İnsan Pluripotent Kök Hücreler Telencephalic glutamaterjik Nöron Şartnamesi

Bu prosedürün genel amacı, insan gelişimi sırasında gözlemlenenlere benzer kontrol noktalarından geçerek insan embriyonik kök hücrelerinden veya H ESC'lerinden sefalik nöronlar üretmektir. Bu, önce HSC'lerin HESC ortamında süspansiyonda kendiliğinden farklılaşmasına izin vererek ve daha sonra daha seçici bir şekilde farklılaşmak için bunları nöral indüksiyon ortamına aktararak gerçekleştirilir. Daha sonra, embriyo cisimciklerinin veya PSC agregatlarının, hücrelerin genişlediği ve tek tabaka halinde farklılaştığı doku kültürü ile muamele edilmiş plakalara bağlanmasına izin verilir.

Morfolojik olarak kilometre hücrelerine benzer nöro epitel hücreleri oluşturan merkezlerle. Daha sonra, nöro epitel hücreleri izole edilir ve nörosferler oluşturdukları süspansiyon kültürlerine yerleştirilir. Son olarak, nörosferler, daha fazla farklılaşabilecekleri kapak fişleri üzerine kaplanır.

Sonuç olarak, immün boyama veya elektrofizyoloji yoluyla oluşturulan spesifik nöron tiplerini gösteren sonuçlar elde edilebilir. Bu tekniğin etkileri, çok çeşitli genetik olarak kalıtsal hastalıklara kadar uzanır, çünkü hastaya özgü nöronlar, etki mekanizmasının yanı sıra potansiyel tedavilerin aydınlatılabildiği indüklenmiş pluripotent kök hücrelerden de üretilebilir. Bu yöntem, pluripotent kök hücrelerden pençe sefalik nöro alt tiplerinin gelişimi hakkında fikir verebilir.

Talon sefalik nöronlarla ilgili insan hastalıkları gibi diğer sistemlere de uygulanabilir İnsan pluripotent kök hücre agregatları oluşturmak için, insan pluripotent kök hücrelerinin, beş ila yedi gün boyunca temel FGF ile takviye edilmiş HESC ortamında fare embriyonik fibroblast besleyicileri üzerinde kültürlenmesiyle başlayın, koloniler büyük olacak, ancak yine de farklılaşmamıştır. Koloniler 50 mililitrelik bir tüpte doğru aşamaya ulaştığında. Metin protokolüne göre D-M-E-M-F 12 ortamında mililitre başına bir miligram dis bölme çözeltisi hazırlayın.

Ortamı hücrelerden aspire edin ve ardından D-M-E-M-F 12 ile bir kez durulayın. Yıkamayı çıkardıktan sonra, her bir oyuğa bir mililitre bölme ekleyin ve 37 santigrat derecede üç ila beş dakika inkübe edin. Üç dakika işaretinde, biraz daha koyu görünen kıvrılmış kenarlar için mikroskop altında kontrol edin.

Gerekirse, hücreleri daha uzun süre inkübe edin. Hücreler hazır olduğunda, dase solüsyonunu çıkarın ve hücreleri ayırmak ve parçalamak için yıkamayı 1,5 mililitre HESC ortamı ile değiştirmeden önce hücreleri bir kez D-M-E-M-F 12 ile yıkayın. 10 mililitrelik bir cam pipetin ucunu hücrelerin üzerine bir kuyunun sağ alt duvarına doğru yerleştirin ve küçük bir yukarı ve aşağı hareketle, ters yöne dönmeden önce kuyu boyunca diğer tarafa doğru hareket edin.

Tüm hücreler süspansiyon haline geldikten sonra, bunları 15 mililitrelik tüplere yerleştirin ve ortamı peletten çıkarmadan önce iki dakika boyunca 200 G'de santrifüjleyin. HESC ortamını kullanarak, hücreleri kültürleme için bir şişeye aktarın. Örneğin, altı HSC kuyusundan gelen hücreler için, 50 mililitre HESC içeren bir T 75 şişesi kullanın. Orta.

Hücreleri 12 saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Hücre kalıntılarını temizlemenin ardından, hücreleri ve ortamı 50 mililitrelik bir tüpe aktarın ve hücreleri 50 mililitre taze ortamla yeni bir şişeye aktarmadan önce bir kez yıkayın. Beşinci güne kadar hücreleri bu şekilde beslemeye devam edin.

Beşinci günde, hücreleri döndürün ve yeni bir T 75 şişesine aktarın. 50 mililitre nöral indüksiyon ortamı veya NIM ile, inkübasyon plakasından sonra her gün NIM'in yarısını değiştirerek iki ila üç gün boyunca inkübe edin, hücreler plakalara plakaya bağlanmalarına yardımcı olmak için laminin veya FBS kullanır. FBS'yi kullanarak, her birine hücreli 1,5 mililitre ortam ekleyin.

Agregaları yaymak ve hücrelerin gece boyunca yapışmasına izin vermek için plakayı hafifçe sallayın. Ertesi gün 37 santigrat derecede, tüm ortamı kuyucuk başına iki mililitre NIM ile değiştirin. Bir veya iki günlük inkübasyondan sonra, her bir agrega bir tek tabaka oluşturacak şekilde yayılacak ve birkaç gün içinde, bu hücrelerin çoğunun merkezleri morfolojik olarak kolumer hücrelerine benzer görünecektir.

Yaklaşık 14 ila 17 gün arasında columer hücreleri daha kompakt görünecektir. Bazen hücreler, içinde görünür bir lümen bulunan sırtlar veya halkalar oluşturur. Hücreleri izole etmeden önce, AB dışı epitel hücrelerinin varlığını inceleyin ve kazımak için bir pipet ucu kullanın.

Kolonilerin merkezinde bulunan nöro epitel hücrelerini izole etmek. Koloninin merkezine kalkması için basınç uygulamak için bir mikro pipet ve steril bir mililitre filtreli pipet kullanın. Koloninin dış kısmının da ayrılmasına izin vermemeye dikkat edin.

İzole edilmiş hücreleri 15 mililitrelik bir tüpe iki plaka değerinde aktarın ve iki dakika boyunca 200 G'de döndürün. Ortamı çıkardıktan sonra, hücreleri 10 mililitre NIM içeren doku kültürü ile muamele edilmemiş bir T 25 şişesine aktarın. Ertesi gün gece boyunca B 27 inkübe edilmesiyle, hücreler küre benzeri bir görünüme sahip olmalıdır.

Bazen periferik hücreler de izole edilir ve genellikle şişenin dibine yapışırlar. Böyle bir durumda, küresel hücreleri yeni bir şişeye aktarın ve bağlı hücreleri kültürün arkasında bırakın. Hücre dayanıklılığını ve çoğalmasını teşvik etmek için NIMB 27'de bir hafta boyunca nöroküreler ve süspansiyon.

Döngüsel A MP ve insülin benzeri büyüme faktörü bir ekleyin. Haftanın sonunda, nörosferler sefalik progenitörler içerecek ve terminal farklılaşması için kapak fişlerine kaplanmaya hazır olacak. 24'te poliüretan laminin kaplı lameller hazırlamak için, kuyucuklu plakalar, temiz lamellerin gece boyunca 37 santigrat derecede mililitre başına 0.1 mililitre poliüretan çözeltisi ile kaplanmasıyla başlar ve lamenterleri nöral farklılaşmada mililitre laminin başına 50 mikrolitre 20 mikrogram laminin ile kaplar

Her poliüretan ile muamele edilmiş kapak kaymasının ortası. Sadece kapağın kendi kendine temas eden sıvıya dikkat edin. Onları bir ila iki saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.

Laminin inkübasyonundan sonra, nörosferleri D-M-E-M-F 12'de toplayın ve yıkayın. Hücreler düzgün bir şekilde bağlanamayacak kadar büyükse, yaklaşık iki mililitre Accutane ekleyin ve hücreleri üç dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Daha sonra, eşit hacimde tripsin inhibitörü ekleyin ve hücreleri üç dakika boyunca 200 G'de santrifüjledikten sonra, çözeltiyi NDM ile değiştirin ve hücreleri küçük kümeler için ayırmak için bir P 200 kullanın.

Bunları önceden kaplanmış lamel kapaklara yerleştirin, besiyerinin çoğunu aspire edin ve hücreleri besiyerinin birkaç damlasında altı santimetrelik bir Petri kabına aktarın, böylece önceden kaplanmış lamel astarlardan laminini çıkarmadan bunları seçmek daha kolay hale gelir. Her birine yaklaşık dört ila beş nöroküre aktarın. B 27 siklik ile desteklenmiş 0,5 mililitre nöro farklılaşma ortamı eklemeden önce nörosferlerin en az iki ila dört saat bağlanmasına izin verin.

Bir MP ve nörotrofik faktörler her gün ortamın yarısını değiştirir. Hücreler burada gösterildiği gibi birkaç ay boyunca korunabilir. Bu protokol, insan PSC'lerinin birkaç kritik adımla pençe sefalik glutamaterjik nöronlara nasıl ayırt edileceğini açıklar.

PSC'nin oluşumu, nöro epitel hücrelerinin indüksiyonunu, talon sefalik progenitörlerin oluşumunu ve bu progenitörlerin pençe sefalik nöronlara terminal farklılaşmasını toplar. Bu sistem, örneğin sefalik, progenitörler ve glutamaterjik nöronların oluşumunda sağlam ve etkilidir. Boyutlandırma faktörlerinin eklenmesi olmadan, HSC'ler nöral soy olarak farklılaştı ve farklılaşmadan 24 gün sonra farklılaştı.

Nöral öncüllerin çoğunluğu Fox G için pozitifti, Sefalon tarafından eksprese edilen bir transkripsiyon faktörü, ancak HOKs B dört için negatifti, arka beyin ve omurilik hücreleri için telon sefalik progenitörlerin başarıyla üretildiğini düşündüren bir belirteç. Bu telon sefalik progenitörler, PAC altı ekspresyonu ile gösterildiği gibi bir dorsal fenotipe sahiptir. Dorsal progenitörler tarafından ifade edilen, ancak NK X 2.1 olmayan bir belirteç Ventral progenitörler için bir belirteç.

Daha fazla farklılaşmayı takiben, bu sefalik dorsal progenitörler, glutamaterjik belirteç için pozitif olan glutamaterjik nöronlara farklılaştı. TBR bir için pozitif olan TBR bir nöronları, nöronal belirteçler beta üç tubulin veya harita iki için de pozitifti. Bu hücreler ayrıca, kültürde pençe sefalik glutamaterjik nöronların verimli bir şekilde üretildiğini düşündüren olgun glutamaterjik nöronlar için bir belirteç olan veziküler glutamat taşıyıcı bir veya V glut bir eksprese etti.

Bu prosedürü takiben, bu nöronların diğer hücrelerle sinaptik bağlantılar kurup kuramayacağı gibi ek soruları yanıtlamak için elektrofizyoloji gibi diğer yöntemler de uygulanabilir. Bu videoyu izledikten sonra, iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. İnsan pluripotent kök hücrelerini birkaç kritik adımla sefalik glutamaterjik nöronlara ayırmak zorunda kaldı.

Pluripotent kök hücre oluşumu, nöro epitel hücrelerinin indüksiyonunu, sefalik progenitörlerin oluşumunu ve bu progenitörlerin sefalik nöronlara terminal farklılaşmasını toplar.