Katyonik lipozomlar üzeri özel siRNA tekrar teslim ile Fare Akciğerler Intersectin-1s uzun süreli suskunluğu. Elektron Mikroskobu ile demonte Etkilerinin Değerlendirilmesi

Aşağıdaki deneyin genel amacı, intersecting one s ekspresyonunun uzun süreli knockdown etkilerini fare akciğer yapısı ve fonksiyonu üzerinde değerlendirmektir. Bu, ikinci bir adım olarak fare akciğer vaskülaritesini hedeflemek için spesifik INA dubleks lipozom kompleksleri hazırlanarak gerçekleştirilir. Intersecting one S ekspresyonunun etkin inhibisyonunu sağlamak için INA lipozom kompleksleri retroorbital enjeksiyonla uygulanır ve bu işlem 24 gün boyunca her 72 saatte bir tekrarlanır.

Ardından, intersectin 1 protein ve mRNA seviyelerini değerlendirmek ve akciğerlerin kapsamlı morfolojik analizlerini gerçekleştirmek amacıyla, enjekte edilen farelerin akciğer dokuları biyokimyasal analizler ve EM incelemeleri için örneklenir. Akciğer lizatlarının spesifik intersectin 1 antikorları ile western blot yöntemiyle analiz edilmesi ve Q-R-T-P-C-R analizleri sonucunda elde edilen veriler, 24 ardışık gün boyunca spesifik ve etkili bir intersectin 1 s susturulması (knockdown) olduğunu göstermektedir. Bu tekniğin rymers veya lentivirüsler gibi mevcut metodolojilere göre temel avantajı, iyonik lipozomların akciğer teslimatının tekrarlanabilir, güvenli, toksik olmayan ve akciğer endotelinde oldukça etkili olmasıdır.

Bu yöntemle ilgili fikir, ilk olarak in vivo ortamda kesişen N aşağı etkilerini değerlendirmeye karar verdiğimizde ve diğer SRNA iletim yöntemleri işe yaramadığında ortaya çıktı. Onik lipozomlarını hazırlamak için, yuvarlak tabanlı bir balona 315 microliter dimetil diod desal amonyum bromür (veya DOAB) stok çözeltisi ekleyin, ardından 200 microliter kolesterol stok çözeltisi ve 9,5 milliliters chloroform ekleyip çalkalayarak karıştırın. Balonu, 37 degrees Celsius'ye ve dakikada 100 veya daha fazla rotasyona ayarlanmış roto-vapor cihazına bağlayın.

İlk argon valfini saat yönünde çevirerek tamamen açın. Bu valfi her zaman ilk olarak açın ve en son kapatın. İkinci valf, balona üflenen argon basıncını kontrol eder.

Hafif bir basınç sağlamak için hafifçe açın. Kuru buz, Argonne gaz tüpünü roto evaporatöre bağlayan tüp üzerinden damlamaya başladığında, roto evaporatörü, balon tamamen batmadan suyla temas edene kadar su banyosuna indirin. Hız ayarını 100 ila 120 RPM'e getirin. Balondaki tüm kloroform buharlaştığında cihazı durdurun.

Rotovapor'un hız ayar düğmesini sıfıra getirin ve argon tankı vanalarını kapatın. Balonu çıkarın. Lipidleri yeniden süspand etmek için balona 2 mL %5 glukoz solüsyonu ekleyin.

Bir mililitrelik pipet ucu kullanarak, tüm lipidleri çözmek için balonun dibini iyice kazıyın. Balonu yavaşça vorteksleyerek, elde edilen çözeltiyi 42 °C'lik bir su banyosunda bir saat boyunca inkübe edin. Balonu dik tutarak ve tabanı sonikasyon cihazındaki soğuk suya sadece hafifçe değecek şekilde, çözeltiyi en az 20 ila 30 dakika boyunca sonike edin.

Ardından, balonu roto vapor'un su banyosunda, yuvarlak taban suyun içine batırılmış şekilde, sıfır hızda 42 °C'de 20 dakika boyunca ısıtın. Lipozomları önce 0,47 µm'lik bir şırınga filtresinden, ardından 0,22 µm'lik bir şırınga filtresinden süzün. Homojen bir unilameller lipozom vezikül popülasyonu oluşturmak için lipozomları küçük bir ekstrüzyon cihazı kullanarak 50 nm'lik bir membrandan geçirin.

Lipozomları bir eppendorf tüpüne aktarın ve buz üzerine yerleştirin. Lipozomları, sekiz mol lipozoma iki mikrogram RNA oranında iRNA ITSN kompleksleri şeklinde hazırlayın. Bu örnekte, 50 µL I-A-I-T-S-N kullanılmıştır.

50 micromolar'lık bir stok çözeltiden, A-R-N-A-D-N-A içermeyen EOR tüpü kullanılarak yeni hazırlanmış 100 microliter lipozoma ekleme yapılır. Karışım, farelere enjekte edilene kadar buz üzerinde bekletilir. Bu çalışmada kullanılan fareler yaklaşık dört ila altı haftalık olup ağırlıkları yaklaşık 25 gramdır.

Enjeksiyondan önce, ayak parmağı sıkıştırma testi ile hayvanın tamamen anestezi altında olduğunu onaylayın. Kullanılan şırıngalar, iğnesi tek elle takılmış bir mililitrelik tüberküloz şırıngalarıdır. Fareyi kulaklarından tutun ve gözün iç köşesini açığa çıkarmak için fareyi yan tarafa doğru yatırın.

PIKA semi lunarların mediyaline odaklanın ve göz küresine dokunmaktan kaçının. Hazırlanmış şırınga ile gözün lakrimal karununa üç eksende 45 derecelik bir açıyla yaklaşın. Karışımı yavaşça enjekte edin, fareyi kafesine geri koyun ve enjekte edilen tarafla birlikte toparlanmasına izin verin.

Fare, 24 gün boyunca her 72 saatte bir ITSN1 genini hedefleyen siRNA ile tedavi edilir. Bu prosedüre başlamak için, çekilme refleksinin yokluğuyla farenin tamamen anestezi altında olduğunu doğrulayın. Laparotomi ile başlayın ve diyaframı çıkarın.

Ardından, akciğerleri ve kalbi açığa çıkaracak şekilde bir toraksotomi gerçekleştirin. Daha yüksek doğruluk için bir StereoZoom mikroskobu kullanarak timusu çıkarın. Pulmoner arteri kateterize edin.

Ardından, trakeostomi gerçekleştirin ve fareyi trakeal stoma üzerinden entübe edin. Ventilatörü dakikada 150 soluk hızına ve 150 µL soluk hacmine ayarlayın. Çıkış olarak, dakikada 1,5 mL hızında ayarlanmış bir peristaltik pompa ve 37 °C'ye ısıtılmış Hank's solüsyonu kullanarak sol atriumu açın.

Fare akciğer vaskülatürünü beş dakika boyunca kandan arındıracak şekilde perfüze edin, ardından 10 dakika boyunca izleyici (tracer) ile perfüzyon yapın. Bağlanmamış izleyiciyi yıkadıktan sonra, %4 formaldehit, %2,5 glutaraldehit ve %1 tannik asit ile 10 dakikalık perfüzyon uygulayarak akciğerlerin in situ fiksasyonunu gerçekleştirin. Akciğerleri toplayın ve fazla dokuyu uzaklaştırın.

Akciğerleri küçük bloklar halinde kesin ve iki mililitre fiksasyon karışımı içeren etiketli bir sintilasyon şişesine aktarın. Akciğer dokusunu elektron mikroskobisi için işlemeye başlamak üzere; öncelikle akciğer bloklarını 0.1 molar sodyum kate tamponu ile kısa süreli olarak üç kez yıkayın.

Ardından, örnekleri oda sıcaklığında bir saat boyunca 0,1 Pipee tamponu içerisinde %4 aldehit %2,5 glutaraldehit ile sabitleyin; ardından Callen burger tamponu ile bir kez duruladıktan sonra, çeker ocakta buz üzerinde bir saat boyunca %1 Pilate Osmiyum ile son sabitleme yapın. Örnekleri oda sıcaklığında iki saatten geceye kadar Callen burger tamponu içerisinde inkübe edin. Bir kez %50 etanol ile durulayın ve ardından dereceli etanol serileri ile dehidrasyon işlemini gerçekleştirin.

Beş dakika boyunca %70 etanol, beş dakika boyunca %95 etanol ve ardından iki kez 15'er dakika boyunca %100 Etanol ile işlem yapın. Bundan sonra, iki kez 15 dakikalık inkübasyon için %100 propilen oksite geçin.

Propilen oksidi uzaklaştırın ve %50 propilen oksit ile %50 epon karışımını ekleyin. Sekiz 12'yi oda sıcaklığında bir çark üzerinde döndürerek gece boyunca inkübe edin; ertesi sabah karışımı uzaklaştırıp taze epon ekleyin. Sekiz 12'yi çark üzerinde en az dört ila beş saat bekletin.

Seçilen örnekleri, yarıya kadar taze %100 Epon eight 12 ile doldurulmuş çift konik kalıplara yerleştirin. Örnekleri kenarlara konumlandırın, kalıpları 60 °C'lik bir inkübatöre taşıyın ve 48 ila 72 saat boyunca kürlenmeye bırakın. ITSN1s siRNA lipozom komplekslerinin tekrarlayan uygulamalarıyla ITSN1s ekspresyonunun 21 ardışık gün boyunca kronik olarak inhibe edilmesi, buradaki temsili sonuçlarda görüldüğü üzere fare akciğerlerinde önemli ölçüde daha düşük ITSN1 protein seviyelerine yol açar; tedavi edilmemiş bir kontrol grubundan ve tedavi edilen farelerden alınan akciğer lizatları, belirtilen siRNA teslimat sonrası çeşitli zaman noktalarında ITSN1 ve aktin karşıtı antikorlarla blotlanmıştır.

Temsili yüksek blot CL filmlerinin densitometrik analizi ve I TSN one s mRNA'sının kantitatif R-T-P-C-R sonuçları, I TSN one s siRNA lipozom kompleksleri ile yapılan işlemin fare akciğerlerinde I TSN one s proteinini etkili bir şekilde baskıladığını daha fazla doğrulamaktadır. Intersect in one seviyelerindeki düşüş, yetersiz endositoza ve endotelyal transport bozukluğuna yolayılarak interendotelyal bariyerin bozulmasına ve pulmoner ödeme neden olmaktadır. Akciğer dokusunun bu temsili elektron mikrografları, sekiz nanometre altın albümin partikülleri ile boyları boyunca işaretlenmiş açık interendotelyal bağlantıları veya IJ'leri göstermektedir.

Panel A1, panel A'nın bir büyütmesidir; ok uçları, aynı düzlemde birbirine yakın konumlanmış üç ila dört altın albümin partikülünü göstermektedir. Bu durum, IEJ'nin geniş açıklığının göstergesidir. Altın partikülleri ayrıca, panel A1 ve B'de oklarla belirtilen IJ'lerin abluminal çıkışlarıyla da ilişkilidir. Ayrıca, panel A'da yıldızla belirtilen sınırlı sayıdaki CVE A'ya ve perikapiler boşluğun genişlemesine dikkat ediniz; intersectin-1 ekspresyonunun akut aşağı düzenlenmesi, yetersiz endositozu telafi etmek için alternatif taşıma yollarının yukarı düzenlenmesine yol açmıştır.

Bu EM görüntüleri; A ve A panellerinde membranöz halkaları, B panelinde pleomorfik tübülleri ve C panelinde altın albüminin alımı ve taşınmasında aktif rol oynayan, tipik cve LA ile kaynaşmış genişlemiş endozomları göstermektedir. Ayrıca perivasküler boşluğun şiddetli dilatasyonu ve proteinöz ödem de gözlemlenmiştir. İntersektin 24 gün boyunca ekspresyonunun uzun süreli inhibisyonu, inter-endotelyal bariyer bütünlüğünü kısmen geri kazandırarak farelerde pulmoner ödemi azaltmıştır.

EM morfolojik çalışmaları, sekiz nanometrelik altın albümin izleyicinin bu zaman noktasında IEJ'yi geçemediğini ve bunun yerine ok ucuyla gösterilen bağlantının lüminal girişinde filtrasyon kalıntıları oluşturduğunu göstermiştir. Bununla birlikte, perivasküler boşlukların veya PVS'nin bazı genişlemeler ve hafif ödem sergilemesi, bağlantıların bu boyuttaki partiküllere geçirgen olmadığını, ancak plazma membranına yakın konumdaki sızıntılı çok veziküler gövdelerin veya MVB'lerin bazı iç küçük veziküllerinin sekiz nanometrelik altın albümin partikülleri ile işaretlendiğini düşündürmektedir. Bu tablo, kontrol ve eksiklik gösteren fare akciğer endotelindeki endositik trans sito yapıların sayısını göstermektedir.

Önemli bir bulgu, ITSN1 eksik fare akciğer endotelinde caveola sayısındaki azalmadır. Intersectin 1 ekspresyonunun kronik inhibisyonu, alternatif endositik yolların aktivasyonuna neden olmuş ve altın albumin partikülleri ile işaretlenen membranöz halkalar veya tübüller olan caveola sayısını kısmen artırmıştır. ITSN1 kronik eksik fare akciğer endotelinde bu sayı, kontrollerle karşılaştırıldığında 14 kat artış göstermiştir.

Bu prosedürün ardından, farklı hnic izleyicilerin transendotelyal taşınımını kantitatif olarak tahmin etmek amacıyla, fare akciğer lizatlarına uygulanan ELISA gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, ilgilenilen proteini susturmak ve işlevini değerlendirmek amacıyla, onic lipozom ve sRNA komplekslerinin fare akciğer endotelyumuna nasıl spesifik olarak iletileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.