GST-His saflaştırma: Tam boy Saflaştırılmış Proteinler Verim iki aşamalı bir saflaştırma protokolü Affinity

Aşağıdaki deneyin genel amacı, hedeflenen proteinin yüksek saflıkta ve tam uzunlukta elde edilmesidir. Bu işlem, hedeflenen proteinin yüksek düzeyde eksprese edilmiş ve çözünür, çift etiketli bir versiyonunu elde etmek amacıyla SF nine böcek hücrelerini enfekte etmek için kullanılan rekombinant bir bao virüsü üretilerek gerçekleştirilir. Ardından, önce glutatyon-S-transferaz etiketli proteinin saflaştırılması ve bunu takip eden metal afinite kromatografisi ile karakterize edilen iki aşamalı bir afinite saflaştırması yürütülür.

Saflaştırma işleminin sonucunda yüksek saflıkta histidin etiketli bir protein elde edilir. Ardından, saklama tamponunda düşük tuz konsantrasyonları sağlamak amacıyla saflaştırılmış protein örnekleri diyaliz edilir. Bir SDS page jelinin tüm protein boyamasına dayanarak proteinin ekspresyon çözünürlüğünü, miktarını ve kalitesini gösteren sonuçlar elde edilir.

Bu yöntemle ilgili ilk fikrimiz, PAL B two ve BOC two gibi büyük ve kararsız proteinleri saflaştırmakta zorluk çektiğimizde ortaya çıktı. Dolayısıyla, bu tekniğin tek basamaklı afinite saflaştırması gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, iki basamaklı afinite saflaştırma protokolümüzde elde edilen proteinin yüksek derecede saf olması ve genellikle degredasyon ürünlerinden arınmış olmasıdır. Bu yöntem, saflaştırılmış rekombinant proteinlerin biyokimyasal fonksiyonları gibi protein biyolojisi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.

Bu protokol, rekombinant baculovirus üretimi ile başlar ve ardından enfeksiyon için metin protokolünde açıklandığı üzere en verimli baculovirus'ün seçimi ile devam eder. 500 mililitre besiyeri içerisinde 0,75 ile 1,0 x 10⁶ SF9 hücresi içeren ve virüs ile besiyeri oranı 1:150 olan bir spinner kültür kabı hazırlayın. Spinner'ı bir hücre kültürü davlumbazının altına yerleştirin ve gerekli hacimdeki baculovirus süspansiyonunu spinner'ın bir kolundan hücre süspansiyonuna ekleyerek hücreleri enfekte edin.

Enfekte hücrelerin 27 °C'de süspansiyon halinde büyümelerine izin verin ve en verimli bakulovirüs seçilirken belirlenen maksimum protein ekspresyonuna ulaşıldığında hücreleri hasat edin. Hücreleri hasat ettikten sonra, hedef proteini eksprese eden SF9 hücrelerini, buz banyosu içerisinde proteaz inhibitörleri ile desteklenmiş yaklaşık 20 mL GST bağlanma tamponu ile lize edin. Çözeltiyi bir homojenizatör ile 20 kez aşağı-yukarı pipetleyin, ardından üç kez 30 saniyelik döngüler halinde sonikasyona tabi tutun ve tekrar 20 kez aşağı-yukarı pipetleyin; ardından hücre lizatını 4 °C'de 30 dakika boyunca 18.000 RPM'de santrifüjleyin ve süpernatanı saklayın. Çözünür hücre lizatını, önceden yıkanmış 1 mL GST boncukları ile 4 °C'de, hafif rotasyon altında bir saat boyunca inkübe edin.

İnkübasyon süresi, pro'nun stabilitesine ve bağlanma sonrası bağlanma verimliliğine göre optimize edilmelidir. 700 RPM'de kısa süreli santrifüj yapın ve bağlanmamış proteinleri içeren süpernatantı uzaklaştırın. GST ile bağlanmış proteinleri GST yıkama tamponu ile yıkayın.

Bu işlemi son yıkamadan sonra iki kez tekrarlayın. Süpernatanın mümkün olduğunca fazlasını uzaklaştırın. Ardından, inkübasyon sonrası ısı şoku proteinlerinin spesifik olmayan bağlanmasını önlemek için boncukları, 10 mL GST bağlama tamponu içerisindeki 5 mM ATP ve 15 mM magnezyum klorür ile 4 °C'de bir saat boyunca inkübe edin.

Boncukları GST yıkama tamponu ile üç kez yıkayın. GST boncuklarını santrifüjleyip süpernatantı uzaklaştırdıktan sonra, GST boncuklarını P five tamponu ile yıkayın. Ardından, GST boncuklarını 100 µL'lik fraksiyonlara ayırın ve 100 µL P five tamponu içinde seyreltilmiş dört ila sekiz ünite precision enzyme ekleyin.

GST boncuklarını enzim ile birlikte dört santigrat derecede, hafif rotasyon altında üç saatten gece boyunca sürecek şekilde inkübe edin. İnkübasyon süresi, proteinin kesilme sonrası stabilitesinin yanı sıra moleküler ağırlığına göre optimize edilmelidir. Kısa süreli santrifüj uygulayın ve süpernatantı toplayın.

Boncuklara 100 µL P five tamponu ekleyin. Ardından santrifüjleme ve süpernatan toplama işlemini iki kez tekrarlayın. Tüm fraksiyonları çekin.

EIT'yi bir mililitrelik üç fraksiyona ayırın ve her birini 100 mikrolitre önceden yıkanmış talon metal afinite reçinesi kuru boncukları ile rotasyon altında bir saat boyunca inkübe edin; elüsyonun birkaç fraksiyona bölünmesi, bağlanma ve yıkama verimliliğini artırır. Ardından reçineyi, dört santigrat derecede hafif rotasyonla P 30 tamponu ile beş dakika boyunca yıkayın. Yıkama işlemini iki kez tekrarladıktan sonra, saflaştırılmış proteini elüe etmek için boncukları tek bir tüpte toplayın.

Proteine bağlanmış talon reçinesine P 500 tamponu ekleyin. Tampon ile boncuk oranını hacimce bir bire ayarlayın. Süspansiyonu rotasyon altında beş dakika inkübe edin.

Bu adımı iki kez tekrarlayın. Saflaştırılmış proteinin saklanması için elüye edilen her fraksiyonu ayrı tutun. Proteini, uygun bir saklama tamponuna karşı, dört derece santigrat sıcaklıkta, ajitasyon altında bir saat boyunca iki kez diyalize edin.

Diyaliz sırasında saflaştırılmış proteinin çökelip çökelemediğinin kontrol edilmesi önemlidir. Saflaştırılmış proteinden küçük alikotlar hazırlayın ve 30 dakika boyunca kuru buz üzerinde dondurun. Alikotları -80 °C'de saklayın ve çok sayıda dondurma-çözme döngüsünden kaçının.

Her fraksiyonun yaklaşık 20 ila 40 µL'sini bir SDS-PAGE jeline yükleyerek saflaştırma sürecini analiz edin. Jel çalıştırıldıktan sonra, görselleştirme için Coomassie Blue veya protein boyası ile boyama yapın; REC 14 rekombinant vaccinia virüsü ile enfekte edilmiş veya kontrol olarak yalancı enfekte edilmiş SF9 hücrelerinden elde edilen çözünür ve toplam hücre lizatları, saflaştırma süreci boyunca GST-RE14-His proteininin ekspresyonunun onaylanmasını sağlamak amacıyla Coomassie Blue boyaması ile analiz edildi. Yöntemin verimliliğini takip etmek için birçok örnek analiz edildi ve bu örneklerin Coomassie Blue ile analizi gerçekleştirildi.

Boyama, saflaştırmanın ilk aşamasında, GST Rec 14'ün GST boncuklarına doğru şekilde bağlandığını göstermektedir; rec 14'ün GST ile füzyonu nedeniyle yaklaşık 50 kilodaltonluk bir görünür moleküler ağırlık saptanmıştır. G-S-T-G-S-T ile hassas kesim sonrası, serbest rec 14 hiss yaklaşık 37 kilodalton civarında göç eder. Kesilmiş GST, GST boncukları üzerinde görselleştirilebilirken, serbest REC 14'ün bir kısmının hâlâ GST boncuklarına bağlı kalmasına rağmen, belirgin bir REC 14 hiss zenginleşmesi sağlanmıştır. Bu adım, proteinin hassas proteaz ile inkübasyon süresi artırılarak geliştirilebilir. Talon boncuklarına bağlı REC 14 hiss'in analizi, GST saflaştırma adımı sonrası elüt edilen proteinlerle karşılaştırıldığında, REC 14 hiss'in büyük bir kısmının talon boncuklarına bağlandığını göstermektedir.

Birkaç yıkama işleminden sonra, REC 14 hiss elüe edilip toplandı ve üç elüsyon gerçekleştirildi. Analiz, rec 14 hiss'in yüksek saflıkta olduğunu ve elüye edilen fraksiyonların talon boncuklarla karşılaştırıldığı ilk elüsyonla karşılaştırıldığında rec 14 hiss'in en yüksek konsantrasyonda olduğunu ortaya koydu; bu durum elüsyonun verimliliğini göstermektedir. Çünkü boncuklara bağlı olarak çok az rec 14 hiss tespit edilebilmektedir.

REC 14'ü takip etmek amacıyla bu örnekler, anti GST ve anti hiss antikorları kullanılarak Western blot analizine tabi tutulmuştur. Prosedür boyunca, anti GST blotu, GST saflaştırma adımından gelen söz konusu proteinlerde bir miktar GST-REC 14 ve tek başına GST bulunduğunu ve kontaminanların hiss tag afinite saflaştırma adımıyla uzaklaştırıldığını göstermektedir. Bu blot, hassas işlem ve hiss tag saflaştırma adımı ile GST'nin REC 14'ten verimli bir şekilde uzaklaştırıldığını ortaya koymaktadır.

Anti-His blot, Rec 14'ü tespit etmeyi amaçlamaktadır. Bu blot, GST Rec 14 His ve REC 14 His'in GST boncuklarından tamamen kesilip uzaklaştırılmadığını doğrulamaktadır. Ayrıca, yüksek konsantrasyonda REC 14'ün agrege olduğu görülmektedir.

Özetle, sunulan sonuçlar S palm B rec 14'ün saflaştırılması için GST hiss saflaştırmasının verimliliğini kanıtlamaktadır. Bu videoyu izledikten sonra, yüksek düzeyde saflaştırılmış bir rekombinant proteini nasıl geri kazanacağınız konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

Bu teknik, düzgün bir şekilde uygulandığında, çözünür ly asidinin dejenerasyonundan sonraki 12 saat içinde gerçekleştirilebilir. Bu prosedür uygulanırken, protein degradasyonunu önlemek için hızlı çalışmak ve kesinlikle 4 °C sıcaklıkta işlem yapmak önemlidir. Bu prosedürü takiben, protein partnerlerinin tanımlanması veya ilgili proteinin post-translasyonel modifikasyonu gibi ek soruları yanıtlamak amacıyla ko-presipitasyon analizleri veya kütle spektrometrisi gibi diğer yöntemler uygulanabilir.

Bu yöntemi DNA tamir proteinleri için kullansak da, strateji diğer araştırma alanlarındaki proteinlerin işlevlerini incelemek için modifiye edilebilir.