Transgenik Balık Sağlam Beyin Tespit Edilen nöronlar Elektrik Aktivitesi Kayıt

Bu prosedürün genel amacı, bütün haldeki bir balık beyni preparasyonundaki nöronlardan elektriksel aktiviteler kaydetmektir. Bu işlem, öncelikle dört ila altı aylık transgenik meca balığının MS 2 22 içerisinde anesteziye alınması ve ardından beyninin diseke edilmesiyle gerçekleştirilir. Sonrasında, GFP ile işaretlenmiş ilgilenilen nöronlardan biri bir kayıt elektrodu ile temaslandırılır ve elektriksel aktiviteleri loose patch veya whole cell patch clamp elektrofizyolojisi ile kaydedilir.

Nihayetinde, sonuçlar sağlam beyindeki farklı işlemlere yanıt olarak aksiyon potansiyellerinin ateşleme frekansındaki değişiklikleri veya membran potansiyelindeki değişimleri gösterebilir. Bu tekniğin, hücre elektrofizyolojisi ve kültür veya beyin dilimi preparatları gibi mevcut yöntemlere karşı temel avantajı, sağlam nöral devrelerin bulunduğu bütün bir beyin preparasyonunda nöronların elektriksel özelliklerini karakterize edebilmemizdir. Bu ölçümler reprodüktif nöroendokrinoloji hakkında içgörü sağlasa da, motivasyon ve afektif davranışları kontrol eden nöronlar gibi diğer nöral sistemlere de uygulanabilir.

Bu gösterimde, GnRH üç nöronlarının genetik olarak GFP ile işaretlendiği transgenik zebra balıkları kullanılmaktadır. İşleme başlamak için, yetişkin bir zebra balığını 5 mL MS 222 içine daldırarak anestezi uygulayın. Solungaç hareketleri durduktan birkaç dakika sonra balığı, balık salini içeren 60 mm'lik bir Petri kabına aktarın. Ardından, makas kullanarak balığın başını anatomik olarak uygun bölgeden kesin.

Baş kısmını, yarısına kadar balık salini ile doldurulmuş ve yl guard ile kaplanmış 35 milimetre çapında bir Petri kabına aktarın. Kabın, başın dorsal tarafı yukarı bakacak şekilde yerleştirilip ince makaslar ve entomolojik iğnelerle sabitlenebileceği merkezi bir çukura sahip olması gerekir. Kafatasının dorsal kısmını çevre boyunca dikkatlice kesin.

Ardından, spinal kordun anterior kısmını da kapsayacak şekilde beynin dorsal kısmını açığa çıkararak kafatasını pensetle nazikçe kaldırın. Şimdi, spinal kordu ince uçlu pensetle yavaşça kaldırın ve ardından iki taraflı bağlantı sinirlerini ince uçlu makas kullanarak kesin. Bu işlem; kranial sinirlerin, spinal sinirlerin, ventral taraftaki optik sinirlerin ve anterior olfaktör sinirlerin kesilmesini içerir.

Tamamen diseke edilmiş beyni, taze balık salini ile doldurulmuş yeni bir Petri kabına koyun ve mikroskop altında inceleyin. Tüm beynin ve hipofiz bezinin sağlam olduğundan, kesilmediğinden veya delinmediğinden dikkatlice emin olun. Hasar görmüş beyinleri atın ve bir iğne kullanarak işleme yeniden başlayın.

Kayıt odasının merkezine siyanoakrilat gibi hızlı etkili bir yapıştırıcıdan küçük bir damla yerleştirin. Yapıştırıcı damlasını bir santimetrekarelik bir alana yayın. Ardından beyni hızlıca yapıştırıcının üzerine transfer edin.

Ventral tarafı yukarı gelecek şekilde sabitleyin. Şimdi, beyni kaplamak için kayıt odasını yaklaşık bir mililitre balık salini ile doldurun. İnce uçlu pens kullanarak, beynin kayıt alanının yüzeyi üzerindeki meningesleri öne doğru dikkatlice kaldırın.

Beyni, dakikada en az 200 µL hızla havalandırılmış balık salini ile sürekli olarak perfüze edin. Altı ila 10 mega ohm değerinde birkaç cam mikro elektrot hazırlayın ve bunları yaklaşık yarıya kadar loose patch kayıt çözeltisi ile doldurun. Soğutmalı bir CCD kameraya sahip dik bir floresan mikroskop kullanarak, 10x objektif ile başlayarak GFP eksprese eden terminal sinir gn RH üç nöronunu bulun.

Ardından 40 x objektife geçin ve sefalonun hemen önündeki olfaktör bulbların ventral yüzeyindeki veya yakınındaki nöronları bulun. Şimdi, mikroskoptan gerçek zamanlı görüntüler sağlayan bir video monitörüne geçin. Nöron kümesi sekiz ila 10 GnRH nöronu içerir.

Mikro elektrodu, elektrot ucu hedef nöronun üzerinde olacak şekilde kayıt odası banyosuna yerleştirin. Mikro elektrodun tıkanmaması için sabit ve hafif pozitif basınç uygulayın. Elektrot ucuyla hedef nörona yavaşça yaklaşın; bu sırada elektrot direncini Axo graft yazılımı ile kontrol edin ve izleyin.

Voltaj klempi modunda sızdırmazlık testi kullanıldığında, elektrodun ucu nöron yüzeyine temas ettiğinde elektrot direnci bu noktada hafifçe değişir. Gerektiği takdirde, düşük dirençli bir sızdırmazlık sağlamak için pozitif basıncı serbest bırakın ve hafif negatif basınç uygulayın. Kaliteli bir kayıt için en kritik adım temiz bir nöron kolu seçmektir; bu, elektrotlar ile hücre membranı arasında ideal bir sızdırmazlık oluşturmanıza yardımcı olur.

Şimdi akım kenetleme moduna geçin. Bir PowerLab programı olan Chart'ı açın ve herhangi bir akım girişi olmadan membran voltajını sürekli olarak kaydetmeye başlayın; gerekirse voltaj ölçeğini ve kayıt hızını ayarlayın, herhangi bir işlem uygulamadan önce normal balık salinindeki temel elektriklik aktivitesini yaklaşık beş dakika boyunca kaydedin. İlaçların, hormonların, peptitlerin vb. banyo perfüzyonu, dakika başına 200 µL akış hızında beyin preparasyonuna eklenmelidir.

Ardından, bir hücre tespit edildikten sonra yıkama işlemi için normal balık salini kullanın ve voltaj kenetleme modunda elektrot direncini kontrol edip izleyin. Elektrot ucunun nöron yüzeyinde olduğu ve elektrot direncinin hafifçe değiştiği durumda, pozitif basıncı serbest bırakın ve nöron üzerinde yüksek dirençli bir sızdırmazlık sağlamak için az miktarda negatif basınç uygulayın.

Hafif bir ağız vakumu uygulayın. Yamalanmış hücre membranını yırtın. Membran kırıldığında direnç anında yaklaşık 120 ila 250 mega ohm seviyesine düşecektir.

Şimdi akım klembi moduna geçin ve herhangi bir akım girişi olmadan, grafik kullanarak membran voltajını sürekli olarak kaydedin. Gerektiğinde voltaj ölçeğini ve kayıt hızını tekrar ayarlayın. Normal balık salin solüsyonunda yaklaşık beş dakika boyunca elektriksel aktivitenin bazal kaydını yaptıktan sonra, ardından bir yıkama dönemi gelecek şekilde işlemleri uygulayın. moca terminal sinir GNRH üç nöronlarının spontan elektriksel aktiviteleri akım klembi modunda kaydedilmiştir.

Tipik ateşleme hızı 0,5 ila altı hertz arasındadır. Aksiyon potansiyelleri genellikle oldukça düzenli bir interspike aralığı ile tonik veya vuruşlu bir paternle ateşlenir; interspike membran potansiyeli ortalaması yaklaşık eksi 48 millivolt civarındadır. Bu deneysel yaklaşım, yetişkin transjeniklerin ön beyninde yer alan GFP etiketli GNRH nöronlarından kayıt almakta da başarılıdır.

Transgenik zebra balıklarının çıkarılmış sağlam beyinlerindeki nöronal elektriksel aktivite, gevşek yama (loose patch) yöntemiyle DACA için tanımlananla benzer şekilde kaydedilmiştir. Aynı teknikler, tüm hücre kaydı (whole cell recording) imkanı da sağlamıştır.

Meca terminal sinir GnRH nöronlarının aksine, zebrafish GnRH nöronlarının pre-op alanı, ventral sefalon ve hipotalamustaki spontan aksiyon potansiyeli ateşleme örüntüsü genellikle düzensizdir. Bu teknik bir kez kavrandığında, uygun şekilde uygulandığında 15 dakikalık bir kayıt için bir saat içinde tamamlanabilir. İyi şanslar.