GST-His saflaştırma: Tam boy Saflaştırılmış Proteinler Verim iki aşamalı bir saflaştırma protokolü Affinity

Aşağıdaki deneyin genel amacı, yüksek oranda saflaştırılmış, tam uzunlukta bir ilgi proteini elde etmektir. Bu, ilgilenilen proteinin yüksek oranda eksprese edilmiş ve çözünür iki etiketli bir versiyonunu elde etmek için SF dokuz böcek hücresini enfekte etmek için kullanılan rekombinant bir bao virüsü üretilerek elde edilir. Daha sonra, glutatyon, seros etiketli proteinin saflaştırılması ve ardından metal afinite kromatografisi ile karakterize edilen iki aşamalı bir afinite saflaştırması gerçekleştirilir.

Saflaştırmanın sonucu, oldukça saf histidin etiketli bir proteindir. Daha sonra saflaştırılmış protein numuneleri, depolama tamponunda düşük tuz konsantrasyonlarını garanti etmek için diyalize edilir. Bir SDS sayfa jelinin tüm protein boyasına dayalı olarak proteinin ekspresyon çözünürlüğünü, miktarını ve kalitesini gösteren sonuçlar elde edilir.

Bu yöntem için ilk olarak, PAL B iki ve BOC iki gibi büyük ve kararsız proteinleri saflaştırmakta sorun yaşadığımızda aklımıza geldi. Dolayısıyla, bu tekniğin tek adımlı afinite saflaştırması gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, iki aşamalı afinite saflaştırma protokolümüzde, elde edilen proteinin oldukça saf olması ve genellikle bozunma ürünlerinden arınmış olmasıdır. Bu yöntem, saflaştırılmış rekombinant proteinlerin biyokimyasal işlevleri gibi protein biyolojisi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.

Bu protokol, rekombinant bao virüsünün üretilmesi ile başlar, ardından enfeksiyon için metin protokolünde açıklandığı gibi en verimli BA virüsünün seçilmesi ile devam eder. Virüs ve ortam arasında bir ila 150 oranında olacak şekilde 500 mililitre ortamda 0.75 ila 1.0 kez 10 ila altı SF dokuz hücre içeren bir döndürücü kültür kabı hazırlayın. Döndürücüyü bir hücre kültürü başlığının altına yerleştirin, döndürücünün bir kolu aracılığıyla hücre süspansiyonuna gerekli hacimde baula virüsü süspansiyonu ekleyerek hücreleri enfekte edin.

Enfekte olmuş hücrelerin 27 santigrat derecede süspansiyon halinde büyümesine izin verin ve en verimli makula virüsü seçilirken belirlenen maksimum protein ekspresyonuna ulaşıldığında hücreleri hasat edin. Hücreler toplandıktan sonra, bir buzlu su banyosunda proteaz inhibitörleri ile desteklenmiş, yaklaşık 20 mililitre GST bağlayıcı tamponda ilgilenilen proteini ifade eden SF dokuz hücresi lyce. Çözeltiyi bir aşağı homojenizatör ile 20 kez aşağı indirin, daha sonra 20 kez tekrar dans etmeden önce üç 32. döngü için sonikasyon yapın, hücre lizatını dört santigrat derecede 30 dakika boyunca 18.000 RPM'de santrifüjleyin ve süpernatantın çözünür hücre lizatını bir mililitre önceden yıkanmış GST boncukları ile bir saat boyunca dört santigrat derecede inkübe etmesini sağlayın.

Kuluçka süresi, pro'nun stabilitesine ve bağlamayı takiben bağlama verimliliğine göre optimize edilmelidir. 700 RPM'de hızlı dönüş yapın ve bağlanmamış proteinler içeren süpernatanı çıkarın. GST'ye bağlı proteinleri GST yıkama tamponu ile yıkayın.

Son yıkamadan sonra bu işlemi iki kez tekrarlayın. Mümkün olduğu kadar çok süpernatanı çıkarın. Daha sonra, inkübasyonu takiben ısı şoku proteinlerinin spesifik olmayan bağlanmasını önlemek için boncukları 10 mililitre GST bağlama tamponunda 10 mililitre GST bağlama tamponunda beş milimolar A TP ve 15 milimolar magnezyum klorür ile inkübe edin.

Boncukları GST yıkama tamponu ile üç kez yıkayın. GST boncuklarını santrifüjledikten ve süpernatanı çıkardıktan sonra, GST boncuklarını P beş tamponu ile yıkayın. Daha sonra, GST boncuklarını, 100 mikrolitrelik ihlalleri bölün ve 100 mikrolitre P beş tamponunda seyreltilmiş dört ila sekiz birim hassas enzim ekleyin.

GST boncuklarını enzimle hafif rotasyon altında dört santigrat derecede üç saat ila gece boyunca inkübe edin. Kuluçka süresi, bölünmeyi takiben molekül ağırlığına ve proteinin stabilitesine göre optimize edilmelidir. Hızlı döndürün ve süpernatanı toplayın.

Boncuklara 100 mikrolitre P beş tampon ekleyin. Ardından tekrarlayın, döndürün ve süpernatan toplamayı iki kez yapın. Tüm kesirleri çekin.

EIT'yi bir mililitrelik üç fraksiyona bölün ve her birini 100 mikrolitre önceden yıkanmış pençe metal afinite reçinesi kuru boncukları ile rotasyon altında bir saat boyunca inkübe edin, elüsyonu birkaç fraksiyona bölün, bağlanma ve yıkama verimliliğini artırın. Daha sonra reçineyi P 30 tamponu ile dört santigrat derecede hafifçe döndürerek beş dakika yıkayın. Yıkamayı iki kez tekrarladıktan sonra, saflaştırılmış proteini çıkarmak için boncukları tek bir tüpte çekin.

Proteine bağlı pençe reçinesine P 500 tamponu ekleyin. Bire bir birimin arabellek / boncuk oranı ekleyin. Hacim. Süspansiyonu rotasyon altında beş dakika inkübe edin.

Bu adımı iki kez tekrarlayın. Saflaştırılmış proteinin depolanması için kaçan her fraksiyonu ayrı tutmak. Proteini, çalkalama altında dört santigrat derecede bir saat boyunca iki kez uygun bir depolama tamponuna karşı diyalize edin.

Diyaliz sırasında saflaştırılmış proteinin çökelmesini kontrol etmek önemlidir. Saflaştırılmış proteinin küçük kısımlarını yapın ve 30 dakika boyunca kuru buz üzerinde dondurun. Alikotları eksi 80 santigrat derecede saklayın ve birçok çözülme donma döngüsünden kaçının.

Her fraksiyondan yaklaşık 20 ila 40 mikrolitre bir SDS sayfa jeli üzerine yükleyerek saflaştırma işlemini analiz edin. Jel boyasını görselleştirme için kumasi mavisi veya protein boyası ile çalıştırdıktan sonra, REC 14 rekombinant valo virüsü ile enfekte olmuş SF dokuz hücresinden veya kontrol olarak enfekte olmuş sahte hücrelerden çözünür ve toplam hücre lizatları, Kumasi mavisi boyama ile analiz edildi ve saflaştırma işlemi sırasında GST re 14 proteininin ekspresyonunun doğrulanmasına izin verdi. Bu numunelerin kumasi Blue ile yapılan yöntem analizinin etkinliğini takip etmek için birçok numune analiz edilmiştir.

Boyama, saflaştırmanın ilk adımı sırasında, GST Rec 14'ün, G-S-T-G-S-T ile hassas bölünmeden sonra rec 14'ün GST ile füzyonu nedeniyle yaklaşık 50 kilodalton görünür moleküler ağırlığa sahip GST boncuklarına doğru şekilde bağlandığını gösterir, serbest rec 14 tıslama yaklaşık 37 kilodalton göç eder. Bölünmüş GST, GST boncukları üzerinde görselleştirilebilirken, GST içermeyen REC 14'ün hala GST boncuklarına bağlı kalan bir kısmına rağmen, REC 14 tıslamasında kayda değer bir zenginleştirme elde edildi. Bu adım, GST saflaştırma adımından sonra ima edilen proteinlere kıyasla Talon boncuklarına bağlı REC 14 hissinin hassas proteaz analizi ile proteinin inkübasyon süresinin arttırılmasıyla geliştirilebilir, REC 14 hissinin büyük bir kısmının pençe boncuklarına bağlı olduğunu gösterir.

Birkaç yıkamadan sonra, REC 14 tıslaması önlendi ve toplandı, üç illüzyon gerçekleştirildi. Analiz, Ellucian illüzyonun verimliliğini gösterdikten sonra, kaçan fraksiyonların pençe boncuklarıyla ilk Ellucian karşılaştırmasında yüksek bir rec 14 tıslama saflığını ve en büyük rec 14 hiss konsantrasyonunu ortaya çıkardı. Küçük rec 14 tıslaması boncuklara bağlı olarak algılanabilir.

Bu örnekler ayrıca REC 14'ü takip etmek için anti GST ve anti tıslama antikorları ile Western kan analizine tabi tutuldu. Prosedür boyunca, anti GST lekesi, GST saflaştırma adımından ima edilen proteinlerde tek başına bazı GS TRE 14 ve GST'nin mevcut olduğunu ve kirleticilerin tıslama etiketi afinite saflaştırma adımı ile uzaklaştırıldığını gösterir. Bu leke, GST'nin hassas işlem ve tıslama ttag saflaştırma adımı ile re 14'ten verimli bir şekilde çıkarıldığını ortaya koymaktadır.

Anti tıslama lekesi, re 14'ü tespit etmeyi amaçlar. Bu leke, GST Rec 14 tıslama ve REC 14 tıslamasının tamamen parçalanmadığını ve GST boncuklarından çıkarılmadığını doğrular. Ayrıca, yüksek bir konsantrasyonda REC 14 toplanıyor gibi görünüyor.

Özetle, sunulan sonuçlar, S palm B rec 14'ün saflaştırılması için GST tıslama saflaştırmasının verimliliğini göstermektedir. Bu videoyu izledikten sonra, son derece güzelleştirilmiş bir enerjinin nasıl geri kazanılacağını iyi anlamış olmalısınız. Kombinant protein Bir kez ustalaştı.

Bu teknik, uygun şekilde yapılırsa, çözünür asit dejenerasyonundan 12 saat sonra yapılabilir. Bu prosedürü denerken, bu prosedürü takiben protein bozulmasını önlemek için hızlı ve sıkı bir şekilde dört santigrat derecede çalışmayı unutmamak önemlidir. Kod çökeltme tahlilleri veya kütle spektrometresi gibi diğer yöntemler, protein ortaklarının tanımlanması veya ilgilenilen proteinin translasyon sonrası modifikasyonu gibi ek soruları yanıtlamak için gerçekleştirilebilir.

Bu yöntemi DNA için kullanmamıza rağmen, onarım proteinleri, diğer araştırma alanlarındaki proteinlerin işlevini incelemek için stratejiye göre değiştirilebilir.