Fare Omurilik Koşullu Gen Manipülasyon için bir Viral Vector Stereotaksik Enjeksiyon

Bu prosedürün genel amacı, lomber dorsal boynuza stereotaktik olarak bir viral vektör enjekte ederek fare omuriliğinde uzamsal olarak kısıtlı gen ekspresyonunu elde etmektir. İşlemin ilk adımı bel omurunun yerini belirlemek ve ortaya çıkarmaktır. İkinci adım, omuriliği ortaya çıkarmak için omurun sırt kısmını çıkarmaktır.

Laminektomi adı verilen bir prosedür. Daha sonra, bir mikro şırınga pompasına bağlı bir cam pipet sırt boynuzunun üzerine yerleştirilir ve omuriliğe indirilir. Son adım, vektör süspansiyonunu yavaşça enjekte etmektir.

İki hafta sonra, dorsal boynuz nöronlarının transfeksiyonu, virüsün dağılımının izlenmesine izin veren yeşil floresan proteinin ekspresyonu ile gösterilir. Bu yöntem, duyusal yolun bir kısmındaki nöronların işlevini aydınlatmaya yardımcı olur. Özellikle inflamatuar veya nöropatik ağrı gelişimine odaklanan çalışmalarda kullanıyoruz.

Görsel gösterim, farenin stereotaktik çerçeveye nasıl yerleştirileceğini öğrenmek için kritik öneme sahiptir. İşlemin başarısı için omurganın düzgün bir şekilde sabitlenmesi esastır çünkü laminektomi çok hassas bir tekniktir. Laboratuvarımdan bir yüksek lisans öğrencisi olan Martin Mole, prosedürü gösterecek.

Bir araştırma görevlisi olan John Wang, prosedürden bir veya iki gün önce ona yardım edecek. Ameliyat günü 40 mikrometre uç çapı elde etmek için pul cam pipetler ve ucu 20 derecelik bir açıyla eğim verin. Cerrahi ekipmanı dezenfekte ederek ve stereotaksik çerçeveyi kurmak için steril cerrahi aletleri hazırlayarak işleme başlayın.

Mikro şırınga enjektörünü manipülatöre monte edin ve cihazı prize takın. Sıkıştırma bağlantısını kullanarak cam pipetlerden birini mikro şırıngaya takın. Şimdi pistonu mikro şırıngadan çıkarın.

Şırıngayı mineral yağ ile doldurun, ardından pistonu tekrar takın ve sonuna kadar itin. Dikkatlice herhangi bir hava kabarcığı oluşturmaktan kaçının. Ardından mikro şırıngayı enjektör üzerindeki tutucuya yerleştirin.

Daha sonra, virüsü dondurucudan çıkarın ve kullanmadan hemen önce steril fosfat tamponlu tuzlu su ile istenen partikül konsantrasyonuna seyrelterek virüs partikül süspansiyonunu hazırlayın. Beş mikrolitre virüs süspansiyonunu küçük bir parça param üzerine pipetleyin. Ardından cam pipet ucunu damlanın içine indirin ve mikro şırıngayı doldurmak için pistonu çekin.

Sonunda. Tıkanmasını önlemek için pipet ucunda küçük bir hava kabarcığı oluşturun. Bu adımda ısıtma yastığındaki tezgahı dezenfektan ile silerek ameliyat bölgesini hazırlayın.

Daha sonra fareyi flor inhalasyonu ile uyuşturun. Ardından, operasyon sırasında kurumasını önlemek için her bir göze kayganlaştırıcı uygulayın Daha sonra, kürkü sırtın alt kısmından farenin boynuna kadar tıraş edin. Cildi, klorheksidin veya povidon iyot ve% 70 etanol gibi topikal bir antiseptik mendilleriyle dezenfekte edin.

Daha sonra insizyon bölgesine% 0.25 bupivakain ile sızın, bir ila 10 oranında fizyolojik tuzlu su ile seyreltin. Daha sonra, göğüs kafesinin kıvrak ucundaki cildi, orta hat boyunca iki ila üç santimetre kesin ve omurgayı kaplayan fasyayı ayırın. Omurun üzerine yapışık olarak yerleştirilen, son kaburga çiftini tutan omur L one'ı tanımlayın ve sırt yüzeyine bağlı küçük omurga kaslarını ve bağlarını çıkararak onu açığa çıkarın.

Sonra omur L'yi bir çift ek ve forseps ile hafifçe kaldırın ve tutun. Daha sonra, omuriliği ortaya çıkarmak için spinöz süreç ve lamina dahil olmak üzere omurun dorsal kısmını çıkarmak için özel bir laminektomi forseps kullanın. Bu işlem sırasında dura mater'e veya omuriliğe zarar vermekten kaçının.

Ardından fareyi stereotaksik çerçevedeki bir ısıtma plakasına aktarın ve sonraki işlem sırasında farenin sıcaklığını izleyin. Şimdi omurgayı stabilize etmek için v çentik sivri uçlarını kullanın, böylece omurun nefes alma sırasında hareket etmemesi sağlanır. Ardından, pipet ucu laminektomi bölgesinin üzerinde olacak şekilde mikro şırıngayı yaklaştırın.

Pipetten çıkan virüs süspansiyonunu görene kadar pistonu indirin. Damlacığı steril gazlı bezle çıkarın. Ardından pipet ucunu açıkta kalan omuriliğin en rostral kısmına yerleştirin.

Pipeti arka medyan sulkusun üzerinde ortalayın ve ucu yanal olarak 500 mikrometre hareket ettirin. Bundan sonra, ucu kablonun yüzeyine indirin ve dura mater'i delin. Daha sonra, camın ucunu indirin, omuriliğe 300 mikrometre pipetleyin.

Dakikada 200 nanolitre hızında bir mikrolitre virüs süspansiyonu enjekte edin. Enjeksiyonun sonunda, pipeti yavaşça geri çekmeden önce en az iki dakika bekleyin. Viral vektörün L dört omurilik segmentinde tam dağılımını sağlamak için maruz kalan omuriliğin en üst kısmında enjeksiyon prosedürünü tekrarlayın.

İki enjeksiyon bölgesi rostral olarak bulunur ve L dört segmentine bağlanır. Enjeksiyonun serbest bırakılmasından sonra hedef bölgedeki doku hasarını önlemek için, V çentiğinden omur L bir tane kelepçelenir ve fareyi stereotaksik çerçeveden çıkarın. Ardından, fasyayı beş oh Vicryl ile dikin.

Kapalı fasya, laminektomi bölgesi için koruma sağlar. Daha sonra cildi naylon dikişler veya cerrahi zımbalarla kapatın. Kilogram başına beş miligramda günlük deri altı carprofen enjeksiyonları ile 72 saat boyunca cerrahi sonrası analjezi sağlayın.

Fareyi yumuşak, özel olmayan yatak takımlarına sahip bir kurtarma kafesine aktarın. Rahat nefes almak için fareyi yan tarafa yerleştirin. Ardından hayvanı tamamen uyanık olana kadar izleyin.

Ambulans ve içmeye başlar. İlk üç gün boyunca günlük muayene ile ameliyat sonrası iyileşmeyi izleyin. Ardından, deney tamamlanana kadar her gün veya haftada üç günde bir.

Ameliyattan yedi ila 10 gün sonra yara iyileşmesi tamamlandığında. Cilt dikişlerini veya zımbalarını çıkarın. Bu şekil, L dört omuriliğin sol dorsal boynuzunda gelişmiş yeşil floresan raportör proteinin veya EGFP'nin ekspresyonunu göstermektedir.

R-A-A-V-E-G-F-P nöronlarının stereotaksik enjeksiyonundan iki hafta sonra, kırmızı Ok Ucu ile gösterilen nöronal çekirdekler için immün leke yapıldı. Dorsal kolondaki dağınık transfekte edilmiş glial hücrelere işaret edin. Medial dorsal boynuzdaki nöronların yaklaşık% 80'i uygulama ile enfekte olmuştur.

İşlem 30 ila 40 dakika içinde tamamlanabilir ve lütfen işlem sırasında steril koşulları korumayı unutmayın. Bu videoyu izledikten sonra, fare omuriliğinin doz ho'suna intra çam kimal enjeksiyonlarının nasıl gerçekleştirileceğini iyi anlamış olmalısınız. Tekniği gen manipülasyonu için kullanıyoruz, ancak bunu intraspinal ilaç uygulaması gibi başka amaçlar için de uyarlayabilirsiniz.