Travmatik Beyin Hasarı Sonrası Nöronlar veya gen ekspresyon analizi için Tek Nöron zenginleştirilmiştir Populasyonlarının Lazer Yakalama Mikrodisseksiyon

Bu prosedürün genel amacı, daha sonraki gen ekspresyon analizi için lazer yakalama mikrodiseksiyonu ile donmuş doku bölümlerinden zenginleştirilmiş hipokampal nöron popülasyonlarının ve tek nöronların nasıl elde edileceğini göstermektir. Bu, ilk anestezi odasında, bir sıçan olan anestezi ile gerçekleştirilir. Sıçan daha sonra entübe edilir, mekanik olarak havalandırılır ve sıçanı hazırlamak için stereotaksik bir kafa tutucusuna yerleştirilir Sıvı perküsyon beyin hasarı için bir kraniyotomi yapılır.

İkinci adım, sıvı perküsyon beyin hasarını uygulamaktır. Beynin daha sonraki koronal bölümleri bir kriyostat üzerinde kesilir ve dejenere nöronlar için bir belirteç olan fluro yardımı veya bir füze boyası olan gerçek menekşe ile boyanır. Son adım, lazer yakalama mikro diseksiyonu yapmak ve tek nöronları veya nöron havuzlarını toplamaktır.

Sonuç olarak, toplam RNA, yakalanan hücrelerden izole edilir, kalite açısından analiz edilir ve bir Agilent biyoanalizörü kullanılarak nicelleştirilir ve kantitatif gerçek zamanlı PCR ve yol odaklı veya genom çapında mikrodizi analizi gibi alt uygulamalarda kullanılır. Manuel mikro diseksiyon gibi mevcut yöntemlerin bu tekniğinin temel avantajı, zenginleştirilmiş nöron popülasyonları veya glia veya immünomodülatör hücreler gibi diğer beyin hücresi tipleri veya doku kesitlerinden tek nöronlar elde edebilmemizdir. Bu, beyindeki farklı tanımlanmış hücre tiplerinde ve çoklu hücre tiplerinden oluşan diğer heterojen dokularda gen ekspresyon analizi yapmamıza izin verir, Bu prosedürün kaçırılacağını göstermek.

Debbie Boone, laboratuvarımızda kıdemli bir araştırma görevlisi. Önce sıvı perküsyon, travmatik beyin hasarı veya sahte yaralanma olan sıçanlardan elde edilen beyin dokusunu eksi 80 santigrat derece dondurucudan alın ve eksi 22 santigrat dereceye aktarın. Beyin çözülürken beyni kesit sıcaklığına getirmek için 10 dakika kriyostat uygulayın.

Kriyostatı etanol içeren RNA zap ile silin ve fırçaları etanol ile temizleyin. 10 dakika geçtikten sonra, beyni tüpten çıkarın ve ventral tarafı yukarı bakacak şekilde kriyostat aşamasındaki bir gazlı bez üzerine yerleştirin, yeni bir tıraş bıçağı kullanın ve beynin arka kısmını çıkarmak için beyni dilimleyin. Sadece beyincik ve optik kiazmadaki ön kısma rostral.

Bir kriyo kalıbını OCT montaj ortamı ile doldurun ve beyni ön tarafı aşağı bakacak şekilde kalıba yerleştirin. Beyin dokusunun beyaza dönene kadar montaj ortamında donmasına izin verin. Bu işlem yaklaşık 10 dakika sürmelidir.

Şimdi örnek diski OCT ile beyin üzerinde dondurun. Ardından kalıbı çıkarın. Beyin takılıyken diski numune kafasına yerleştirin ve vidaları sıkın.

Bıçak tutucuya tek kullanımlık düşük profilli bir bıçak yerleştirin ve kolu aşağı doğru sıkın. OCT'nin dış tabakasını çıkarmak için beyni 20 mikronda dilimlemeye başlayın. Hipokampal bölgeye ulaşıldığında, mikron kadranını 10'a ayarlayın.

Bir cam slayt veya artı cam yerleştirerek koronal seri bölümleri toplayın. Doku bölümüne kaydırın. Slaytları, kesitleme tamamlanana kadar eksi 20 santigrat derecede RNA içermeyen bir boyama rafına yerleştirin.

Bölümleri boyamaya devam etmeden önce, tüm boyama kaplarını ve dereceli silindirleri ese ile silin ve mili Q suda durulayın. Tüm solüsyonların RNA içermeyen su ile hazırlandığından ve krestal menekşe ve floro yeşim lekesinin daha önce 0,2 mikronluk bir filtreden geçtiğinden emin olun. Thor beyin bölümlerini oda sıcaklığında 30 saniye kullanın ve bir dakika boyunca %75 etanol içinde sabitleyin.

Daha sonra, fiksasyondan sonra nöron alanlarının LCM'si için ya nöron alanlarının LCM'si ya da tek tek nöronların LCM'si için uygun karşı boyaya devam edin, slaytları bir dakika boyunca RNA'ların serbest suyunda durulayın, bir dakika boyunca% 1 kret menekşe ile boyayın. RNA'ların serbest suyunda bir dakika boyunca üç kez durulayın, her biri 30 saniye boyunca iki kez% 95 etanol ile dehidre edin. Daha sonra 30 saniye boyunca iki kez% 100 etanol ve her biri üç dakika boyunca iki kez ksilen .

Boyadıktan sonra, tüm bölümleri bir çeker ocakta 15 dakika kurutun ve ardından LCM'ye geçin. LCM gerçekleştirilir. Kızılötesi diyot lazerli bir P hücreli iki E mikroskobu kullanarak, önce merkez joystick'i dikey konuma ayarlayın.

Ardından Forex hedefini döndürün ve yerine kilitleyin. Mikroskop aşamasının ortasına lekeli hipokampal bölümleri olan bir slayt yerleştirin ve hipokampus bölgesi görünene kadar manuel olarak ayarlayın. Kursu kullanın ve odak ayarlamalarını bulun.

Bölümü odak noktasına getirmek için, kontrolördeki vakum düğmesine basarak vakumlu mandreni etkinleştirin. Ardından 10 x hedefi döndürün ve yerine kilitleyin. Rota ve ince ayarlamalarla tekrar odaklanın.

Makro LCM kapaklarınızın kapaklarını, kaset modülünüzün kapaklarına yerleştirin ve yük satırı konumuna bir kapak yerleştirin. Kapak yerleştirme kolunu döndürün ve kapağın etrafına yerleştirin. Ardından, kapaklarınızı kaset modülünden çıkarmak için kapak yerleştirme kolunu kaldırın.

Kapak yerleştirme kolunu sürgünün üzerinde döndürün ve ardından kapağı kızağın üzerine yerleştirmek için sürgünün üzerine indirin. İnce odağı ayarlayın ve hücrelerin kapaktaki siyah dairenin içinde olup olmadığını kontrol etmek için joystick'i hareket ettirin. Yakalanacak tüm hücreler bu siyah dairenin içinde olmalıdır.

Şimdi lazer parametrelerini ayarlayın. Önce denetleyicideki lazer etkinleştirme düğmesine basın. Lazer hedef noktası pembe olarak görünecektir.

bilgisayar monitörünün görüş alanında. Lazeri odaklamak için lazer nokta boyutunu küçük olarak ayarlayın ve optimum hücre yakalama için gerektiği gibi bir ila iki milisaniye boyunca gücü ve süreyi 65 ila 75 miliwatt olarak ayarlayın. Lazeri test etmek için, lazer noktasını alınacak hücre olmayan bir alana taşımak için joystick'i kullanın.

Başparmak anahtarını kullanarak lazeri ateşleyin. Ardından, lazer noktasını erimiş polimer noktasından uzaklaştırmak için joystick'i kullanın ve lazerin ateşlendiği net bir alanı çevreleyen görünür bir koyu halka olup olmadığını kontrol edin. Hücreleri yakalamak için, lazeri yakalamak ve ateşlemek üzere lazer noktasını hücre alanı üzerinde hareket ettirmek için joystick'i kullanın.

Başparmak anahtarını kullanarak, geniş bir hücre alanını yakalamak için lazeri ateşlerken joystick'i hareket ettirin. İlgilendiğiniz tüm hücreleri ateşledikten sonra, kapak yerleştirme kolunu kaldırın. Yakalanan hücreler doku bölümünden ayrılacak ve kapağa yapışacaktır.

Kapağınız, kalan doku ve eksik hücreler görüş alanında görünür olacaktır. Kapak üzerindeki hücreler, kapak slaydın boş bir kısmına yerleştirilerek de görüntülenebilir. Kapak yerleştirme kolunu kaldırın ve kapak boşaltma istasyonuna döndürün.

Kapağı istasyona indirin ve kapak yerleştirme kolunu önceki konumuna geri döndürün. Kapağı, yerleştirme aletinizi platform boyunca ve kapağın üzerine kaydırın. Aleti, kapak takılıyken platformdan kaldırın.

İstenmeyen dokuyu temizlemek için kapağı bir post-it notunun yapışkan kısmına hafifçe dokundurun. Kapağı, RN sulu mikro izolasyon kitinden elde edilen 100 mikrolitre lizis tamponu ile doldurulmuş 0.5 mililitrelik RNA içermeyen bir tüpe yerleştirin. Yalan söylemek için kapağı hemen 30 saniye boyunca döndürün.

Hücreler, numuneleri 42 santigrat derecede 30 dakika inkübe eder ve eksi 80 santigrat derecede RNA izolasyonuna kadar dondurur. Fiksasyondan sonra tek yaralı nöronların LCM'si için boyama prosedürü, nöron alanları için prosedüre benzer. Bununla birlikte, bazı inkübasyon süreleri farklıdır ve durulama ve dehidrasyondan önce dört dakika boyunca florür ile sürdürülen bölümler, boyamadan sonra ayrıntılar için protokolün metin kısmına bakın.

Yine çeker ocaktaki tüm bölümleri 15 dakika havayla kurutun. Tek hücreleri yakalamak için LCM'ye geçmeden önce, makro LCM kapağıyla aynı prosedürü kullanarak yakalama HS LCM kapaklarını kapağa veya kaset modülüne yükleyin. Yine, lazeri odaklamak için lazer nokta boyutunu küçük olarak ayarlayın, ancak bu sefer tek hücrelerin optimum hücre yakalaması için lazer gücünü ve süresini 0,45 ila 0,5 milisaniye boyunca 65 ila 75 miliwatt'a ayarlayın.

Kapak yerleştirme kolunu sürgünün üzerinde döndürün ve kolu kızağa doğru aşağı indirin. Kapağı kızağın üzerine yerleştirmek için, yakalama HS kapağı yüzeyi numuneden yüksekte oturur. LCM sırasında, lazeri tek Fluor yardımcı pozitif hücreler üzerinde hareket ettirmek için joystick'i kullanın.

Yakalanan tüm hücreler, kapaktaki küçük siyah halkanın içinde olmalı, başparmak anahtarını kullanarak lazeri ateşlemelidir. Siyah daire alanı içindeki tüm hücreler lazer kaldırma ile ateşlendiğinde, kapak yerleştirme kolu, yakalanan hücreler doku bölümünden ayrılacak ve yakalama hs kapağına yapışacaktır. Şimdi mikroskop tablasına başka bir slayt yerleştirin ve HS kapağı dolana kadar fluro aid pozitif hücreleri toplayın.

Daha sonra kapağı, eksi 80 santigrat derecede tekrar dondurmadan önce 40 ila 50 mikrolitre lizis, tampon ve girdap ve inkübatörlerle doldurulmuş 0,5 mililitrelik RNA içermeyen bir tüpe yerleştirin. Değilse, protokolün metin bölümündeki talimatlara göre hemen RNA izolasyonu gerçekleştirin. Aşağıdaki görüntüler, sıçan beyninin donmuş 10 mikron koronal bölümlerinden sıçan beyninden belirli hücre popülasyonlarının alanlarının lazer yakalama mikrodiseksiyonunu göstermektedir.

Bu protokole göre hazırlanmış ve krestal menekşe ve füze lekesi ile boyanmıştır. Bu görüntü, sıçan hipokampusunun ca bir ila ca üç alt alanından parametal nöronları göstermektedir. Burada, hipokampal dentat girustaki granül hücreleri yakalanmıştır.

Son olarak, üçüncü ventrikülün her iki yanında ve optik kiazmanın üzerinde bulunan bilateral supra kiazma çekirdeklerinden yakalanan nöron alanlarını gösteriyoruz. SCN, vücuttaki sirkadiyen ritimleri kontrol eden ana sirkadiyen saati içerir. Aşağıdaki görüntüler, sıçan hipokampusundan tek nöronların lazer yakalama mikrodiseksiyonunu göstermektedir.

Burada gösterilen dejenere florür pozitif hipokampal ca üç nöron, burada hayatta kalan fluro yardımı, negatif ca, üç nöron, LCM'den önce ve sonra gösterilmiştir, yakalanan hücreler LCM kapağında görselleştirilir. Aşağıdaki görüntüler, lazerle yakalanan nöronlardan izole edilen toplam RNA'nın gen ekspresyon analizini gösterdi. Bu görüntü, SCN'deki sirkadiyen saat gen ekspresyonunun kantitatif gerçek zamanlı PCR verilerini göstermektedir.

Ölmekte olan ve hayatta kalan hipokampal nöronlardaki gen ekspresyonunun bu ısı haritası, odaklanmış PCR dizileri kullanılarak apoptozla ilgili genlerin ekspresyon profilini gösterir. Son olarak, sahte yaralanma TBI veya TBI alan sıçanlardan alınan yaklaşık bir ila üç nöronda gen ekspresyonunun tüm genom KBB mikrodizi analizinden ve ayrıca nöronal nitrik oksit, sentaz veya glutatyon peroksidaz birinin ekspresyonunu yıkmak için tasarlanmış yaslanmış adeno-ilişkili bir siRNA virüsünden oluşturulan bir ısı haritası örneğini gösteriyoruz. her ikisi de beyin hasarının neden olduğu genlerdir Geliştirildikten sonra. Bu teknikler, belirli hücre popülasyonlarının genomik, proteomik ve metabolik profillemesini gerçekleştirmek için bu bozuklukların hayvan modellerini kullanan beyin hasarı ve kanser de dahil olmak üzere birçok araştırma alanındaki bilim adamlarının yolunu açtı.

Örneğin, şu anda bu teknikleri, bağımlılıkla ilgili olduğu bilinen prefrontal korteks ve nucleus accumbens beyin bölgelerinden belirli hücre popülasyonlarını lazerle yakalamak için kullanıyoruz.