Hücre Nüfus Analizler Cilt Karsinojenez sırasında

Bu prosedürün genel amacı, cilt kanseri bazal hücreli karsinomlarının fare modelinde hücre popülasyonu analizleri yapmaktır. Bu, ilk olarak farelerde hedef gen ekspresyonunun indüklenmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adımda, epidermis fare derisinden izole edilir.

Tek hücreli bir süspansiyon oluşturulduktan sonra, epidermal hücreler spesifik hücre servis belirteçleri ile etiketlenir. Sonuç olarak, derideki tümör gelişimi sırasında hücre popülasyonu değişiklikleri, akış sitometrik analizi ile izlenebilir. Kanser gelişimi birçok hücre tipini içeren bir süreçtir.

Bu prosedürün amacı, araştırmacının farklı hücrelerin cilt kanseri gelişimine nasıl katkıda bulunduğunu araştırmasına yardımcı olmaktır. Bu yöntem, cilt kanseri gelişimi sırasında hücresel etkileşimler hakkında bilgi sağlayabilir, ancak pankreas kanseri gibi diğer sistemlere de uygulanabilir. Görsel değerlendirme olmadan deneyin ne zaman sonlandırılması gerektiğini belirlemek zor olduğu için bu yöntemin görsel gösterimi kritik öneme sahiptir.

Başlamak için, ma keratin 14 Cree ER fareleri, Rosa 26 fareleri ile Rosa 26 fareleri olarak adlandırılan YFP etiketli mutant yumuşatılmış gen SMU M iki olarak adlandırılan SMU M olarak adlandırılır. Fare. Daha sonra, üç ila altı haftalık çift pozitif farelerden hasat edilen 0,5 santimetre uzunluğundaki kuyruk örneklerini, mililitre proteinaz K başına bir miligram ile doğrudan PCR kuyruk lizis çözeltisine daldırın. Ertesi gün, kalıntıları temizlemek için dokuyu bir mikro santrifüjde en yüksek hızda döndürün.

Daha sonra her bir hayvanı genotiplemek için, satıcı tarafından önerilen primerler ve koşullarla ayrı PCR reaksiyonlarında her numuneden bir mikrolitre SNAT kullanın. Hayvanlara tamoksifen uygulamak için kavisli 20 gauge bir besleme iğnesi kullanın. Keratinositlerde OO M iki ekspresyonunu indüklemek için art arda beş gün boyunca oral gavaj ile K 14 C er ve ROSA 26 için çift pozitif.

Genel olarak, fenotipler kulakta daha şiddetlidir ve hücre analizi için cildi toplamak üzere GFP etiketli K 14 OO farelerinin kuyruğu vardır. İlk olarak, ötenazi yapılan hayvanın kürkünü çıkarmak için bir titreme kullanın. Daha sonra fare derisini çıkarın ve dokuyu bir ila iki saat boyunca 37 santigrat derecede disbe solüsyonuna batırın.

Dispa tedavisinin ardından, epidermisi dermisten ayırmak için bir çift forseps kullanın. Şimdi epidermisi kıymak için bir makas kullanın. Daha sonra dokuyu 50 mililitrelik bir tüpte 37 santigrat derecede bir ila iki saat boyunca kollajenaz dört çözeltisine daldırın.

Hücreleri ayırmak için tüpü her 20 dakikada bir hafifçe döndürün. Kollajenaz ortamında tek hücreler tespit edilebildiğinde hücre ayrışmasını doğrulamak için bir mikroskop kullanın. Hücre verimini artırmak için numuneyi 30 dakika daha inkübe edin.

Daha sonra doku karışımını 70 mikronluk bir hücre süzgecinden süzün ve hücreleri 500 kez G ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca yıkayın, hücreleri etiketlemek için resüs ile başlar, yeni yıkanmış peleti PBS'de 2.5 kez FBS ile desteklenmiş PBS'de 2.5 kez 10 mililitre başına altı hücrenin 10'unda süspanse edin. Ardından, spesifik olmayan herhangi bir bağlanmayı engellemek için hücre çözeltisini 30 dakika boyunca buzun üzerine yerleştirin. Daha sonra, spesifik antikor etiketlemesi için hücrelerin alikotlarını 1.5 mililitrelik mikro tüplere aktarın.

Antikorların her tüpe mililitre başına iki mikrogramlık bir son konsantrasyonda eklenmesi. Antikorları hücrelerle karıştırmak için tüpleri birkaç saniye hafifçe girdaplayın ve ardından tüpleri 30 dakika daha buzun üzerine yerleştirin. Tüpleri bir mililitre PBS'de yıkadıktan sonra, peletleri PBS'de yeniden süspanse edin ve ardından mililitre başına bir miligramlık son konsantrasyonda DPI ekleyin.

Verileri analiz ederken, önce DABI pozitif ölü hücreleri hariç tutarak, ileri saçılma ve yan saçılma grafiğine göre tek hücreleri seçin. Fareler, bu görüntülerde görüldüğü gibi kirpi sinyalinin aktive edildiği durumlar dışında bazal hücreli karsinom geliştirmezler. Onkojenik pürüzsüzleştirilmiş pürüzsüz M iki YFP'nin tamoksifen kaynaklı ekspresyonu, bu hayvanlardan alınan deri h ve e lekeli örneklerde büyüme anatomik seviyesinde bile belirgin olan bir cilt fenotipi ile sonuçlanır.

K 14 SMU farelerinde deri tümörleri görülebilir. SMU M iki YFP indüksiyonu olmadan, hayvan derisi h ve e ile anormal morfoloji göstermedi. Bu nokta grafiklerinin boyanması, normal ve tümör taşıyan farelerde miyeloid hücrelerin temsili bir analizini gösterir.

CD 11 B pozitif GR bir pozitif hücreler, bazıları normal ve smu M olmayan iki YFP ile indüklenen farelerde miyeloid türevli baskılayıcı hücreler olan miyeloid hücrelerden türetilir. CD 11 B pozitif GR bir pozitif hücre popülasyonu zar zor tespit edilebilir, ancak inflamasyon veya tümör gelişimine yanıt olarak artar. K 14 SMU farelerinde.

Deride smu M iki YFP ve keratinositlerin indüklenmiş ekspresyonu, CD 11 B pozitif GR bir pozitif hücre popülasyonunda bir artışa neden olur. Bu teknik, cilt biyolojisi alanındaki araştırmacıların farelerde B hücreli hücreli karsinomun moleküler analizini yapmalarına izin verecektir.