölümleme saati denir. Segmentasyon saat SPAN yerel bağlama inci tek hücrelerde genetik osilatör gelen üç organizasyon artan düzeyde çalışma Güncel yaklaşımlar, hücreler ve son olarak toplu doku PSM 4 konum bilgileri ve küresel düzenlemeye arasında ortaya çıkar. Önceki çalışmalar zebrabalıkları hücre özerk segmentasyon osilatör transkripsiyon baskının 5-7 ile bir negatif geri besleme döngüsü oluşturmak için düşünülen factorfamily onun / hes transkripsiyon, genlerin ve protein ürünlerden oluşmaktadır öneririz. Delta / Çentik sinyal yolu komşu hücreler arasındaki salınımlar eşitler ve nüfusun 8-10 toplu süre düzenler. Tailbud üretilen fgf sinyal molekülleri Zebrafish PSM degrade oluşturmak için görünür ve böylece anterior 11 salınan hücreleri yavaşlama ve tutuklamaya katkıda varsayılır. Şimdiye kadar, somitogenesis bu moleküllerin her birinin fonksiyonel rolleri genetik mutasyon, morfolino enjeksiyon, ısı-şok aşırı ifadesi ve antagonist ilaç trea tarafından incelenmiştirsaat bileşenleri ve hücreler arası sinyal 5,7,10,12 tment. Bu tedirginlikler kullanarak, segmentasyon saat fonksiyonu doku düzeyinde somite kusurları açıklamaları ve Her1, her7 ve delta gibi döngüsel genlerin ifadesinde üniforma salınımlarının kaybı olayla olmuştur C. Ancak, neredeyse tüm bu verilerin sabit embriyolar ve doğru bir segmentasyon saatin dinamik işlevi doğasında olan değişiklikleri yakalamak için başarısız. Daha yakın zamanlarda, birden fazla embriyo time-lapse görüntüleme değişmiş osilatör dönemi ile ilk mutantlar ortaya koymuştur, ancak bu gözlemler, aynı zamanda doku seviyesi 7,13 yapılmıştır. Bu nedenle, somitogenesis sırasında varsayılmış hücreye otonom osilatör davranışı gözlenmemiştir. Doğal olarak, işlem, bir titreşimli sistem tarafından tahrik edilir, çünkü somitogenesis statik anlık eksik bir görüntü verir. Fare ve civciv hücrelerinde önceki çalışmaları gösterdi transkript düzeylerive protein yükselişi ve düşüşü, ancak yaklaşık 2 saat salınım her 30 veya 45 dakika örnekleme mutlaka toplanan veri ve 14,15 çizilebilir nedenle sonuçlar kısıtlar. Diğer biyolojik osilatörler çalışma, en önemlisi, sirkadiyen saatler, gerçek-zamanlı floresan ve biyolüminesens gazetecilere 16,17 kullanarak izleme uzak gen ve protein ifade sahnelenen ölçümlerinden taşındı. Bu araçlar tek hücreler 18 saat özelliklerini göstermek için gereklidir. Hes1 siklik geninin bir bio-ışıldar haberci geliştirilmiş ve kısa bir süre için tek bir fare PSM hücre 19 ile karakterize edilmiştir. Ortalama süresi ve varyans salınımlar in vitro çok döngü boyunca devam olduğunu gösteren küçük bir hücre sayısı hesaplandı. Ancak bu çalışmalar kantitatif hücreleri kendiliğinden girmek veya çıkmak salınımlar olup olmadığını, osilatör frekans ve genlik kararlılık ve sağlamlık ele vermedi,ve nasıl hücreler faz ilişkileri sürdürmek. Buna ek olarak, hücre-özerk saati embriyo bulunan sinyal molekülleri etkiler, test edilmemiştir. Sonuç olarak, tek bir hücre osilatör bu temel özellikleri tamamen bilinmemektedir. Biz son zamanlarda Her1 ifade 30 Venüs (YFP) floresan gazetecilere sürücü BAC Recombineering 20 kullanılarak transgenik balık hatları geliştirdik. Bu çizgiler gömülü ve temporal dinamikleri ve Her1 uzamsal desen özetlemek edildiği dokunulmamış kromozomal düzenleyici ipuçları yararlanılmaktadır. Bu buluş, in vivo, gelişmekte olan embriyonun zebrafish gen ifadesinin gerçek zamanlı olarak izlenmesini sağlar. Temel hücre özerk salınım özellikleri ve ne tür ifade zaman içinde düzenlenir incelemek için, son zamanlarda in vitro PSM hücrelerinden izole etmek ve kaydetmek için güvenilir bir yöntem geliştirdi. Bu protocol biz tek hücrelere Zebra balığı segmentasyon saatin salınımlarını karakterize hangi dağınık hücre kültürleri, üretmek bizim transgenik muhabiri hatları kullanmıştır anlatıyor. Biz böylece üstün statik veya doku düzeyinde analiz ile erişilebilir değil alanındaki soruları, hem de doğrudan sinyal molekülleri ve inhibitörleri ile tek hücre düzeyinde segmentasyon saatini manipüle üstesinden gelebilirsiniz.

<table><tbody><tr><td>Epifloresan mikroskobu</td><td>Olympus</td><td>Model: SZX16</td><td></td></tr><tr><td>Epifloresan mikroskobu</td><td>X-cite Aydınlatma</td><td>Serisi: 120Q</td><td></td></tr><tr><td>Diseksiyon mikroskobu</td><td>Olympus</td><td>Model: SZX12</td><td></td></tr><tr><td>İnce forseps no. 55</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>11295-51</td><td></td></tr><tr><td>Cam transfer pipetleri</td><td>Assistent</td><td>567/2</td><td></td></tr><tr><td>35 mm plastik petri kapları</td><td>Greiner</td><td>627102</td><td></td></tr><tr><td>60 mm plastik petri kapları</td><td>Greiner</td><td>628102</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard polimer</td><td>SASCO</td><td>266727</td><td></td></tr><tr><td>Manipülasyon araçları</td><td>Şirket içinde</td><td></td> üretilmiştir <td>Manipülasyon araçlarının açıklaması için Ref. 22</td></tr><tr><td>Mikrocerrahi bıçak</td><td>World Precision Instruments</td><td>500249</td><td></td></tr><tr><td>L15 orta</td><td>Invitrogen</td><td>57322</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin / streptomyosin</td><td>PAA</td><td>P11-010</td><td></td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu</td><td>Invitrogen</td><td>257322</td><td></td></tr><tr><td>% 0.05 tripsin /% 0.02 EDTA</td><td>PAA</td><td>L11-004</td><td></td></tr><tr><td>Jel yükleme ipuçları</td><td>Fisher Scientific</td><td>253188</td><td></td></tr><tr><td>Sigmacote Sigma</td><td>Aldrich</td><td>254589</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipet seti</td><td>Gilson International</td><td>F167300</td><td></td></tr><tr><td>Zebra balığı Fibronektin1 70 kD fragman</td><td>MPI-CBG protein tesisi</td><td></td><td>Daha önce yayınlanmış çalışmalara dayalı olarak yapıdan şirket içinde oluşturulmuştur Ref. 23-25</td></tr><tr><td>Cam tabanlı görüntüleme kapları</td><td>Mattek (tek kuyulu)</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Cam tabanlı görüntüleme kapları</td><td>Greiner (CellView -çok kuyulu)</td><td>262502</td><td></td></tr><tr><td>Metilen mavisi içermeyen E3 ortamı</td> Zebra Balığı Kitabından Kurum <td></td><td>İçinde Üretilmiştir</td><td>, 5. Baskı Ref. 26 </td></tr><tr><td>Plastik transfer pipetleri</td><td>Ratiolab</td><td>260011</td><td></td></tr><tr><td>Warner ısıtma/soğutma odası</td><td>Warner</td><td>Instruments TC-324B/344B</td><td></td></tr><tr><td>EM-CCD kamera</td><td>Andor</td><td>Modeli: iXOn 888</td><td></td></tr><tr><td>Venüs filtre setli geniş alan floresan mikroskobu</td><td>Zeiss</td><td>Modeli: Axiovert 200M</td><td></td></tr><tr><td>Venüs filtre setli geniş alanlı floresan mikroskobu</td><td>NeoFluor 40x, NA 0.75</td><td></td>Venüs filtre setli geniş alanlı floresan mikroskobu Lumencor Light Motor Modeli: Spectra X Venüs filtre setli geniş alan floresan mikroskobu BrightLine HC 575/15 F39-575 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

tek hücrelerde zebra balığı segmentasyon clock görüntüleme dağınık presomitic mesoderm hücre kültürleri Üretimi

Generation of Dispersed Presomitic Mesoderm Cell Cultures for Imaging of the Zebrafish Segmentation Clock in Single Cells

Segmentasyon omurgalılarda bir periyodik ve ardışık morfojenetik süreçtir. Vücut ekseni boyunca Somitlerin denilen doku blokları bu ritmik oluşumu gelişen embriyo desenlendirme genetik osilatör kanıtıdır. Zebra balığı, hücre içi saat sürüş segmentasyon negatif geri besleme döngüleri halinde organize Onun / Hes transkripsiyon faktörü ailesinin üyelerinden oluşur. Biz son zamanlarda presomitic mezoderm (PSM) içinde salınımlarının uzay-zamansal desen özetlemek döngüsel gen Her1 için transgenik floresan muhabiri hatları yarattı. Bu satırları kullanarak, tek, izole PSM hücrelerin içinde segmentasyon saat salınımlarının gerçek zamanlı analiz sağlayan in vitro kültür sistemi geliştirdi. Transgenik embriyolar PSM dokusunun çıkartılması ve daha sonra cam alt yemekler üzerine bölgelerini salınan hücreleri dağıtılarak, biz floresan sinyalinin zaman atlamalı görüntüleme gelen uygun kültürleri oluşturulanBireysel saat hücreleri. Bu yaklaşım kendi hücre-özerk ve doku düzeyi özellikleri ayırt ve disseke izin vererek, görülmemiş tek hücreli çözünürlükte segmentasyon saatin doğrudan manipülasyon için bir deneysel ve kavramsal bir çerçeve sunmaktadır.

Bu protokol floresan sinyalinin zaman atlamalı görüntüleme (Şekil 2) için uygun, dağınık, tek PSM hücre kültürleri üretir. Bizim transgen olan döngüsü üretimi ve yıkımı yarım saat emriyle embriyo endojen gen ve protein, benzer dinamikleri ile oluşan bir muhabir oluşturur. Nedeniyle, hızlı devir için, tek hücreler içinde YFP sinyal ağartma en aza indirmek için hızlı bir şekilde tespit edilir ve her bir salınım döngüsü özelliklerini yakalamak için yüksek zamansal çözünürlüğe sahip olmalıdır. Ayrıca, sinyalin göreli dimness verilen, kültür ve satın alma koşulları dikkatle hassas ve sağlam sonuçlar sağlamak için ayarlanmış edilmiştir. . Cam alt kültür kaplarına kaplanması için kullanılan bir ECM 1 alt-tabaka: Bu görüntüleme için en iyi PSM hücre kültürleri elde edilmesinde önemli olduğu şu faktörler bulduk. 2.. Diseksiyon ve görüntüleme ortamına serum eklenmesi. HETE çiftleşme sonrası alınan tespit embriyolardan PSM&#39;nin 3. Diseksiyonolan yavrular potansiyel Transgenin 2 kopyasını taşıyan rozygous çiftleri. Floresan sinyalin etkin yakalama sağlamak için daha yüksek bir NA objektif kullanarak optimal bir büyütme aralığında 4. Görüntü elde edilmesi,. 5.. Arka plan gürültü katkıda bulunabileceğini yoğunluk dalgalanmaları en aza indirmek için bir katı-hal ışık kaynağı ile aydınlatılması. 6.. Son derece hassas EM-CCD kamera ile Sinyal algılama sinyali okuma üst düzeye çıkarmak. Alt-optimal kültürleri kayıt boyunca yuvarlak ve sağlıklı kalması gerekmez hücreleri içerir. Biz ECM alt-tabaka, zebra balığı fibronectin1 bir fragmanı ya da poli-lisin, laminin gibi diğer yaygın olarak kullanılan alt-tabakalar ile karşılaştırıldığında, farklılaşmamış bir PSM-benzeri halde hücreleri tutan varsayıldı. Test Diğer alt-tabakalar hücreler kaydın boyunca cam ve salınan fluoresan sinyalinin kaybı düzleştirmek neden oldu. Ayrıca bulundu Diseksiyon sırasında ortama serumunun eklenmesi, dağılma,ve kayıt sadece ayrışması için kullanılan tripsin söndürmek için önemli değil, aynı zamanda geliştirilmiş nedeniyle hücre canlılığı muhtemel arka plan üzerinde floresan yoğunluğu, artmıştır. Tek hücre optimal sinyal yakalama sağlamak için bir yüksek NA ile spesifik floresan görüntüleme (Zeiss Planı NeoFluor serisi) için tasarlanmış bir 40x objektif kullanılır. Ayrıca, bir katı-hal ışık kaynağı gürültülü görüntüleri katkı plan dalgalanmaları en aza indirmek için kritik geleneksel cıva lambaları, daha stabil bir aydınlatma sağlanmaktadır bulundu. Bu değişiklikler sonucu sağlamak için önemlidir. Bu protokol kullanılarak beklenen belirli bir alanda hücrelerin çoğunluğu kayıt sırasında bir noktada floresan edildiği kültürler. Biz floresan hücreler tipik kayıtları sırasında bazen oldukça hareketli yuvarlak kalır ve olduğunu bulmak. Floresan hücreler de dahil olmak üzere bir kaç hücreleri, kayıt sırasında apoptotik olabilir. Bu hücreler, herhangi bir a hariç tutulmuşturnalysis. Ayrıca, diğer hücrelerle temas hücreleri hariç veya görüş alanının dışında hareket eder. Iletilen ışık kanalda sağlıklı hücrelerin sayısının sayılmasıyla ölçüldü Ortalama olarak, biz 10 saat kaydının sonuna kadar alan başına hücre sayısında% 12 azalma bkz. Bu kayıp, hücre ölümü ve alanının dışına taşındı hücreleri içerir. Bu uyarılar göz önüne alındığında biz, ortalama, tipik parça 5 florasan canlı ve görünür alan başına hücreleri ve durumuna başına 6 alanlarını kaydedebilirsiniz. Örneğin, 4 koşullara sahip bir deney 24 toplam alanları tipik durum başına yaklaşık 30 paletli hücreleri edinilen ve olacaktır. % 10 fetal inek serumu ihtiva eden L15 ortam maddesi ile standart görüntüleme koşullarında, PSM hücrelerinin (4 deney tekrarlanmış olan n = 101 hücreleri) 3 ± 1 tepe (2 ortalama ve standart sapma ile birlikte, 2 ve 7 tepe arasında üretebilir bulmak -3 siklus). Medyan peak sayısı, hem de% 25 yüzde, 2 tepe noktası ve% 75 yüzde i3. zirveleri var. Bizim yarı otomatik bir izleme ve analiz kullanarak, hızlı bir şekilde Şekil 2C&#39;de gösterilen temsili bir hücre iz, tek tek hücreler için PSM zaman izleri üzerinde floresan yoğunluğu oluşturabilir. Bu ham izleri daha sonra, frekans, genlik, döngü sayısı ve tepe zamanlaması olarak salınımlı PSM hücrelerinin özelliklerinin sayısal ölçümler yapmak için kullanılabilir. <img alt="Şekil 1" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50307/50307fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50307/50307fig1.jpg" /> ~ 5-somite aşamada YFP floresan ifade eden bir transgenik zebrafish embriyo kendi diseksiyonu transgenik embriyolar ve şemaları Şekil 1.. Kimlik. (A) Yanal görünümü. Görüntü iletilen ışık ve floresan kanal bir bindirme olduğunu. Oklar l doğru, PSM boyunca tailbud ucundaki başlangıç ​​sinyalinin alanlarını gösterir<html> ast hücre gruplarının kurdu. Ankastre gelişimi ve in vivo davranışlarında daha fazla bilgi için Soroldoni vd. 30&#39;a bakın. Ilk diseksiyonu sırasında kesmek için önce embriyonun lateral görüntüsü (B) şematik. Noktalı kırmızı çizgi ilk kesim gösterir (raportör transgen bir şematik sadece tailbud sarısı granüller ve anterior-posterior ekseni boyunca yönlendirilmiş epidermal tabakasının ayrılmasından sonra yassı PSM&#39;nin. (C) şematik görünümü arkasında sarısı hücre. noktalı kırmızı çizgi ucu kaldırmak için ikinci kesimini göstermektedir da, arka beyin boyunca yapılan dağılma ve kültür için tailbud ait. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50307/50307fig1highres.jpg" target="_blank">, bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.</a> 07fig2.jpg &quot;/&gt; Şekil 2. Dağınık bir PSM kültüründe bir tek hücreden Temsilcisi görüntüler ve izler. (A) Kurulma bir 6-saat time-lapse kayıt tek PSM hücrenin ışık görüntülerini iletilir. Hücre kaydın kurs boyunca yuvarlak ve sağlıklı kaldığına dikkat edin. (B) tek bir hücreden PSM floresan görüntülerin karşılık gelen montaj. Hücre yoğunluğundaki pikleri kaydın boyunca numaralandırılır. Bu hücreye yerleştirilmiş bir ROI ölçüldüğü zaman (C) ortalama yoğunluğu. Değerler Fiji yazılı daire interpolator plug-in ve özel makro kullanarak 2 dakika başına birinin bir kare hızı ile bir film her karede alınır. Yoğunluk zirveleri tekrar iz boyunca numaralandırılır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50307/50307fig2highres.jpg" target="_blank">, bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.</a>

Somitogenesis ritmik bir gelişimsel süreç olduğu mekansal desenler, embriyonun vücut ekseni. Daha önce, biz bu süreci götürmek döngüsel genleri gözlemlemek için floresan gazetecilere kullanmak transgenik zebra balığı hatları geliştirdik. Burada, kültür in vitro zamanla bu satırları ve görüntü onların salınımların hücreleri dağınık.

Tek Hücrelerde Zebra balığı Segmentasyon Clock Görüntüleme Dağınık Presomitic Mesoderm Hücre Kültürleri Üretimi

Segmentation is a  periodic and sequential morphogenetic process in vertebrates. This rhythmic  formation of blocks of tissue called somites along the ...

Bu prosedürün genel amacı, zebrafish segmentasyon saatinin tekil izole hücrelerinde, döngüsel gen ekspresyonunun floresan raporlarındaki osilasyonların uzun süreli görüntülemesi için dağılmış kültürler oluşturmaktır. Bu işlem, öncelikle transgenik zebrafish embriyolarından presomit mesoderm veya PSM dokusunun disseksiyonu ile gerçekleştirilir. Ardından, PSM'nin en posterior parçası olan kuyruk tomurcuğu birden fazla embriyodan disseke edilir ve parçalar tripsin içerisinde birleştirilir.Ardından, kuyruk tomurcuğu parçaları bir pipet yardımıyla manuel olarak dağıtılarak bir hücre süspansiyonu oluşturulur. Son olarak, hücre süspansiyonu uzun süreli görüntüleme için fibronektin kaplı kültür kaplarına ekilir. Nihayetinde, floresan zamanlaşım mikroskobisi aracılığıyla tekil PSM hücrelerinden zaman içinde yoğunlukta meydana gelen çoklu osilasyonları gösteren sonuçlar elde edilebilir.Bu tekniğin, PSM dokusundaki gen ekspresyonunun C iki hibridizasyonu gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, floresan raporumuzun segmentasyon saatindeki osilasyonların dinamiğinin tek hücre düzeyinde gerçek zamanlı olarak izlenmesine olanak tanımasıdır. Bu yöntem, segmentasyon saatine dair benzersiz bilgiler sağlayabileceği gibi, uygun transgenik hatların mevcut olduğu organogenez veya hastalık modelleri gibi, tek hücre düzeyindeki davranışlar hakkında bilgi verebileceği diğer sistemlerde de kullanılabilir. Diseksiyonun bir gün öncesinde, transgenik alel için heterozigot olan zebra balığı çiftlerinin çaprazlamasından embriyolar elde edin.Embriyoları, fertilizasyondan yaklaşık altı saat sonra (HPF) kalkan evresine ulaşana kadar 28 °C'de metilen mavyesi içermeyen E3 ortamında büyütün; ardından embriyoları metilen mavyesi içermeyen E3 ortamına aktararak gece boyunca 20 °C'de bekletin. Embriyolar, kuyruk tomurcuğu evresine ulaştıklarında saatte bir somiti oluşturacaklardır. Ertesi sabah diseksiyon protokolünün başlangıcında, embriyolar beş ila sekiz somit evresinde olmalıdır. Diseksiyon araçlarını hazırladıktan sonra, cam tabanlı bir görüntüleme kabını fibronectin 1 substratı ile kaplayın.Floresan stereo mikroskop altında diseksiyon yapılırken, kaplamanın gerçekleşmesi için kabı tezgah üzerinde bırakın. Presomitik mezodermi veya PSM'yi inceleyerek transgenik embriyoları tanımlayın. YFP ekspresyonu için.Son oluşan somiti ile kuyruk tomurcuğu arasındaki bölgede floresans görünür olmalıdır. En parlak sinyale sahip embriyolar seçiniz. Geçirgen ışığı konum referansı olarak kullanarak, yavruların %25'inin transgenin iki kopyasını taşıyan homozigot embriyolar olması beklenir.Otofloresans transferine karşı pozitif olan embriyoları ayırt etmek için, bunları metilen mavisi içermeyen E three ortamı bulunan ayrı bir plastik Petri kabına aktarın. Embriyoları bir diseksiyon mikroskobu altında ince pensler kullanarak diseksiyona hazırlamak için, her bir embriyonun koriyonunu E three ortamı içindeyken dikkatlice çıkarın. Embriyoya zarar vermediğinizden veya oosit hücresini bozmadığınızdan emin olun.Pens veya başka bir düz alet kullanarak, cyl guard kaplı bir diseksiyon kabını serumlu L 15 besiyeri ile doldurun. Ateşte uçları düzeltilmiş bir cam pipet yardımıyla S guard yüzeyindeki hava kabarcıklarını giderin. Kaplanmış embriyoları diseksiyon kabına aktarın ve tel aletlerle tüm embriyoları bir kenara toplayın.Ardından, diseksiyon kabı içindeki sard tabakasında oluşturulan küçük kuyucuğa tek bir embriyoyu yan tarafı üzerine gelecek şekilde yerleştirin. Daha sonra, mikro skalpel kullanarak embriyoyu ve vitellüs hücresini, arka beynin hemen önünden ve embriyonun ventral kutbundan geçecek şekilde kesin. Embriyonun ön parçasını kuyucuktan çıkararak kabın yan tarafına alın.Ardından, PSM dahil olmak üzere posterior bölümdeki kalan vitellus hücresi granüllerini kazımak için tel aletleri kullanın. Sonra, PSM'yi anterior ucu dışa, posterior ucu ise öne bakacak şekilde düzleştirin ve yönlendirin. Eğer ektodermin ince tabakası bu noktaya kadar ayrılmamışsa, tel aletlerini kullanarak onu PSM dokusunun üzerinden soyun; mikro skalpel yardımıyla PSM'nin en posterior ucunu, notokordun sonunun veya kuyruk tomurcuğunun ötesinden keserek dokunun geri kalanından ayırın.Kuyruk tomurcuğu parçasını, diseksiyon alanından uzağa, kabın bir köşesine taşıyın ve diseksiyon alanı havuzundaki tüm kalıntıları ve istenmeyen embriyo dokularını temizlemek için tel aletleri kullanın. Deney için gereken hücre sayısına bağlı olarak birden fazla embriyodan kuyruk tomurcuğu parçaları alın. Ortalama olarak, tek bir kuyruk tomurcuğu doku parçası 1000 hücre sağlar.Boş bir 35 milimetrelik plastik kaba küçük bir hacimde tripsin EDTA doldurun ve alevle uçları düzeltilmiş cam pipet kullanarak kuyruk tomurcuğu parçalarını kabın içine aktarın. Doku tripsin içinde inkübe olurken 20 dakika boyunca oda sıcaklığında bekletin; bu sırada cam tabanlı görüntüleme kabındaki fibronektin 1 çözeltisine milli Q su ekleyin.Çözeltiyi uzaklaştırın ve camı Milli Q suyu ile üç kez yıkayın. Her yıkama işlemini sonrasında sıvıyı uzaklaştırmak için vakum kullanın ve kabın tamamen kuru olduğundan emin olun. Kuyruk tomurcuğu parçalarını görüntülemek için, görüntüleme kabına serum içeren 100 µL L 15 pipetleyin.Kaplamalı bir jel uç kullanarak, kuyruk tomurcuğu parçalarını mümkün olan en küçük trypsin EDTA hacmiyle görüntüleme kabına aktarın. Parçaları birbirinden ayırmak ve hücreleri besiyerinde süspansiyona getirmek için parçaları birkaç kez yukarı aşağı pipetleyin. Hava kabarcığı oluşturmamaya dikkat edin.Hücrelerin oda sıcaklığında 20 dakika boyunca fibronectin one kaplı cam üzerine çökmesini bekleyin. İnkübasyonun ardından, hücrelere serum içeren küçük bir hacimde ek L 15 besiyeri ekleyin. Görüntülemeye başlamadan önce.Çökmüş hücreleri bozmamaya dikkat edin. Hücreleri görüntülemek için, önce petri kabını time-lapse mikroskobundaki sıcaklık odasına yerleştirin.Görüntüleme işlemine başlamadan önce istenen sıcaklığı ayarlayın ve kabın en az 30 dakika boyunca dengeye gelmesine izin verin. Periyodun doğru ölçülebilmesi için sıcaklığın sabit kalması esastır. Tekli PSM hücrelerinde, pozlamayı kontrol etmek için test floresan görüntüleri alın.Zaman ve kazanç. İyi sinyal-gürültü seviyeleri sağlamak için doygunluk oluşmadan geniş bir yoğunluk dinamik aralığı sunun. Hatlarımızdan elde edilen yayılmış hücrelerden alınmış tipik bir floresan görüntü.Bu protokolün uygulanması, 85 EM kazancında çalışan bir E-M-C-C-D kamera ile iletim ışığı görüntüsü için 400 milisaniye ve 40 milisaniye gerektirir. Ayrıca, iletim ışığı kanalı kullanılarak sinyal-gürültü oranını maksimize etmek için kameradaki ön yükseltici kazancı ve okuma hızı da temel öneme sahiptir; zaman ayarlı (time-lapse) çekim için bir hücre alanı seçin. Foto ağartma (photo bleaching) oluşturmadan veya hücrelerde toksisiteye yol açmadan zamansal dinamikleri yakalayacak iki dakika gibi bir aralıkla, alan başına bir iletim ışığı ve bir floresan görüntüsü alarak zaman ayarlı bir çekim protokolü yürütün.Time-lapse videolarını işlemek için bir dosya açın ve iletilen ışık ile floresan karelerini ayırarak iki görüntü yığını oluşturun. İletilen ışık kanalında tek bir hücreyi takip etmek için, kayıt sonunda hâlâ sağlıklı olan, görüş alanı dışına çıkmayan ve diğer hücrelerle temas etmeyen bir hücrenin etrafında dairesel bir ilgi alanı (ROI) seçin.Her birkaç karede bir bir ROI'yi ROI yöneticisine kaydedin ve hücreyi son kareye kadar takip edin. Floresan yığınını seçin ve kaydedilen ROI'leri kullanarak, takip edilen hücrenin yoğunluğunu zaman içinde ölçmek için özel daire INTERPOLATOR eklentisini ve makrosunu kullanın. Makro için oluşturulan çıktı izinin, floresan zaman atımlı görüntülemenin özelliklerini niteliksel olarak yakalayıp yakalamadığını kontrol edin.Değerleri bir Excel çalışma sayfasına aktarın. Hücre için ROI listesini kaydedin. Burada, 10 saatlik bir zaman atlamalı kayıttaki tek bir PSM hücresinden alınan temsili görüntüler gösterilmektedir.Burada kullanılan transgen, %10 fetal sığır serumu içeren L 15 medyumu ile standart görüntüleme koşulları altında, embriyodaki endojen gen ve proteinin üretim ve yıkım döngüsüyle benzer dinamiklere ve ekspresyon seviyelerine sahip bir raporcu üretir. PSM hücrelerinin iki ile yedi arasında pik üretebildiğini, ortalama ve standart sapmanın ise üç ± 1 pik olduğunu saptadık. Medyan pik sayısı ve %25 persentil iki pik, %75 persentil ise üç piktir.Yarı otomatik izleme ve analiz yöntemimizi kullanarak, bireysel PSM hücreleri için zamanla değişen floresan yoğunluğu izlerini hızlıca oluşturabiliriz. Bu ham izler daha sonra; frekans genliği, döngü sayısı ve pik zamanlaması gibi osile olan PSM hücrelerinin özelliklerinin kantitatif ölçümlerini yapmak için kullanılabilir. Bu prosedürü takiben, tek hücreli osilatörün embriyonun dışında bulunan faktörlere nasıl tepki verdiği sorusuna yanıt aramak amacıyla, sinyal moleküllerinin veya inhibitörlerin eklenmesi gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Bu tekniğin, segmentogenez alanındaki araştırmacıların, hücreleri hücre-hücre etkileşimlerinin ve doku düzeyindeki faktörlerin karmaşıklığından uzaklaştırarak, intakt embriyoda gerçekten çok zor olan segmentasyon saatinin tek hücre davranışını basit bir şekilde incelemesine olanak sağlayacağını umuyoruz.

generation-dispersed-presomitic-mesoderm-cell-cultures-for-imaging

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu videoda, biz gelişmekte olan omurgalı beyin konfokal mikroskobu ile tek bir hücre çözünürlükte canlı zebrafish embriyolar analiz edildiği bir yöntem gösteriyor. Bu, tek hücreli zebrafish embriyo enjekte ve daha sonra gelişmekte olan beyin montaj ve görüntü hangi yöntemi içerir.

Konfokal Mikroskop Zebra balığı Embriyonik Beyin Görüntüleme Canlı

Erken embriyo şekli morfogenetik süreçleri anlamanın anahtarı, yüksek çözünürlükte görüntü hücrelerinin yeteneği. Biz burada tüm zebrafish embriyolar membran hedefli Yeşil Floresan Protein hücrelerin tek hücreler veya küçük kümeler etiketleme için kullanılan bir tekniktir açıklar.

Zebra balığı Beyin Etiketleme ve Görüntüleme Hücreleri

Mevcut video, gelişmekte olan zebrafish önbeyin bireysel nöral progenitör hücrelerin canlı görüntüleme gerçekleştirmek için elektroporasyon ve konfokal mikroskopi kombinasyonu yararlanır bir yöntem gösteriyor.

Gelişmekte olan Zebra balığı önbeyin klonal olarak ilişkilidir Sinir Progenitör Hücreler Zaman atlamalı Canlı Görüntüleme

Bu protokol, zebra balığı embriyolarından tek hücreleri izole etmek, ilgilenilen hücreleri zenginleştirmek, mikroakışkan tabanlı tek hücreli multipleks sistemlerde zebra balığı hücrelerini yakalamak ve tek hücrelerden gen ekspresyonunu değerlendirmek için bir yöntemi tanımlar.

İzolasyon ve Zebra balığı Embriyolar gelen Tek Hücre Karakterizasyonu

Mitoz her canlı organizma için kritiktir ve kusurlar genellikle kansere ve gelişimsel bozukluklara yol açar. Araştırmacılar, bu görüntüleme protokolünü ve zebra balığını bir model sistem olarak kullanarak, canlı bir omurgalı organizmasında mitozu ve mitotik süreçler kusurlu olduğunda ortaya çıkan çok sayıda kusuru görselleştirebilirler.

Canlı Zebra balığı Embriyo Mitotik Bölümü ve Dinamikleri gözlemleme

Burada, normal gelişimi bozmadan canlı zebra balığı embriyolarının arka vücut gelişiminin uzun süreli hızlandırılmış görüntülemesine izin veren çok yönlü bir montaj yöntemi sunuyoruz.

Zebra balığı Kalkınma Uzun Süreli Görüntüleme için A yönlü Montaj Yöntemi

Lazer ile uzun dalga boyu çok foton Floresans uyarma mikroskobu tarama gelişmiş optik teknikleri bir arada Tg (sox10:EGFP) ve Tg (foxd3:GFP) Zebra balığı embriyo nöral crest göçün yüksek çözünürlüklü, üç boyutlu, gerçek zamanlı görüntüleme yakalamak için uygulanmıştır.

Geliştirme gerçek zamanlı olarak görselleştirmek için çoklu foton zaman atlamalı görüntüleme: nöral Crest hücrelerde geçirme Zebra balığı embriyo görselleştirme

Burada, omurgalı segmentasyonunun canlı çalışmasını sağlayan zebra balığı arka vücut ekseninin 3 boyutlu doku kültürü protokolünü sunuyoruz. Bu eksplant model eksen uzama, morfojen kaynaklarının değiştirilmesi ve hücre altı çözünürlük doku düzeyinde canlı görüntüleme üzerinde kontrol sağlar.

Zebra Balıklarında Omurgalı Segmentasyonunu İncelemek için 3-D Kuyruk Eksplant Kültürü

Bu protokol, zebra balığının erken göz gelişiminin toto etiketlemesi ve çok boyutlu görüntülenmesi için bir yaklaşımı açıklar. Lazer tarama konfokal mikroskopisi kullanarak etiketleme, gömme ve dört boyutlu (4D) görüntülemeyi ve optik bardak morfogenezinin diseksiyon mekanizmaları için veri kümelerinin alımını optimize etmek için dikkat edilmesi gereken noktaları açıklıyoruz.

Zebra Balığı Optik Kupası Morfogenezinin 4 Boyutlu Görüntülenmesi

Erken zebra balığı embriyolarının bir ışık tabakası mikroskobu kullanılarak bozulmamış bir koryon içinde görüntülenmesi için bir örnek hazırlama stratejisi açıklanmaktadır. Embriyoların %70 epiboli ve tomurcuk aşamalarında koryon içinde edindiği farklı yönelimleri analiz eder ve ışık tabakası sistemini kullanarak embriyo boyunca hücresel ölçekte çözünürlük elde etmek için görüntüleme stratejilerini detaylandırır.

Erken Zebra Balığı Embriyoları için Işık Levha Mikroskobu Görüntüleme ve Montaj Stratejileri

Öğrenin, transgenik Danio rerio embriyolarından presomitik mezoderm dokusunu disseke ederek tek hücreli segmentasyon saati salınımlarını uzun süreli görüntüleme yöntemini. Bu teknik, gelişimsel biyolojide gen ifadesi dinamiklerini gerçek zamanlı izlemeyi sağlar.

Tek Hücrelerde Zebra balığı Segmentasyon Clock Görüntüleme Dağınık Presomitic Mesoderm Hücre Kültürleri Üretimi

Daha fazla video keşfet