Name: GST-His saflaştırma: Tam boy Saflaştırılmış Proteinler Verim iki aşamalı bir saflaştırma protokolü Affinity (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-29T17:50:00.000+00:00
Duration: 11 min 22 s
Description: Öğrenin GST-His etiketli proteinleri iki aşamalı afinite kromatografi ile saflaştırma yöntemini. SF9 böcek hücrelerinde rekombinant protein ifadesi ve yüksek saflıkta tam boy protein izolasyonu için etkili bir protokol.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz yönteminin gelişmesine yol açan tartışmalar için Anne-Marie Dion-Cote teşekkür ederim. JK ve RB FQNRT doktora alimler vardır, M.-MG Vanier CIHR âlimi, ve J.-YM bir FRSQ kıdemli araştırmacıdır. Bu çalışma, Fen Bilimleri ve JY Mühendislik Araştırma Konseyi fonları tarafından desteklenmiştir. M.

1.. Rekombinan bakulovirüslerin üretimi Bakulovirüsler esas olarak sadece hafif bir değişiklik ile, üreticinin protokolüne uygun olarak Invitrogen&#39;in Bac-to-Bac Baculovirus Expression System kullanılarak üretilir: <ol><li> Bir modifiye pFastBac1 vektörü (Gibco, yaşam) GST ve O&#39;nun etiketleri (Şekil 2) içeren oluşturuldu. PET-52b (+) vektörü (Novagen) multiklonlama bölgesine (MCS), bir 10xHis-etiketi ihtiva eden, pFastBac1-Strep-10xHis oluşturmak için bir pFastBac1 vektörünün MCS sokulmuştur. PET-52b (+) MCS dizisi 5 &#39;ucunda bir BglII kısıtlama sitesi&#39; ucu ve 3 &#39;bölgesinde bir Hind III sınırlandırma sitesi&#39; ucuna eklenmesi, Xbal ve HBLP kısıtlayıcı siteleri arasında amplifiye PCR oldu. PCR ürünü daha sonra BamHI ve BglII kısıtlama dizilerin uyumluluk kullanılarak BamHI ve Hindlll kısıtlama pFastBac1 sitesi arasında klonlandı. Amaç ifade sağlayan bir pFastBac1 oluşturmak için olduğu içinve streptavidin-10xHis etiketleri ile rekombinant protein, pET-52b (+) BamHI kısıtlama alanı MCS sekansı kullanılmadı. Ayrıca, Xbal kısıtlama alanı zaten pFastBac1 bir MCS ve pET-52b MCS ile eklenen, bu (+) &#39;de siteler arasında meydana gelen kısıtlama sitelerinin fazlalık önlemek için kullanılmamıştır. PreScisson Proteaz tanıma sitesi (LeuGluValLeuPheGln / GlyPro) ile GST kodlayıcı sekans daha sonra pFastBac1-Strep-10xHis içine sokulmuştur. PGEX-6P-2 (GE Healthcare) için GST cDNA sekansı PCR sırasıyla 5 de, Ncol ve Kpnl sınırlandırma bölgelerini içeren bir primer &#39;ve 3&#39; ekstremite ile büyütülmüştür. Ncol mevkisi bir başlangıç ​​kodonu ve buna ek olarak değil, aynı zamanda bir GST Alanin sağlar. PCR ürünü daha sonra streptavidin-etiketinin silinmesi ile sonuçlanan, Ncol ve Kpnl kısıtlama siteleri arasında pFastBac1-Strep-10xHis klonlanmıştır. Bu şekilde elde edilen yeni bir füzyon vektörü pFastBac1-GST-10xHis seçildi. </li><li> Pr için cDNA kodlama CloneGST (N-terminal) ve His-etiketi (C-ucu) arasındaki pFastBac-GST-10xHis vektörü içine ilgi otein. C-terminal His-tag ile füzyon izin vermek için cDNA durdurma kodonunu ortadan kaldırmak için dikkat edin. </li><li> E. Transform (Adım 1.2 &#39;de elde edilmiştir) rekombinant pFastBac ile coli DH10Bac bacmid üretir. Koloniler Bluo-gal ve IPTG (10 ug / ml tetrasiklin, 50 ug / ml kanamisin, 7 ug / ml gentamisin, 100 ug / ml Bluo-ihtiva-eden seçme plakaları üzerinde 30 ° C &#39;de 37 ° C ve birkaç saat gece boyunca büyümeye izin verin Gal, 40 ug / ml IPTG). </li><li> Seçim ve beyaz fenotip onaylamak için seçme plakaları üzerinde (adım 1.3) 2 beyaz koloniler restreak. </li><li> 10 ug / ml tetrasiklin, 50 ug / ml kanamisin, 10 ug / ml gentamisin aşama 1.4 &#39;dan iki beyaz koloniler ile ve bunların 37 ° C de bir gece boyunca çalkalama altında (250 rpm) büyümesine izin ihtiva eden LB içinde 2 ml inoküle </li><li> Bacmid DNA&#39;yı saflaştırmak amacıyla, aşama 1.5 bakterileri peletçözeltisi 300 ul I hücreleri tekrar süspansiyon ve çözelti II 300 ul (Qiagen&#39;den Maksiprep kit) ekleyin. , Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca inkübe 3 M KOAc, pH 5.5 içinde 300 ul ekleyin ve buz üzerinde 10 dakika inkübe edilir. 4 ° C, 10 dakika boyunca yüksek hızda örnekleri santrifüj. Yüzer için izopropanol 800 ul eklenir ve buz üzerinde 10 dakika inkübe edilir. 4 ° C&#39;de 15 dakika boyunca santrifüj örnekleri ve% 70 etanol içinde 500 ul ile pelet yıkayın. Pelet kuruması ve Tris-EDTA pH 8.0, 40 ul steril koşullar altında yeniden süspanse edin. Bacmid DNA, 4 ° C &#39;de muhafaza edilmelidir </li><li> Üreticinin protokolünde tarif edildiği gibi baculovirüsler oluşturmak. Bakulovirüsler ışıksız bir ortamda 4 ° C&#39;de saklanabilir. </li></ol> 2. Rekombinant Protein Expression <ol><li> Arıtma için en verimli bakülovirüsü seçmek ve protein ifade zirve ulaşıldığında ne zaman izlemek için bir mini-enfeksiyon deneyi a gerçekleştirmeks aşağıdaki gibidir: 2 Sf9 x 10 7 bakulovirüsün 133 ul (1/150) ile (% 10 FBS ve% 1 P / S ile tamamlanır) Grace ortam içinde 27 ° C &#39;de kültür hücreleri enfekte Infect. 0, 24, 48, 1.5 ml&#39;lik alikotları toplamak ve 72 saat post-enfeksiyon. Pelet hücreleri ve anti-tag antikoru kullanılarak western blotting ile, ilgi konusu proteinin ekspresyonu düzeyini analiz. </li><li> Virüs ve ortam arasında 1/150 oranı ile bir ortamın 500 ml, ml başına 1.0 x 10 6 Sf9 hücrelerini içeren bir değer değiştirici enfekte etmek için aşama 2.1 &#39;den en verimli bakulovirüs kullanın. Enfekte olan hücreler, 27 ° C &#39;de süspansiyon içinde büyümeye ve en yüksek protein ekspresyon (yukarıdaki aşama 2.1&#39; de tespit edildiği üzere) ulaşıldığında hücreleri hasat olsun. Tanelenmiş hücreler daha fazla kullanıma kadar -80 ° C&#39;de muhafaza edilebilir. </li></ol> 3. Çözünür hücre lisatı hazırlanması Aşağıdaki kuluçka adımlarının tüm hafif dönme altında 4 ° C&#39;de gerçekleştirilmektedir. <ol><li> Lyse SGST bağlayıcı tampon (150 mM NaCl, 1 mM EDTA,% 0.05 Triton-X-100, 1 mM 250 mM NaCI nihai konsantrasyon için PBS1X de DTT ve proteaz inhibitör ~ 20 ml ilgi proteini eksprese eden hücreler f9 kokteyli (Roche). bir buzlu su banyosu içinde, bir Dounce homojenleştirici, sonikasyon 3x 30 saniye her biri (% 70 üretim) ile çözeltinin Dounce 20x ve 20x yeniden Dounce. </li><li> (İsteğe bağlı). DNA ya da RNA kontaminasyonu çıkarmak için 4 ° C&#39;de 30 dakika boyunca 1 mM MgCI2 ve 7 nükleaz (2.5 U / ml) benzonaz toplam hücre lizatı inkübe edin. </li><li> 4 ° C&#39;de 30 dakika boyunca 18,000 rpm&#39;de santrifüje Süpernatant tutun. </li><li> (İsteğe bağlı). Santrifüj süpernatan tekrar 4 ° C&#39;de 18,000 rpm&#39;de 30 dakika boyunca berrak lizat çözünür alır. Tıkanmasını önlemek için, 0.2 ya da 0.45 um&#39;lik bir filtreden süpernatantı geçirir. </li></ol> 4. GST Boncuk Protein bağlanması <ol><li> GST boncuk 1 ml Çözünür hücre lisatı inkübe (iki kez yıkanmışGST 10 mi yumuşak döndürülerek 4 ° C&#39;de 1 saat boyunca tamponu) bağlayıcı. </li></ol> Yorum: Kuluçka süresi, proteinin stabilite ve bağlanma verimliliği göre optimize edilmesi gerekmektedir. <ol start="2"><li> Hızlı 700 rpm&#39;de spin ve ilişkisiz proteinleri içeren süpernatant kaldırmak (bu daha fazla analiz için muhafaza edilebilir). GST Yıkama tamponu ile GST-bağlı protein (Şekil 3B, şerit 1) yıkayın (GST 350 mM NaCl finali ile bağlama tamponu). </li><li> Adımı tekrarlayın 4.2 2x. Son yıkamadan olarak, mümkün olduğu kadar supernatant çıkarın. </li><li> Isı-şok proteinleri 8 arasında spesifik olmayan bağlanmanın olmaması için 4 ° C&#39;de 1 saat boyunca (10 mi GST bağlama tamponu içinde) 5 mM ATP ve 15 mM MgCl2 ile boncuk inkübe edin. GST yıkama tamponu ile boncuk üç kez yıkayın. </li></ol> 5. GST PreScisson Dilinim <ol><li> GST boncuk santrifüj, süpernatant kaldırmak ve P5 buf ile GST boncuk yıkayınfer (50 mM NaHPO 4 pH 7.0, 500 mM NaCl,% 10 gliserol,% 0.05 Triton-X-100, 5 mM imidazol). </li><li> 3 saat için gece boyunca 4 ° C den P5 tamponu PreScisson enzimi ile GST-boncuk inkübe (100 ul fraksiyon olarak GST boncuk bölün ve P5 tampon 100 ul seyreltilmiş enzim, 4-8 adet (2-4 ul) ekleyin.) </li></ol> Yorum: PreScisson aşamasının Kuluçka süresi molekül ağırlığı hem de protein kararlılığına göre optimize edilmesi gerekmektedir. Bozunma görülmektedir, bu, bir gece boyunca inkübasyon süresi, 2 saat içinde en az yerine göre azaltılabilir. <ol start="3"><li> Hızlı spin ve süpernatant toplamak. P5 100 ul ekleyerek sonra bu adımı iki kez tekrarlayın boncuklara tampon ve tüm kısımlar (Şekil 3B, şerit 2) havuz. </li></ol> Yorum: Kalan boncuklar bölünme etkinliğinin analizi için kullanılabilir (Şekil 3B </strong&gt;, şerit 3). Genellikle, proteinin% 70-80 bölünmektedir. 6. Protein bağlayıcı TALON Metal Afinite Reçine&#39;ye <ol><li> 1 ml&#39;lik fraksiyonlar halinde 3 yukarıdan elüsyon bölün ve döndürme altında 1 saat boyunca (P5 tamponu ile iki kez yıkanmış) 100 ul Talon metal afinite reçinesi ile kuru boncuk her inkübe edin. </li></ol> Yorum: Bir çok paylarda elüsyon bölme bağlayıcı / yıkama verimliliği artırır. <ol start="2"><li> P30 tamponu (30 mM imidazol, son konsantrasyon ile P5 tamponu) ile reçine 5 dakika yıkanır. </li><li> Adımı 6.2 2x tekrarlayın ve tek bir tüp içinde boncuk havuzu. Son yıkamadan önce, mümkün olduğu kadar supernatant çıkarın. </li></ol> Yorum: Bu TALON bağlı numune (Şekil 3B, şerit 4) karşılık gelmektedir. 7. Saflaştırılmış Protein elüsyonu <ol><li> P5 ile birlikte dönüş altında 5 dakika için protein bağlı TALON reçine inkübe00 tampon maddesi (500 mM imidazol, son konsantrasyon ile P5 tamponu). Tampon ve 01:01 h / h arasında boncuklar arasında bir oranı kullanarak (Eğer kuru boncuk 200 ul almıştı Örneğin, siz P500 200 ul eklemek gerekir). Bu adımı iki kez tekrarlayın ve ayrı ayrı her akıtılan kısmını tutmak (; Şekil 3B, 5-7 kuşak), yıkama 1 (E1) adında yıkama 2 (E2 ve elüsyon 3 (E3)). </li></ol> Yorum: Kalan boncuk elüsyon verimi (Şekil 3B, şerit 8) analizi için kullanılabilir. Tipik haliyle, proteinin% 60-80 toplam akıtılır. <ol start="2"><li> Coomassie mavisi (Şekil 3B) veya görüntüleme için SYPRO protein boyası ile bir SDS-PAGE ve leke üzerinde standart BSA konsantrasyonu her fraksiyonun yaklaşık 20-40 ul yükleme göre saflaştırılmış protein miktarını ve kalitesini analiz edin. </li></ol> Yorum: İlgilenilen proteini aynı zamanda bir uçtan bir uca tespit edilebiliranti-GST ve anti-His antikorları (Şekil 3C) kullanılarak saflaştırma prosedürü hayatları boyunca. 8. Saflaştırılmış proteinin depolanması <ol><li> 4 ° C sıcaklıkta, uygun bir saklama tamponu ile saflaştırılmış proteinin (örneğin 20 mM Tris asetat pH 8.0, 200 mM KAc,% 10 gliserol, 1 mM EDTA, 0.5 mM DTT) Dialyze Bu, diyaliz sırasında, saflaştırılmış proteinin çökeltilmesi için kontrol etmek önemlidir. Genellikle çalkalama döndürme altında 4 ° C&#39;de 1 saat boyunca 2x dialyze. </li><li> Saflaştırılmış protein (10-20 ul) az miktar yapın ve 30 dakika boyunca kuru buz üzerinde dondurma. -80 ° C&#39;de alikotları saklamak ve birçok çözülme / donma döngüleri kaçının. </li></ol>

<ol><li>Lichty, J. J., Malecki, J. L., Agnew, H. D., Michelson-Horowitz, D. J., Tan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+affinity+tags+for+protein+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expr.+Purif%22%5BJournal%5D)">Comparison of affinity tags for protein purification.</a> Protein Expr. Purif. 41, 98-105 (2005).</li>
<li>Thain, A., Gaston, K., Jenkins, O., Clarke, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+the+separation+of+GST+fusion+proteins+from+co-purifying+GroEL%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">A method for the separation of GST fusion proteins from co-purifying GroEL.</a> Trends Genet. 12, 209-210 (1996).</li>
<li>Carr, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+a+recombinant+form+of+the+V+antigen+of+Yersinia+pestis%2C+using+three+different+expression+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Expression of a recombinant form of the V antigen of Yersinia pestis, using three different expression systems.</a> Vaccine. 18, 153-159 (1999).</li>
<li>Armisen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+adsorption+of+poly-His+tagged+glutaryl+acylase+on+tailor-made+metal+chelate+supports%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+A%22%5BJournal%5D)">Selective adsorption of poly-His tagged glutaryl acylase on tailor-made metal chelate supports.</a> J. Chromatogr. A. 848, 61-70 (1999).</li>
<li>Kuhn, S., Zipfel, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+baculovirus+expression+vector+pBSV-8His+directs+secretion+of+histidine-tagged+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">The baculovirus expression vector pBSV-8His directs secretion of histidine-tagged proteins.</a> Gene. 162, 225-229 (1995).</li>
<li>Buisson, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooperation+of+breast+cancer+proteins+PALB2+and+piccolo+BRCA2+in+stimulating+homologous+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cooperation of breast cancer proteins PALB2 and piccolo BRCA2 in stimulating homologous recombination.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 17, 1247-1254 (2010).</li>
<li>Filimonova, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isoforms+of+Serratia+marcescens+nuclease.+The+role+of+Mg2%2B+in+the+hydrolysis+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Isoforms of Serratia marcescens nuclease. The role of Mg2+ in the hydrolysis mechanism.</a> Biochemistry. 62, 983-988 (1997).</li>
<li>Thorslund, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+breast+cancer+tumor+suppressor+BRCA2+promotes+the+specific+targeting+of+RAD51+to+single-stranded+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The breast cancer tumor suppressor BRCA2 promotes the specific targeting of RAD51 to single-stranded DNA.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 17, 1263-1265 (2010).</li>
<li>Genois, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+BRCA2+and+RAD51+for+promoting+homologous+recombination+in+Leishmania+infantum%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Interactions between BRCA2 and RAD51 for promoting homologous recombination in Leishmania infantum.</a> Nucleic Acids Res. 40, 6570-6584 (2012).</li>
<li>Shrestha, B., Smee, C., Gileadi, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Baculovirus+expression+vector+system%3A+an+emerging+host+for+high-throughput+eukaryotic+protein+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Baculovirus expression vector system: an emerging host for high-throughput eukaryotic protein expression.</a> Methods Mol. Biol. 439, 269-289 (2008).</li>
</ol>

Burada sunulan GST-His rekombinant proteinlerin saflaştırma protokolü boyutları geniş bir aralığının saflaştırılması için uygundur: başarıyla Li Rad51 (41kDa), piBRCA2 (120kDa), PALB2 (130kDa) ve dengesiz yüksek molekül ağırlıklı protein saflaştırılmış Leishmania infantum: Li BRCA2 (125kDa) 6,9. Ayrıca, bu protokol ile saflaştırılmış proteinler 6 biyokimyasal aktif edildi. Bu yöntemin başarısı, sadece arzu edilen protein ekspresyon, çözünürlük ve stabilite bağlıdır. <p class="...

Rekombinant proteinlerin saflaştırılması biyokimya temel soruları için önemlidir. Iyon değişim kromatografisi ve boyut dışlama kromatografisi gibi protein saflaştırma geleneksel yollar olduğu, örneğin izoelektrik noktası ve ücret ya da boyutu gibi hedef proteinin fiziksel özelliklerine dayanır. Bu ikinci protein özellikleri önemli ölçüde geleneksel protein saflaştırma stratejilerinde kirletici proteinleri şansını arttırır proteinlerin çeşitli tarafından paylaşılır. Bu sorun, zaman alıcı, birden çok arıtma sütun kullanımı ile engellenebilecektir. Aynı zamanda, ikinci kromatografi yöntemler pahalı deney düzeneği gerektirir. Olguların çoğunda etiket ilgi protein benzersiz olacak gibi afinite etiketi arıtma güçlü, hedef-özgüllük artar. Son zamanlarda yapılan araştırmalarda, Flag-ya da HA-afinite saflaştırma yaygın olarak kullanılmaktadır. Mevcut rec aksineTek etiketleri kullanıldığı ombinant protein saflaştırma protokolleri, iki etiketlerin benzersiz bir bileşimini kurulmuştur. Önerilen yöntem, miktar ve istenen proteinin saflığı arasında optimum bir oranı için, ilgi konusu proteinin C-terminalinde N-terminalinde bir His-tag, bir GST-füzyon etiketinin içerir. GST glutatiyon Sefaroz taneleri üzerinde saflaştırma için yüksek verimli bir uzun etiketi (29 kDa) &#39;dir. Ayrıca, KDV kullanarak bizim yöntem 1 maliyet etkinliğini garanti. (Sadece iki amino asit ilavesi ile sonuçlanan tanıma sekansı LeuGluValLeuPheGln / GlyPro ile) PreScisson enzimi ile GST kapalı yarmak için bir olasılık, bir çok avantajı vardır, örneğin, bu strateji allosterik bir engel nedeniyle fizyolojik protein fonksiyonlarının değişiklikler önler. Diğer protein ucuna kaynaşmış His-tag, küçük bölünmüş GST yıkandıktan, hem de bozulmuş proteinlerin ve diğer protein saflığını daha da arttırmak için ikinci bir arıtma adımında karşılık vermektedir<html> kirleticiler. His-saflaştırma adımı kolonu (TALON reçinesi) için GST geçiş Ek olarak, iletişim kuralı, bir diyaliz adımı gerektirmez. Bu tür saflaştırma işlemlerinde yaygın kirletici maddeler ısı şok proteinlerinin (HSP) &#39;dir. MgCI2 ve ATP ile bir kuluçkalama adımının eklenmesi bu kirleticilerin çıkarılması (Şekil 1) sağlar. Hızlı protein sıvı kromatografi (FPLC) ve Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi (HPLC), ilgi konusu saflaştırılmış proteinin yüksek verim elde etmek için pahalı enstrümantasyon bağlıdır sıradan yöntemlerdir. Burada mevcut toplu arıtma protokolü, aksine, manuel ve pahalı bir enstrümantal kurulum gerektirmez. Protein yüksek verim protokolünü ölçeklendirme ulaşılabilir. Aynı zamanda, toplu arıtma protokolü ile, elüsyon hacmi FPLC ve HPLC ile verilmezse protein konsantrasyonu arttırmak için ayarlanabilir. ntent &quot;&gt; Aynı zamanda, toplu GST-His arıtma protokolü ile, ~ 10-300 kDa bir boyut aralığı ile proteinler saflaştırılabilir. en büyük avantajlarından biri, aynı anda birkaç proteinleri saflaştırmak gerçeği ile verilir Örneğin, bir vahşi tip ve mutant protein hem de. sunulan protokol başarı sadece, ilgi konusu proteinin ekspresyon seviyesi ve çözünürlüğüne bağlıdır.

<table><tr><tbody><td colspan="4">REAGENTS</td></tr><tr><td>E.Coli DH10Bac (yetkin)</td><td>Invitrogen</td> Bac-to-Bac Baculovirus Ekspresyon Sistemi Invitrogen <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Maxi Hazırlık Kiti</td><td>Qiagen</td><td>12163</td><td>Çözüm I ve II</td></tr><tr><td>Ultra Saf Bluo-Gal</td><td>Gibco (Yaşam)</td><td>15519028</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Gibco (Yaşam)</td><td>15529019</td><td></td></tr><tr><td>Sf9 ile enfekte olmuş hücreler</td><td>ATCC</td><td>CRL-1711</td><td></td></tr><tr><td>PreScission enzimi</td><td>GE Healthcare</td><td>27084301</td><td></td></tr><tr><td>Grace'in enfekte besiyeri</td><td>Gibco (Life)</td><td>11605-094</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu karakterize</td><td>edilmiş Hiklon</td><td>SH30396.03</td><td></td></tr><tr><td>P / S (Penisilin-Streptomisin)</td><td>Gibco (Yaşam)</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Glutatyon Sefaroz reçinesi</td><td>GE bioscience</td><td>17075605</td><td></td></tr><tr><td>Proteaz inhibitörü kokteyli</td><td>Roche</td><td>11873580001</td><td></td></tr><tr><td>Talon reçinesi</td><td>Clontech</td><td>635504</td><td></td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>BioShop</td><td>288324</td><td></td></tr><tr><td>Gentamisin</td><td>Gibco (Yaşam)</td><td>15710064</td><td></td></tr><tr><td>Evde poliklonal GST-antikor</td><td>üretimi</td> Monoklonal 6X-His-antikoru Clontech 631212<td colspan="4">EQUIPMENTDounce homojenizatör (sıkı)Wheaton 357546 Sonicator (Fisher dismembrator)Fisher Model 150 Diyaliz torbası (50 mm)Fisher Scientific <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td>2115217</tr></tbody></table>

gst-his saflaştırma: tam boy saflaştırılmış proteinler verim iki aşamalı bir saflaştırma protokolü affinity

GST-His purification: A Two-step Affinity Purification Protocol Yielding Full-length Purified Proteins

In vitro protein biyokimyasal karakterizasyonu için in Enzymology anahtar tahliller, ilgi konusu saflaştırılmış proteinin yüksek konsantrasyonlarını gerektirmektedir. Protein saflaştırma protokolleri etkinlik, basitlik ve maliyet etkinliğini 1. birleştirmek gerekir. Burada, bir N-terminal Glutathione Sepharose Tag (GST) ve her ikisi de 2,3-kaynaşmış, bir C-terminal 10xHis etiketi 4 dayanan rekombinant protein için yeni bir küçük ölçekli bir afinite arıtma sistemi gibi GST-His yöntemi tarif ilgilenilen proteine. İkinci yapı, protein ekspresyonu için Sf9 5 enfekte olmuş hücrelerin enfeksiyonu için, baculovirüsler oluşturmak için kullanılır. KDV arıtma verimliliği sağlamak için hizmet veren, oldukça uzun bir etiket (29 kDa) &#39;dir. Bununla birlikte, proteinin fizyolojik özelliklerini etkileyebilir. Bu nedenle, bu daha sonra 6 PreScisson enzim kullanılarak protein kesilir. , En fazla saflık sağlamak ve bölünmüş GST çıkarmak için, biznispeten küçük bir His-Tag göre ikinci bir afinite saflaştırma adımı ilave edildi. Önemli olarak, bizim teknik bu nedenle, bozulmuş proteinlerin çıkması ve etkili bir araçtır, proteinin, iki ucunu yan iki farklı etiketler dayanan, tam uzunluklu proteinlerin zenginleştirir. Burada sunulan yöntem, FPLC gibi pahalı bir enstrümantal kurulum, gerektirmez. Ayrıca, ısı şoku proteini kirleri ve nükleik asitler kontamine kaldırmaya nukleaz tedavisi kaldırmak için MgCl2 ve ATP yıkar dahil. Özet olarak, yandan kuşatan iki farklı etiketler kombinasyonu N-ve C-terminal ve etiketler biri kapalı parçalama yeteneği, ilgi konusu bir yüksek derecede arıtılmış ve tam-boy proteinin kurtarma garanti eder.

GST-His saflaştırma protokolü etkinliğini göstermek amacıyla, Rec14, bir S. arıtıldı 32.9 kDa protein pombe. Rec14 cDNA, sırasıyla N-ve C-termini, (Şekil 1A) GST-ve His-etiketi ekleme olanak veren bir modifiye pFastBac1 vektörü içinde klonlandı. Rekombinant bakulovirüs hazırlanabilir ve protein ifadesi için SF9 enfekte hücreleri enfekte etmek için kullanıldı. Çözünür hücre lizatları GST taneleri ile kuluçkalandı ve bağlanmış proteinleri PreScisson proteaz ile GST bölünmesi ile elüt edi...

Bu protokol, eşsiz bir şekilde bölünebilir GST-tag ve küçük bir His-tag birleştirilmesiyle yeniden birleştirici proteinlerin saflaştırılmasını sağlayan bir yüksek verimli ve düşük maliyetli, küçük ölçekli protein saflaştırma yöntemi göstermektedir.

GST-His saflaştırma: Tam boy Saflaştırılmış Proteinler Verim iki aşamalı bir saflaştırma protokolü Affinity

Key assays in enzymology for the biochemical characterization of proteins in vitro necessitate high concentrations of the purified protein of interest. ...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, hedeflenen proteinin yüksek saflıkta ve tam uzunlukta elde edilmesidir. Bu işlem, hedeflenen proteinin yüksek düzeyde eksprese edilmiş ve çözünür, çift etiketli bir versiyonunu elde etmek amacıyla SF nine böcek hücrelerini enfekte etmek için kullanılan rekombinant bir bao virüsü üretilerek gerçekleştirilir. Ardından, önce glutatyon-S-transferaz etiketli proteinin saflaştırılması ve bunu takip eden metal afinite kromatografisi ile karakterize edilen iki aşamalı bir afinite saflaştırması yürütülür.Saflaştırma işleminin sonucunda yüksek saflıkta histidin etiketli bir protein elde edilir. Ardından, saklama tamponunda düşük tuz konsantrasyonları sağlamak amacıyla saflaştırılmış protein örnekleri diyaliz edilir. Bir SDS page jelinin tüm protein boyamasına dayanarak proteinin ekspresyon çözünürlüğünü, miktarını ve kalitesini gösteren sonuçlar elde edilir.Bu yöntemle ilgili ilk fikrimiz, PAL B two ve BOC two gibi büyük ve kararsız proteinleri saflaştırmakta zorluk çektiğimizde ortaya çıktı. Dolayısıyla, bu tekniğin tek basamaklı afinite saflaştırması gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, iki basamaklı afinite saflaştırma protokolümüzde elde edilen proteinin yüksek derecede saf olması ve genellikle degredasyon ürünlerinden arınmış olmasıdır. Bu yöntem, saflaştırılmış rekombinant proteinlerin biyokimyasal fonksiyonları gibi protein biyolojisi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.Bu protokol, rekombinant baculovirus üretimi ile başlar ve ardından enfeksiyon için metin protokolünde açıklandığı üzere en verimli baculovirus'ün seçimi ile devam eder. 500 mililitre besiyeri içerisinde 0,75 ile 1,0 x 10⁶ SF9 hücresi içeren ve virüs ile besiyeri oranı 1:150 olan bir spinner kültür kabı hazırlayın. Spinner'ı bir hücre kültürü davlumbazının altına yerleştirin ve gerekli hacimdeki baculovirus süspansiyonunu spinner'ın bir kolundan hücre süspansiyonuna ekleyerek hücreleri enfekte edin.Enfekte hücrelerin 27 °C'de süspansiyon halinde büyümelerine izin verin ve en verimli bakulovirüs seçilirken belirlenen maksimum protein ekspresyonuna ulaşıldığında hücreleri hasat edin. Hücreleri hasat ettikten sonra, hedef proteini eksprese eden SF9 hücrelerini, buz banyosu içerisinde proteaz inhibitörleri ile desteklenmiş yaklaşık 20 mL GST bağlanma tamponu ile lize edin. Çözeltiyi bir homojenizatör ile 20 kez aşağı-yukarı pipetleyin, ardından üç kez 30 saniyelik döngüler halinde sonikasyona tabi tutun ve tekrar 20 kez aşağı-yukarı pipetleyin; ardından hücre lizatını 4 °C'de 30 dakika boyunca 18.000 RPM'de santrifüjleyin ve süpernatanı saklayın. Çözünür hücre lizatını, önceden yıkanmış 1 mL GST boncukları ile 4 °C'de, hafif rotasyon altında bir saat boyunca inkübe edin.İnkübasyon süresi, pro'nun stabilitesine ve bağlanma sonrası bağlanma verimliliğine göre optimize edilmelidir. 700 RPM'de kısa süreli santrifüj yapın ve bağlanmamış proteinleri içeren süpernatantı uzaklaştırın. GST ile bağlanmış proteinleri GST yıkama tamponu ile yıkayın.Bu işlemi son yıkamadan sonra iki kez tekrarlayın. Süpernatanın mümkün olduğunca fazlasını uzaklaştırın. Ardından, inkübasyon sonrası ısı şoku proteinlerinin spesifik olmayan bağlanmasını önlemek için boncukları, 10 mL GST bağlama tamponu içerisindeki 5 mM ATP ve 15 mM magnezyum klorür ile 4 °C'de bir saat boyunca inkübe edin.Boncukları GST yıkama tamponu ile üç kez yıkayın. GST boncuklarını santrifüjleyip süpernatantı uzaklaştırdıktan sonra, GST boncuklarını P five tamponu ile yıkayın. Ardından, GST boncuklarını 100 µL'lik fraksiyonlara ayırın ve 100 µL P five tamponu içinde seyreltilmiş dört ila sekiz ünite precision enzyme ekleyin.GST boncuklarını enzim ile birlikte dört santigrat derecede, hafif rotasyon altında üç saatten gece boyunca sürecek şekilde inkübe edin. İnkübasyon süresi, proteinin kesilme sonrası stabilitesinin yanı sıra moleküler ağırlığına göre optimize edilmelidir. Kısa süreli santrifüj uygulayın ve süpernatantı toplayın.Boncuklara 100 µL P five tamponu ekleyin. Ardından santrifüjleme ve süpernatan toplama işlemini iki kez tekrarlayın. Tüm fraksiyonları çekin.EIT'yi bir mililitrelik üç fraksiyona ayırın ve her birini 100 mikrolitre önceden yıkanmış talon metal afinite reçinesi kuru boncukları ile rotasyon altında bir saat boyunca inkübe edin; elüsyonun birkaç fraksiyona bölünmesi, bağlanma ve yıkama verimliliğini artırır. Ardından reçineyi, dört santigrat derecede hafif rotasyonla P 30 tamponu ile beş dakika boyunca yıkayın. Yıkama işlemini iki kez tekrarladıktan sonra, saflaştırılmış proteini elüe etmek için boncukları tek bir tüpte toplayın.Proteine bağlanmış talon reçinesine P 500 tamponu ekleyin. Tampon ile boncuk oranını hacimce bir bire ayarlayın. Süspansiyonu rotasyon altında beş dakika inkübe edin.Bu adımı iki kez tekrarlayın. Saflaştırılmış proteinin saklanması için elüye edilen her fraksiyonu ayrı tutun. Proteini, uygun bir saklama tamponuna karşı, dört derece santigrat sıcaklıkta, ajitasyon altında bir saat boyunca iki kez diyalize edin.Diyaliz sırasında saflaştırılmış proteinin çökelip çökelemediğinin kontrol edilmesi önemlidir. Saflaştırılmış proteinden küçük alikotlar hazırlayın ve 30 dakika boyunca kuru buz üzerinde dondurun. Alikotları -80 °C'de saklayın ve çok sayıda dondurma-çözme döngüsünden kaçının.Her fraksiyonun yaklaşık 20 ila 40 µL'sini bir SDS-PAGE jeline yükleyerek saflaştırma sürecini analiz edin. Jel çalıştırıldıktan sonra, görselleştirme için Coomassie Blue veya protein boyası ile boyama yapın; REC 14 rekombinant vaccinia virüsü ile enfekte edilmiş veya kontrol olarak yalancı enfekte edilmiş SF9 hücrelerinden elde edilen çözünür ve toplam hücre lizatları, saflaştırma süreci boyunca GST-RE14-His proteininin ekspresyonunun onaylanmasını sağlamak amacıyla Coomassie Blue boyaması ile analiz edildi. Yöntemin verimliliğini takip etmek için birçok örnek analiz edildi ve bu örneklerin Coomassie Blue ile analizi gerçekleştirildi.Boyama, saflaştırmanın ilk aşamasında, GST Rec 14'ün GST boncuklarına doğru şekilde bağlandığını göstermektedir; rec 14'ün GST ile füzyonu nedeniyle yaklaşık 50 kilodaltonluk bir görünür moleküler ağırlık saptanmıştır. G-S-T-G-S-T ile hassas kesim sonrası, serbest rec 14 hiss yaklaşık 37 kilodalton civarında göç eder. Kesilmiş GST, GST boncukları üzerinde görselleştirilebilirken, serbest REC 14'ün bir kısmının hâlâ GST boncuklarına bağlı kalmasına rağmen, belirgin bir REC 14 hiss zenginleşmesi sağlanmıştır. Bu adım, proteinin hassas proteaz ile inkübasyon süresi artırılarak geliştirilebilir. Talon boncuklarına bağlı REC 14 hiss'in analizi, GST saflaştırma adımı sonrası elüt edilen proteinlerle karşılaştırıldığında, REC 14 hiss'in büyük bir kısmının talon boncuklarına bağlandığını göstermektedir.Birkaç yıkama işleminden sonra, REC 14 hiss elüe edilip toplandı ve üç elüsyon gerçekleştirildi. Analiz, rec 14 hiss'in yüksek saflıkta olduğunu ve elüye edilen fraksiyonların talon boncuklarla karşılaştırıldığı ilk elüsyonla karşılaştırıldığında rec 14 hiss'in en yüksek konsantrasyonda olduğunu ortaya koydu; bu durum elüsyonun verimliliğini göstermektedir. Çünkü boncuklara bağlı olarak çok az rec 14 hiss tespit edilebilmektedir.REC 14'ü takip etmek amacıyla bu örnekler, anti GST ve anti hiss antikorları kullanılarak Western blot analizine tabi tutulmuştur. Prosedür boyunca, anti GST blotu, GST saflaştırma adımından gelen söz konusu proteinlerde bir miktar GST-REC 14 ve tek başına GST bulunduğunu ve kontaminanların hiss tag afinite saflaştırma adımıyla uzaklaştırıldığını göstermektedir. Bu blot, hassas işlem ve hiss tag saflaştırma adımı ile GST'nin REC 14'ten verimli bir şekilde uzaklaştırıldığını ortaya koymaktadır.Anti-His blot, Rec 14'ü tespit etmeyi amaçlamaktadır. Bu blot, GST Rec 14 His ve REC 14 His'in GST boncuklarından tamamen kesilip uzaklaştırılmadığını doğrulamaktadır. Ayrıca, yüksek konsantrasyonda REC 14'ün agrege olduğu görülmektedir.Özetle, sunulan sonuçlar S palm B rec 14'ün saflaştırılması için GST hiss saflaştırmasının verimliliğini kanıtlamaktadır. Bu videoyu izledikten sonra, yüksek düzeyde saflaştırılmış bir rekombinant proteini nasıl geri kazanacağınız konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.Bu teknik, düzgün bir şekilde uygulandığında, çözünür ly asidinin dejenerasyonundan sonraki 12 saat içinde gerçekleştirilebilir. Bu prosedür uygulanırken, protein degradasyonunu önlemek için hızlı çalışmak ve kesinlikle 4 °C sıcaklıkta işlem yapmak önemlidir. Bu prosedürü takiben, protein partnerlerinin tanımlanması veya ilgili proteinin post-translasyonel modifikasyonu gibi ek soruları yanıtlamak amacıyla ko-presipitasyon analizleri veya kütle spektrometrisi gibi diğer yöntemler uygulanabilir.Bu yöntemi DNA tamir proteinleri için kullansak da, strateji diğer araştırma alanlarındaki proteinlerin işlevlerini incelemek için modifiye edilebilir.

gst-his-purification-two-step-affinity-purification-protocol-yielding

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Protein transdüksiyon biyolojik olarak aktif proteinler hücre içine doğrudan teslim sağlar. DNA transfeksiyon veya viral transdüksiyon gibi geleneksel yöntemler yerine, aksine bu non-invaziv bir paradigma hücresel toksisite ve kalıcı genetik modifikasyon onkojenik transformasyon riskini engellemeyi titrasyon bir şekilde yüksek verimli hücresel manipülasyon sağlar.

Mühendislik Hücre geçirgen Protein

Burada, son derece aktif Hsp104 hexameric AAA + protein mayası, protein ayrıştırılmasıyla çiftler ATP hidrolizi arıtma için bir protokol açıklar. Bu düzeni yakınlık arıtma için His6 etiketli inşa...

Hsp104 saflaştırılması, Protein Disaggregase

Yeni ve son derece verimli, iki kademeli afinite kromatografisi protokolü geliştirildi ve ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Bu yöntem iki içsel yakınlık küçük bir arıtma etiketi dayanan ve farklı özelliklere sahip geniş bir hedef proteinlerin uygulanabilir.

Küçük Bispecific Affinity Tag Kolaylaştırılmış Ortogonal Protein Saflaştırma

Bu sıvı işleme robot kullanılarak rekombinant protein benzerlik-etiketli saflaştırılması için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem, genel olarak, bir yüksek verimli biçimde çözünür His-etiketli proteinlerin küçük ölçekli arıtma için de geçerlidir.

Affinity etiketli Rekombinant Proteinler Yüksek throughput Arıtma

Kaynak: Becker, B. ve diğerleri. Mayada Risin Toksin A Zinciri (RTA) kaçakçılığı için gerekli hücresel bileşenleri belirlemek için basit bir floresans tabanlı raporlayıcı testi. J. Vis. Exp. (2017).Bu video, polihistidin etiketli bir rekombinant proteinin nikel bazlı affinite kromatografisi kullanılarak arıtılmasını göstermektedir. Anahtar adımları belirtir; bunlar arasında sonikasyon yoluyla bakteriyel lizizi, lizatın aydınlaştırılması ve filtrasyonu ile imidazol kullanılarak hedef proteinin...

 Rekombinant Bakteriyel Proteinin Arındırılması için Afinite Kromatografi Tekniği

Bu videoda, Clostridium difficile bakterilerinden histidin etiketli pirofosfokinaz enzimlerini saflaştırmak için nikel afinite kromatografisi tekniğini gösteriyoruz.

Nikel Afinite Kromatografisi Bazlı Protein Saflaştırması: Polihistidin Etiketli Rekombinant Proteinleri Bakteriyel Hücre Lizatından Saflaştırmak İçin Bir Teknik

Burada bir etiket bilgilerini kantitatif kütle spektrometresi kullanılarak protein korelasyon profil ardından afinite protein komplekslerinin saflaştırılması ve mavi doğal PAGE ile onların ayrılması için protokoller, mevcut. Bu yöntem, farklı protein kompleksleri halinde interactomes çözmek için yararlıdır.

Mavi Yerli PAGE ve Protein İlişkisi Profil Yöntemi ile Affinity Saf protein Kompleksler çözümleniyor

Bir yordam dCACHE periplasmic ligand bağlayıcı etki dahil organları ve protein miligram miktarlarda verim için arıtma Campylobacter jejuni chemoreceptor Tlp3, refolding için sunulmaktadır.

Verimli Refolding ve arıtma Chemoreceptor Ligand bağlayıcı etki için yöntemi

İyon kanalları arıtma kez, zorlu ama bir kez elde, potansiyel olarak vitro araştırmalar fonksiyonları ve yapıları kanallarının izin verebilirsiniz. Burada, biz ifade ve arıtma memeli bestrophin protein, bir ailenin Ca2 +için kademeli yordamlar açıklar-Cl- kanalları aktif.

İfade ve arıtma memeli Bestrophin iyon kanalları

INAD protein kompleksinin montaj mekanizmasına dayanarak, bu protokolde, endojen Drosophila TRP kanalını saflaştırmak için modifiye edilmiş bir afinite saflaştırma artı rekabet stratejisi geliştirilmiştir.

Endojen Drosophila Geçici Reseptör Potansiyel Kanallarının Saflaştırılması

Bu makale, bir 6X-histidin etiketi ile etiketlenmiş bir insan rekombinant proteini olan flep endonükleaz 1'in (FEN1) afinite saflaştırılması için bir prosedür sağlar. Protokol, etiketli proteinin saflaştırılması için iki farklı hareketsizleştirilmiş metal iyon kolonunun kullanılmasını içerir.

Hızlı Protein Sıvı Kromatografi Sistemi Kullanılarak 6X His Etiketli Bir Proteinin Afinite Saflaştırılması 

Öğrenin GST-His etiketli proteinleri iki aşamalı afinite kromatografi ile saflaştırma yöntemini. SF9 böcek hücrelerinde rekombinant protein ifadesi ve yüksek saflıkta tam boy protein izolasyonu için etkili bir protokol.

GST-His saflaştırma: Tam boy Saflaştırılmış Proteinler Verim iki aşamalı bir saflaştırma protokolü Affinity

Daha fazla video keşfet