Name: Katyonik lipozomlar üzeri özel siRNA tekrar teslim ile Fare Akciğerler Intersectin-1s uzun süreli suskunluğu. Elektron Mikroskobu ile demonte Etkilerinin Değerlendirilmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 55 s
Description: Keşfedin, fare akciğerlerinde ITSN-1s geninin uzun süreli susturulması için katyonik lipozom/siRNA kompleksleriyle retroorbital enjeksiyon yöntemini. Bu güvenli ve etkili teknik, gen terapisi araştırmalarında yenilikçi bir yaklaşım sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışma SP Sağlık Hibeler R01HL089462 Ulusal Enstitüsü tarafından desteklenmiştir.

1. Katyonik lipozomlar hazırlanması <ol><li> Lipososmes hazırlanması için kullanılmak üzere temiz bir yuvarlak-tabanlı bir şişeye otoklav. </li><li> Stok çözümleri hazırlayın: <ol class="lalpha"><li> - Küçük bir cam şişe kullanarak 10 ml kloroform içinde dimetil dioktadesil amonyum bromür (DOAB) 200 mg çözülür. </li><li> - Küçük bir cam şişe kullanılarak 10 ml kloroform içinde kolesterol 200 mg çözülür. </li><li> - Hazırlamak ve 100 ml RNA / DNA-az serbest damıtılmış su içinde% 5 glukoz otoklavda sterilize edilmesi için. </li></ol></li><li> Kloroform ile yuvarlak-tabanlı bir şişeye durulayın. Şişesi, girdap için 5-10 ml ekleyin ve birkaç dakika bekletin. Her zaman alüminyum folyo ile kaplı şişesi tutun. Şişesi kloroform boşaltın. </li><li> Lipozomların hazırlanması: <ol class="lalpha"><li> - Yuvarlak-tabanlı bir şişeye DOAB stok çözeltisi 315 ul ekleyin. </li><li> - Şişeye kolesterol stok çözeltisinden 200 ul ekleyin. </li><li> - Bir şişeye kloroform içinde 9.5 mlnd girdap tarafından karıştırın. </li></ol></li><li> 37 rotavaporda ayarlayın ° C, 100 dakikadaki dönüş (rpm) veya daha fazla (100-120 rpm). Rotavaporda doğru bir şekilde takılmış olan bir emiş borusu ile birlikte bir su vakum pompası kontrol bağlı olmalıdır. </li><li> Argon gazı tank ve rotavaporda bağlayın. </li><li> Rotavaporda için şişesi takın ve su banyosu içinde indirmeden önce en uygun ayarları yapın. Saat yönünün tersine çevirerek tamamen argon için ilk vanasını açın. Her zaman önce bu valf açıp kapatın. Ikinci valf şişeye üfleme argon basıncı kontrol eder. Basıncı her zaman nazik olmalıdır. </li><li> Tamamen sular altında olmadan su dokunun ve hız açmak için şişesi için yeterli, su banyosunda rotavaporda indirin. </li><li> 10 dk, tüm kloroform buharlaşır kadar bekleyin. Daha sonra makineyi durdurun. </li><li> Rotavaporda hızı ve argon tankı vanaları kapatın. Şimdi şişenin çıkarılmalıdır. </li><li> Th% 5 glikoz 2 mle şişesi lipidler çözmek için. </li><li> Iyice tüm lipidler çözmek için 1 ml pipet kullanarak balonun alt Scratch. Gerekirse çizilmemesi sonra, ikinci bir ucu, 1 ml ucundan balonun içine kalan lipid çıkarın. </li><li> Yavaş yavaş (15 rpm) balonun Vorteks 42 ° C su banyosu içinde, elde edilen çözelti inkübe edin. </li><li> Soğuk su ile sonikatör KDV doldurun. Zar zor su dokunmadan kaldırdı şişesi ve alt ile en az 20-30 dakika için çözüm sonikasyon. </li><li> Suya yuvarlak tabanlı, bu kez, sıfır hızda 42 ° C&#39;de 20 dakika C için rotavaporda su banyosunda şişeye ısıtın. </li><li> Bir 0.47 mikron ve daha sonra, 0.22 mikronluk şırınga filtreleri aracılığıyla lipozomlar filtre. </li><li> Küçük bir ekstrüzyon presini kullanarak, tek lamelli veziküller lipozom homojen bir popülasyon elde etmek için bir 50 nm zar içinden, lipozomların filtre. </li><li> Bir Eppendorf tüp lipozomlar aktarın ve buz üzerine yerleştirin. </li></ol><html> 2. Lipozomlar hazırlayın: siRNA-ITSN-1 Kompleksleri <ol><li> 2 mg / ml bir son konsantrasyona kadar 20 mM HEPES ve 150 mM sodyum klorür, pH 7.4 ihtiva eden tampon içinde siRNA ile ilgili hedef fare siRNA ITSN yeniden süspanse edin. Karıştırmadan önce buz üzerinde tutun. </li><li> 2 ug RNA (veya 400 nmol lipozomlar: 100 ug siRNA ITSN) 8 nmol lipozomlar oranında siRNA ITSN kompleksleri: lipozomlar hazırlayın. Bu çalışmada, bir RNA / DNA-az serbest Eppendorf tüpü kullanılarak taze hazırlanmış lipozomlar 100 ul stok çözeltisi (50 uM), ikinci siRNA ITSN 50 ul eklendi. Karışım 150 ul maksimum bir zamanda fare bilateral ve retro-orbital enjekte olabilir, çünkü siRNA ITSN konsantrasyonu çok önemli olduğu unutulmamalıdır. </li><li> Fareler enjekte beklerken buz karışımı tutun. </li></ol> 3. Fare Retro-yörünge Ven Enjeksiyon (Göz Soket İç Açı) jove_content &quot;&gt; Tüm fare deneyleri Rush Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu kurallarına uygun olarak onaylanmış ve yapıldı. <ol><li> 50 mg / kg vücut ağırlığı ketamin ve 5 mg / kg vücut ağırlığı ksilazin (ticari olarak temin edilebilen karışımı) intraperitonal enjeksiyonu ile fare anestezisi. Hayvanın yaşına ve ağırlığına bağlı olarak, anestezik madde hacmi ile konsantrasyonunun ayarlayın. Çalışmada kullanılan farelerin farenin 6-8 haftalık erkek fareler CD1, ve 25 gram civarında tartın. Şırınga, iğne takılı olan tüberkülin 1 ml türüdür. </li><li> Tek elle fare kulakları tutun ve gözün iç açısı ortaya çıkarmak için bir yan üzerinde fare kısın. Plika semilunaris için medial Amaç, göz küresi dokunmaktan kaçının. </li><li> Her üç eksende 45 derece açıda karışımı içeren şırınganın tutan gözün lakrimal karünkül Yaklaşım. </li><li> Yavaşça karışımı enjekte ve enjekte tarafı ile kurtarmak için fareyi sağlar. Bir büyük bir sıvıiğne yerde damlacık formları, şırınga geri iğne, emme damlacık geri çekin ve yeniden deneyin. Tekrarlanan enjeksiyonlar iyi mükemmel kurtarma sağlamak için, gözleri alternatif tarafından yapılır. Eğer emin değilseniz, bu teknik mavi boya (50 ul, metanol içinde% 0.5 kristal viyole) enjekte ve mavi damar gözlemlemek için fareyi akciğerler açığa tarafından kontrol edilebilir. </li><li> Bu çalışmada farelerin ölüm ya da yan etkisi olmadan 3 hafta boyunca her 3. gün enjekte edildi. </li></ol> 4. Biyokimyasal Araştırmalar Fare Akciğer Perfüzyon ve Doku Koleksiyon <ol start="0"><li> 1.5 mL / dk &#39;da çalıştırmak için peristaltik pompa ayarlayın. </li><li> Ventilatör, çalışma masası, alet, steril pamuklu, q-ipuçları, dizeleri, bardak, distile su, Hank dengeli tuz, izleyici: ayar hazırlayın. </li><li> Anestezik karışımı (100 mg / kg vücut ağırlığı ve ketamin 10 mg / kg vücut ağırlığı ksilazin) intraperitonal enjeksiyonu ile fare anestezisi. </li&gt; <li> Boyun düzeyinde, tükürük bezleri çıkarın ve trakea ortaya. </li><li> Laparotomi, tüketim diyafram ile başlayın, ve akciğer ve kalp açığa, torakotomi ile izleyin. </li><li> Timus çıkarın. </li><li> Daha iyi doğruluk için ışık mikroskobu kullanarak, pulmoner arter kateterize. </li><li> Trakeostomi yapın ve trakeostomaya kullanarak fare entübe. 150 vuruş / dak ve 150 ul atım hacmi bir oranı ventilatör ayarlayın. </li><li> Çıkış olarak, sol atrium açın. </li><li> Peristaltik pompa ve Hank çözeltisi kullanarak, 5 dakika boyunca kan serbest fare akciğer damar serpmek 37 ° C&#39;de ısıtıldı </li><li> Aynı akış hızında 10 dakika daha izleyici (8 nm altın albümin 16) serpmek. </li><li> Hank solüsyonu ile 5 dakika akciğer perfüzyon ile ilişkisiz izleyici yıkayın. </li><li> 0.1 BORU 10 dk% 4 perfüzyon (ağırlık / hacim) formaldehit,% 2.5 glutaraldehit ve% 1 tannik asit ile akciğerlerin yerinde tespitte ile izleyintampon maddesi, pH 7.2. </li><li> Akciğer toplayın, aşırı doku kaldırmak küçük bloklar (3/3 mm) kesilmiş ve sabitleştirici karışımı 2 ml içeren bir etiketli sintilasyon flakon koyun. </li></ol> Fareler işlem sırasında tamamen anestezi sona erecek. 5. EM için Fare Akciğer Doku İşleme <ol><li> Stok çözümleri hazırlayın: 1% Palade OsO 4, veronal asetat ve Kellenberger tampon. <ol class="lalpha"><li> -% 1 Palade-ogzo 4 tampon içerir: asetat, 1 ml veronal stoku, 1,25 ml% 4 OsO 4, en son hacim, 5 ml ile 1 ml 0.1 N hidroklorik asit ve damıtılmış su. </li><li> - Asetat veronal stok çözeltisi, 1.15 g sodyum asetat andydrous ve damıtılmış su, 100 ml barbital 2.94 g eritilmesi ile elde edilir. </li><li> -Kellenberger ve çözelti asetat veronal stok 2 ml 0.1 N hidroklorik asit, 0.05 gr uranil asetat 2.8 ml ve 5.1 ml&#39;dedamıtılmış su, pH değeri = 6. </li></ol></li><li> Kısaca 0.1 M sodyum kakodilat tamponu, pH = 7,4, 3 kez akciğer blokları yıkayın. </li><li> Oda sıcaklığında 1 saat boyunca 0.1 PIPES tampon, pH 7.2 &#39;de% 4 (ağırlık / hacim) formaldehitle numuneler saptamak,% 2.5 glutaraldehid. </li><li> Karanlıkta, buz üzerinde, kaputu 1 saat için 1% Palade-Osmium ile Post-düzeltmek. </li><li> Kellenberger tamponu ile bir kez yıkayın. </li><li> Oda sıcaklığında, gece boyunca 2 saat için Kellenberger ve tampon örnekleri inkübe edin. </li><li> % 50 etanol içinde bir kez yıkayın. </li><li> 70%, 95%, daha sonra 2 x 15 dakika,% 100 etanol: etanol kademeli serisi, 5 dakika / her biri kurutmak. </li><li> 100% propilen oksit, 2 x 15 dakika geçin. </li><li> Propilen oksit çıkarın ve oda sıcaklığında, bir tekerlek üzerinde dönen, bir gece inkübe, en az% 50 propilen oksit ve en az% 50 EPON 812 karışımı ekleyin. </li><li> Ertesi sabah, karışım çıkarın ve en az tekerlek üzerinde 4-5 saat taze EPON 812, ekleyin. </li><li> Dolu iki konik kalıpları kullanarak,taze% 100 EPON 812 ile yarım, seçilen örnekler ekleyebilir ve kenarlarına yerleştirin. </li><li> 60 ° C sıcaklıkta inkübatör kümesine kalıp hareket ve 48-72 saat tedavi sağlar. </li><li> Polimerize zaman, kesitli (kalın 60-70 nm) ince olmak blokları gönderin. </li></ol>

<ol><li>Predescu, S. A., Predescu, D. N., Knezevic, I., Klein, I. K., Malik, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intersectin-1s+regulates+the+mitochondrial+apoptotic+pathway+in+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Intersectin-1s regulates the mitochondrial apoptotic pathway in endothelial cells.</a> J. Biol. Chem. 282 (282), 17166-17178 (2007).</li>
<li>Uddin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cationic+lipids+used+in+non-viral+gene+delivery+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Molecular+Biology+Review%22%5BJournal%5D)">Cationic lipids used in non-viral gene delivery systems.</a> Biotechnology and Molecular Biology Review. 2 (2), 58-67 (2007).</li>
<li>Barenholz, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+lipid+composition+on+the+thermotropic+behavior+and+size+distribution+of+mixed+cationic+liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Colloid+Interface+Sci%22%5BJournal%5D)">Influence of lipid composition on the thermotropic behavior and size distribution of mixed cationic liposomes.</a> J. Colloid Interface Sci. (356), 46-53 (2011).</li>
<li>Predescu, D. N., Neamu, R., Bardita, C., Wang, M., Predescu, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+caveolae+function+and+upregulation+of+alternative+endocytic+pathways+induced+by+experimental+modulation+of+intersectin-1s+expression+in+mouse+lung+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Res.+Int.%22%5BJournal%5D)">Impaired caveolae function and upregulation of alternative endocytic pathways induced by experimental modulation of intersectin-1s expression in mouse lung endothelium.</a> Biochem. Res. Int.. (2012), 672705(2012).</li>
<li>Higuchi, Y., Kawakami, S., Hashida, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+for+in+vivo+delivery+of+siRNAs%3A+recent+progress%5BTitle%5D)+AND+%22BioDrugs%22%5BJournal%5D)">Strategies for in vivo delivery of siRNAs: recent progress.</a> BioDrugs. 24 (24), 195-205 (2010).</li>
<li>Caracciolo, G., Amenitsch, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cationic+liposome%2FDNA+complexes%3A+from+structure+to+interactions+with+cellular+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Cationic liposome/DNA complexes: from structure to interactions with cellular membranes.</a> Eur. Biophys. J. , (2012).</li>
<li>Barnier Quer, C., Elsharkawy, A., Romeijn, S., Kros, A., Jiskoot, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cationic+liposomes+as+adjuvants+for+influenza+hemagglutinin%3A+more+than+charge+alone%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Pharm.+Biopharm%22%5BJournal%5D)">Cationic liposomes as adjuvants for influenza hemagglutinin: more than charge alone.</a> Eur. J. Pharm. Biopharm. 81 (81), 294-302 (2012).</li>
<li>Rai, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liposomal+delivery+of+MicroRNA-7-expressing+plasmid+overcomes+epidermal+growth+factor+receptor+tyrosine+kinase+inhibitor-resistance+in+lung+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cancer+Ther%22%5BJournal%5D)">Liposomal delivery of MicroRNA-7-expressing plasmid overcomes epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor-resistance in lung cancer cells.</a> Mol. Cancer Ther. (10), 1720-1727 (2011).</li>
<li>McLean, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ-specific+endothelial+cell+uptake+of+cationic+liposome-DNA+complexes+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Organ-specific endothelial cell uptake of cationic liposome-DNA complexes in mice.</a> Am. J. Physiol. (273), H387-H404 (1997).</li>
<li>Soutschek, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+silencing+of+an+endogenous+gene+by+systemic+administration+of+modified+siRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Therapeutic silencing of an endogenous gene by systemic administration of modified siRNAs.</a> Nature. (432), 173-178 (2004).</li>
<li>Barenholz, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liposomes+enhance+bioremediation+of+oil-contaminated+soil%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Liposome+Res%22%5BJournal%5D)">Liposomes enhance bioremediation of oil-contaminated soil.</a> J. Liposome Res. (13), 1-8 (2003).</li>
<li>Zamboni, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liposomal%2C+nanoparticle%2C+and+conjugated+formulations+of+anticancer+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Liposomal, nanoparticle, and conjugated formulations of anticancer agents.</a> Clin. Cancer Res. (11), 8230-8234 (2005).</li>
<li>Newman, M. S., Colbern, G. T., Working, P. K., Engbers, C., Amantea, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+pharmacokinetics%2C+tissue+distribution%2C+and+therapeutic+effectiveness+of+cisplatin+encapsulated+in+long-circulating%2C+pegylated+liposomes+%28SPI-077%29+in+tumor-bearing+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Chemother+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Comparative pharmacokinetics, tissue distribution, and therapeutic effectiveness of cisplatin encapsulated in long-circulating, pegylated liposomes (SPI-077) in tumor-bearing mice.</a> Cancer Chemother Pharmacol. (43), 1-7 (1999).</li>
<li>Martino, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+siRNA+delivery+by+the+cationic+liposome+DOTAP+in+human+hematopoietic+stem+cells+differentiating+into+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Efficient siRNA delivery by the cationic liposome DOTAP in human hematopoietic stem cells differentiating into dendritic cells.</a> J. Biomed. Biotechnol. (2009), 410260(2009).</li>
<li>Zhang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+delivery+system+targeting+bone+formation+surfaces+to+facilitate+RNAi-based+anabolic+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">A delivery system targeting bone formation surfaces to facilitate RNAi-based anabolic therapy.</a> Nat. Med. 18 (18), 307-314 (2012).</li>
<li>Predescu, D., Palade, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmalemmal+vesicles+represent+the+large+pore+system+of+continuous+microvascular+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Plasmalemmal vesicles represent the large pore system of continuous microvascular endothelium.</a> Am. J. Physiol. (265), H725-H733 (1993).</li>
<li>Koh, T. W., Verstreken, P., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dap160%2Fintersectin+acts+as+a+stabilizing+scaffold+required+for+synaptic+development+and+vesicle+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Dap160/intersectin acts as a stabilizing scaffold required for synaptic development and vesicle endocytosis.</a> Neuron. (43), 193-205 (2004).</li>
<li>Miyawaki-Shimizu, K., et al. Lung Cell Mol. Physiol. (290), L405-L413 (2006).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Biz uzun vadeli özel siRNA / lipozom kompleksleri tekrar intravenöz (24 gün boyunca her 72 saat,) ile in vivo ITSN-1s yıkmak için bu yöntem geliştirdi diğerleri 9 ve bize 1, 18 tarafından yayınlanan önceki çalışmalara göre. Bu deneysel yaklaşım, verimli güvenli bir şekilde ve tekrar tekrar kullanılabilir ve kolayca akciğer endotel ve pulmoner dengesinin ilgi herhangi bir protein kodlayan bir genin katılımı incelemek için uzatılabilir. Tekrar siRNA / lipozomlar teslimat için bizimle tarafın...

Çıplak siRNA, hücre zarı nüfuz edemez negatif yüklü olan ve kandaki enzimler, doku ve hücreler tarafından kolayca düşer. Hatta kararlılığını iyileştirmek için son zamanlarda yapısal değişiklikler ile birlikte, tatbikattan sonra, hedef mahallinde siRNA birikim son derece düşüktür ve etkin bir hücre içi araç 5 gerektirir. Katyonik lipozomların içine alıcı ve enzimatik degradasyona 6 nükleik asitler koruyarak hücre içine DNA / RNA &#39;nın büyük parça aktarmak için potansiyeli olan güvenli bir nükleik asit taşıyıcı olarak ortaya çıkmıştır. Ayrıca, katyonik lipozomlar ve böylece kendiliğinden hücreleri 2 gen transferi teşvik, DNA / RNA ile etkileşime girer. Daha yakın zamanlarda lipozomlar, aşılar ve düşük molekül ağırlığına sahip ilaçların 7 teslim etmek için uygulanmıştır. Plazmid mikroRNA-7-ifade lipozomal akciğer kanser hücrelerinin 8 epidermal büyüme faktörü reseptör tirozin kinaz inhibitörü direnç üstesinden gelir. Hedeflerkenkompleksleri endotel bariyer çapraz ve interstisyumda 9 için extravasate olası değildir, çünkü, damar endotelyumu intravenöz yoldan gereklidir. Diğer organlara kıyasla, akciğer mikrovasküler gelen ECS büyük alımı ve heyecanla lenf düğümleri ve Peyer en yamalar 9 takip katyonik lipozom ve DNA / RNA kompleksleri, içselleştirmek. Retroorbital veya kuyruk ven enjeksiyon yoluyla siRNA kemirgen modellerinde intravenöz teslim hatta 50 mg / kg 10 gibi yüksek konsantrasyonlarda, zararsız kanıtlanmıştır. Literatürde katyonik lipozomlar kompozisyonu lipid formülasyonu ve eşit molar oranı 11, 12 esas olarak farklılık gösterir. , Aşı ya da anti-tümör tedavileri 13-15 teslim proteinlerin down-regulation/over-expression hedef olup, in vivo gen aktarımı için katyonik lipozomlar kullanarak potansiyel uygulamaların geniş bir dizi bulunmaktadır. Hatırlamak önemlidirDNA / RNA-hücre membran etkileşimi verimini oluşturulan kompleksleri ve membran lipidleri arasındaki kuplajı şeklinde düzenlenir olmasıdır. Bu, hedeflenen hücre membranı profillerine lipid bileşimin dikiş belirli bir hücre tipi 6 transfeksiyon yüksek oranda faydalı ve sonuç olabileceğini düşündürmektedir.

<table><tbody><tr><td>Dimetil Dioktadesil Amonyum Bromür (DOAB)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>D2779</td><td></td></tr><tr><td>LiposoFast stabilizatör (mini ekstruder)</td> <td>Avestin Inc.</td><td>LF-STB</td><td></td></tr><tr><td>Polikarbonat membran, 19 mm çap, 50 nm gözenekli</td><td>Avestin Inc.</td><td>LFM-50</td><td></td></tr><tr><td>Kolesterol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-8667</td><td></td></tr><tr><td>Kloroform</td><td>Mallinckrodt Kimyasalları</td><td>4432-04</td><td></td></tr><tr><td>Hank'in dengeli tuzları</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1387</td><td></td></tr><tr><td>Yuvarlak tabanlı şişe</td><td>Fisher Scientific</td><td>FHB-275-030X</td><td></td></tr><tr><td>Fare siRNAITSN - hedef </td><td>Dharmacon/ ThermoScientific</td><td>J-046912-11</td><td></td></tr><tr><td>Peristaltik pompa</td><td>Ismatec</td><td>REGLO-CDF dijital, RHOO pompa kafası</td><td></td></tr><tr><td>ile Vantilatör</td><td>Hugo Sachs Electronik</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Barbital</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B-0500</td><td></td></tr><tr><td>Uranil asetat</td><td>EM Sciences</td><td>22400</td><td></td></tr><tr><td>Epon812</td><td>EM Sciences</td><td>Üretici tarafından durduruldu</td><td></td></tr><tr><td>Propilen oksit</td><td>EM Sciences</td><td>20400</td><td></td></tr><tr><td>Gömme kalıpları</td><td>EM Sciences</td><td>69923-05</td><td></td></tr><tr><td>Tanik asit</td><td>EM Sciences</td><td>21710</td><td></td></tr><tr><td>8 nm altın albümin izleyici</td><td></td><td>Laboratuvarda in16</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Comments</td></tr><tr><td colspan="4">2 Avestin 1 ml ile donatılmıştır gaz geçirmez şırıngalar (kat. # LF-1)</td></tr><tr><td colspan="4">Pyrex, 100 ml</td></tr><tr><td colspan="4">Modifiye siRNA, in vivo<</td></tr><tr>td colspan="4">IDEX corp.'un bir parçası.</td></tr><tr><td colspan="4">D-79232 Mart, Almanya</td></tr><tr><td colspan="4">Embed812 ile değiştirildi, cat. # 14120</td></tr></tbody></table>

katyonik lipozomlar üzeri özel sirna tekrar teslim ile fare akciğerler intersectin-1s uzun süreli suskunluğu. elektron mikroskobu ile demonte etkilerinin değerlendirilmesi

Long-term Silencing of Intersectin-1s in Mouse Lungs by Repeated Delivery of a Specific siRNA via Cationic Liposomes. Evaluation of Knockdown Effects by Electron Microscopy

Önceki çalışmalar ITSN-1s (KD ITSN), akciğer damar geçirgenliği ve endotel hücreleri (EC) hayatta kalma, bağlı apoptotik hücre ölümü, ITSN-1s uzun süreli bir hücre kültür sistemi geliştirilmesinde önemli bir engel düzenleyen dahil bir endositik proteinin bu demonte gösterdi 1 inhibisyonu. Taşıyıcıları olarak katyonik lipozomlar kullanarak, ITSN-1 geni (siRNA ITSN) hedef siRNA sistemik yönetimi tarafından fare akciğerlerde ITSN-1s genin susturulması araştırdı. 2 üretmek için, tekrarlanan doz güvenli immünojen olmayan, toksik olmayan ve kolay: Katyonik lipozomlar siRNA teslimat için birçok avantaj sunar. Lipozomlar performans ve biyolojik aktivite bir kolesterol ve dimetil dioktadesil amonyum bromür kombinasyonu kullanarak boyutu, ücret, lipid kompozisyonu, istikrar, doz ve uygulama 3 yolu Burada, verimli ve elde edilmiştir fare akciğerlerde belirli KD ITSN bağlıdır. İntravenöz teslimatsiRNA ITSN bir / katyonik lipozom kompleksleri geçici ek 3 gün sonra kurtarıldı gün 3 de fare akciğerlerde ITSN-1s protein ve mRNA, yere serdi. Bir tekrarlanabilir güvenli taşıyıcı olarak katyonik lipozomlar yararlanarak, çalışma 24 gün daha uzatıldı. Bu nedenle, taze üretilen kompleksleri ile retro-orbital tedavi çalışma 4 boyunca sürekli KD ITSN uyaran, her 3 gün uygulandı. Çeşitli zaman noktalarında sonrası siRNA ITSN toplanan Fare dokularda akciğer endotel, kronik KD ITSN etkilerini değerlendirmek için elektron mikroskobu (EM) analizlerine maruz bırakıldı. Yüksek çözünürlüklü EM görüntüleme bize akciğer vasküler yatakta KDITSN neden olduğu morfolojik değişiklikleri değerlendirmek için izin ışık mikroskobu ile özellikleri olmayan saptanabilir, (endotel bariyer yani bozulması, caveolae sayısı ve alternatif ulaşım yollarının upregülasyonu azalma). Genel Bu bulgular bir zayıf olmakla birlikte baskı kurduEC fonksiyonu ve akciğer homeostazında ITSN-1s tant rolü, in vivo siRNA-lipozomlar teslim etkinliğini gösteren ise.

ITSN-1s protein ve mRNA düzeyleri Western Blot ve 4 gibi geleneksel ve kantitatif PCR ile siRNA ITSN doğumdan sonra birkaç zaman noktalarında takip edildi. ITSN siRNA ile muamele edilmiş fare akciğerlerinde ITSN-1s protein ve mRNA seviyeleri 21 gün boyunca ITSN-1s sürekli demonte döneminde kontrol referans ile yaklaşık% 75 daha düşüktü. ITSN-1s olmadan, Dynamin-2, plazma zarından caveolae ayrılması içinde ITSN-1s ve önemli bir oyuncu önemli bir etkileşim ortağı verimli endositik siteye i...

Farelerde katyonik liposomes/siRNA/ITSN-1s kompleksleri, 24 gün boyunca her 72 saatte tekrarlanan retroorbital enjeksiyonları, verimli% 75 oranında ITSN-1s mRNA ve protein ekspresyonu azaltarak fare akciğer mikrovasküler için siRNA dubleks teslim. Bu teknik, bir hayvan modelinde yüksek tekrarlanabilir, herhangi bir olumsuz etkisi yoktur ve ölümlerin önler.

Katyonik lipozomlar üzeri özel siRNA tekrar teslim ile Fare Akciğerler Intersectin-1s uzun süreli suskunluğu. Elektron Mikroskobu ile demonte Etkilerinin Değerlendirilmesi

Previous  studies showed that knockdown of ITSN-1s (KDITSN), an endocytic  protein involved in regulating lung vascular permeability and endothelial cells ...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, intersecting one s ekspresyonunun uzun süreli knockdown etkilerini fare akciğer yapısı ve fonksiyonu üzerinde değerlendirmektir. Bu, ikinci bir adım olarak fare akciğer vaskülaritesini hedeflemek için spesifik INA dubleks lipozom kompleksleri hazırlanarak gerçekleştirilir. Intersecting one S ekspresyonunun etkin inhibisyonunu sağlamak için INA lipozom kompleksleri retroorbital enjeksiyonla uygulanır ve bu işlem 24 gün boyunca her 72 saatte bir tekrarlanır.Ardından, intersectin 1 protein ve mRNA seviyelerini değerlendirmek ve akciğerlerin kapsamlı morfolojik analizlerini gerçekleştirmek amacıyla, enjekte edilen farelerin akciğer dokuları biyokimyasal analizler ve EM incelemeleri için örneklenir. Akciğer lizatlarının spesifik intersectin 1 antikorları ile western blot yöntemiyle analiz edilmesi ve Q-R-T-P-C-R analizleri sonucunda elde edilen veriler, 24 ardışık gün boyunca spesifik ve etkili bir intersectin 1 s susturulması (knockdown) olduğunu göstermektedir. Bu tekniğin rymers veya lentivirüsler gibi mevcut metodolojilere göre temel avantajı, iyonik lipozomların akciğer teslimatının tekrarlanabilir, güvenli, toksik olmayan ve akciğer endotelinde olduk

long-term-silencing-intersectin-1s-mouse-lungs-repeated-delivery

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Endoplazmik retikulum, protein biyogenezi ve kalsiyum homeostazında önemli bir rol oynar. Biz, bize Ca2 + kaçak kanal rolü ele almak ve kendi varsayılan düzenleyici mekanizmaların karakterize sağlayan deneysel bir sistem kurduk. Bu sistem siRNA aracılı gen susturulması ve canlı hücre Ca2 + görüntüleme içerir.

Canlı Hücre Kalsiyum Görüntüleme siRNA aracılığı ile gen susturma ile birlikte Ca tanımlar 2 + ER Membran Kaçak Kanallar ve Düzenleme Mekanizmaları

Bu rapor, kısa süreli hafif anestezi altında fare lumbar spinal kordda siRNA yerelleştirilmiş transfeksiyonu için intratekal iğne giriş basit ve hızlı bir yöntem açıklanır.

Farelerde Hızlı noninvaziv Lomber İntratekal enjeksiyon yoluyla Vivo siRNA&#39;nın Transfaksiyon ve Omurilik Gen demonte olarak

Bu protokolde, Amaxa Nucleofector 96 kuyulu Mekik Sistemini kullanarak murin makrofaj hücre hatlarını siRNA'larla verimli bir şekilde transfekte etmek, makrofajları lipopolisakkarit ile uyarmak ve inflamatuar sitokin üretimi üzerindeki etkileri izlemek için yöntemler açıklanmaktadır.

Fare Makrofagların yılında Doğuştan Bağışıklık Tepkisi Soruşturma RNA girişimi kullanma

Burada larvaları tarafından sindirilen RNA nano-tanecikleri / kitosan kullanımı yoluyla hastalık taşıyıcıları sivrisinek gen fonksiyonunun inhibe edilmesine müdahale için bir prosedür tarif eder.

Hastalık Vektör Sivrisinek Larva içinde Kitosan / Müdahale RNA Nanopartikül Aracılı gen susturma

MicroRNA'lar beyinde çok önemli roller oynar ve nöro-dejenerasyonu modellemek için potansiyel hedeflerdir. Bununla birlikte, miRNA'nın kısa uzunluğu ve beyin dokusunun erişilememesi nedeniyle miRNA seviyelerini bozmak zordur. Bu video, farelerde bir nöropeptit kullanarak antagomir tasarımı ve beyne özgü uygulama için bir yöntem sunmaktadır.

MiRNA Beyin Özgül demonte için Stereotaktik Injection Basit Alternatif

Burada, fare oosit mayoz mili montaj ve organizasyon değerlendirmek için immünoflüoresans analizi ile takip özgü siRNA aracılı mRNA tükenmesi için bir protokol mevcut. Bu protokol, transkript in vitro tükenmesi ve farklı mili ve / veya oositlerde MTOC ilişkili faktörler fonksiyonel değerlendirmesi için uygundur.

SiRNA aracılı susturma Mouse Oositlerinin içinde mayoz Mili Değerlendirmesi

Bu protokolün amacı, siRNA'nın BBB'yi geçmesini sağlamak için bir CNS dağıtım sistemi olarak nöro-hedefleme peptitli katyonik/anyonik lipozomları kullanmaktır.  siRNA gibi tedaviler için bir dağıtım sisteminin optimizasyonu, prion ve diğer nörodejeneratif hastalıklar için daha fazla tedavi seçeneğine izin verecektir.

Katyonik ve Anyonik lipozomlar kullanılarak merkezi sinir sistemine Terapötik siRNA teslimi

Doku özel mikroRNA inhibisyon mikroRNA alanında az gelişmiş bir teknolojidir. Burada, biz başarılı bir şekilde myoblast hücreleri miR-181 mikroRNA ailesinde kalp etkisizleştirmek için bir protokol tanımlamak. Nanovector teknoloji önemli vivo kardiyo özgü miR-181 aile inhibisyon gösteren sünger bir mikroRNA amacıyla kullanılabilir.

Vivo Nanovector teslim kalp özel mikroRNA-sünger

Biz polyethyleneimine (PEI) kullanarak bir yöntemi açıklamak-kaplı superparamagnetic demir oksit nano tanecikleri siRNA ile transfecting makrofajlar için. Bu nano tanecikleri siRNA makrofajlar vitro ve in vivo ve sessizlik hedef gen ekspresyonu için verimli bir şekilde teslim edebilirsiniz.

Polyethyleneimine kaplı demir oksit nano tanecikleri küçük müdahale RNA makrofajlar için teslim için bir araç olarak Vitro ve In Vivo

C2C12 miyoblastlarında küçük saç tokası (sh) RNA kullanarak hücre dışı matriks (ECM) proteinlerini kodlayan genleri yere sermek için bir protokol sağlıyoruz. ADAMTSL2'yi örnek olarak hedefleyerek, C2C12 miyoblastı sırasında mRNA, protein ve hücresel düzeydeki nakavt etkinliğinin doğrulanması ve miyotube farklılaşması na yönelik yöntemleri tanımlıyoruz.

C2C12 Myoblast Hücre Hattında Ki Ekstrasellüler Matriks Proteinlerini Kodlayan Genlerin Kararlı Nakavtı Küçük Saç Tokası (sh)RNA

Keşfedin, fare akciğerlerinde ITSN-1s geninin uzun süreli susturulması için katyonik lipozom/siRNA kompleksleriyle retroorbital enjeksiyon yöntemini. Bu güvenli ve etkili teknik, gen terapisi araştırmalarında yenilikçi bir yaklaşım sunar.

Katyonik lipozomlar üzeri özel siRNA tekrar teslim ile Fare Akciğerler Intersectin-1s uzun süreli suskunluğu. Elektron Mikroskobu ile demonte Etkilerinin Değerlendirilmesi (Video) | JoVE Journal

Katyonik lipozomlar üzeri özel siRNA tekrar teslim ile Fare Akciğerler Intersectin-1s uzun süreli suskunluğu. Elektron Mikroskobu ile demonte Etkilerinin Değerlendirilmesi

Daha fazla video keşfet