Mikroakışkan Chip İmalat ve İnfluenza Algılama Yöntemi

Aşağıdaki deneyin genel amacı, mikroakışkan bir çip kullanarak influenza A virüsünü tespit etmektir. İlk olarak, virüsü parçalamak ve RNA'yı çıkarmak için numuneyi SPE kanalından lizis tamponu ile çalıştırın, RTPCR reaktifini ekstrakte edilen RNA ile yükleyin ve viral RNA'yı CDNA'ya dönüştürmek için ters transkripsiyon kanalını çalıştırın. Daha sonra, kılcal elektroforezden gelen floresan sinyaline dayalı olarak amplikonun boyutunu ve konsantrasyonunu gösteren DNA sonuçlarını amplifiye etmek için karışımı PCR kanalına çalıştırın.

Bu teknolojinin ana avantajı, ham hasta örneğini kabul etmesi ve nükleik asit ekstraksiyonu, saflaştırma, ters transkripsiyon ve amplifikasyonu tek bir çipe entegre etmesidir İki plak oluşturmak için, yaklaşık dokuz gram XN X peletini metal bir plakanın ortasına eşit olarak dağıtın, beş dakika boyunca 198 derece ısıtılmış bir pres üzerine yerleştirin. Ardından beş dakika daha yavaşça 2.500 PSI'ye basınç uygulayın. Şimdi, 157 santigrat derecede 10 dakika boyunca epoksi kalıp ön ısıtmasının üzerine bir plak yerleştirin ve 10 dakika daha 1000 PSI'ye yavaşça basınç uygulayın.

Ardından, termal eldiven giyerek, plakayı ve kalıbı sıcak presten çıkarın ve ardından plakları soğumadan kalıptan çıkarın. Kabartmalı çipte, her biri girişte, atık portunda ve mikroakışkan kanalın çıkışında birer tane olmak üzere üç delik açın. Daha sonra cipsleri IPA ile yıkayın, ardından RNA'ları ve dianna'nın suyunu alın.

Cipsleri bağlamak için hava ile kurutun, önce 131 santigrat derecede 10 dakika önceden ısıtın ve ardından 350 PSI'da 10 dakika daha bastırın. JB Weld Epoxy'yi kullanarak, giriş atıklarına nano portlar takın ve çıkış portları 15 ila 24 saat boyunca ayrı ayrı kürlenir. Üreticinin talimatlarına göre, SPE kanalını 50 mikrolitre RNA ile ve ardından 100 mikrolitre nükleaz içermeyen su ile durulayın.

Şimdi metakrilat inkübatını bir UV fırında 10 dakika çapraz bağlamak için SPE kanalını dört mikrolitre taze hazırlanmış aşılama solüsyonu ile yükleyin, kalan aşılama solüsyonunu bir vakumla çıkarın. Kapak kapalıyken tüpe vurarak kurutulmuş mikroküre peletini parçalayın. Daha sonra 100 mikrolitre taze hazırlanmış SPE kolon çözeltisi ekleyin ve karıştırmak için girdap yapın.

Dört mikrolitre SPE çözeltisini, her iki tarafta 2,5 dakika boyunca UV ışınlaması ile aynı kanal çapraz bağına yükleyin, bu da opak beyaz polimerize bir SPE kolonu elde edilmesini sağlar. Fazla reaktanları ve intra polimer pirojenik çözücüleri durulamak için kanalı 500 mikrolitre %100 metanol ile yıkayın. Termal olarak iletken bantla çipin altına iki ince film ısıtıcısı takın.

Isıtıcıların yanlarının, Dene süresi boyunca geniş kanalların kenarı ile hizalanması ve ayrı ayrı diz çökmesi gerektiğini unutmayın, her bir çip bandının çıkmaz açık yan kanallarından çipe beş termokupl yerleştirin. Termokuplların yerini sabitlemek için, bir tüpte 96 mikrolitre% 70 etanole ve ikinci bir tüpte% 100 etanole dört mikrolitre 25 XRNA güvenli ekleyin. Ayrıca, 300 mikrolitre kanal tamponu ve 316 mikrolitre lizis tamponu hazırlayın.

Çözeltileri 60 santigrat derecede 15 dakika ısıtın. RNA'yı güvenli hale getirmek, ardından mikroakışkan kanalı dengelemek için. Kanal arabelleğini saatte 0,8 mililitre akış hızında SPE kanalından geçirin.

Şimdi 37 santigrat derecede VTM'de hızlı fava test örneği. Numuneyi çözülür çözülmez çıkarın. Numuneyi 13.000 RPM'de 10 dakika santrifüjleyin.

100 mikrolitre süpernatanı 300 mikrolitre lizis tamponuna aktarın ve mikrolitre taşıyıcı başına bir mikrogramdan altı mikrolitre, karıştırmak için RNA girdabı ekleyin. Sonra beş saniye döndürün ve tüm lizatı bir CC şırıngayı bir yem kilidine yükleyin. Lizatı SPE kanalından saatte 0,8 mililitre akış hızında geçirin.

Daha sonra SPE kanalını 100 mikrolitre% 70 etanol ile yıkayın, ardından saatte bir mililitrede 100 mikrolitre% 100 etanol ile yıkayın. Boş bir şırıngayı 0,5 mililitre işaretine yerleştirin ve saatte bir mililitre kurutmak için havayı kanaldan itin. Şimdi, bağlı nükleik asitleri saatte 0,5 mililitre hızla elüte etmek için kanaldan 67,5 mikrolitre nükleaz içermeyen su akıtın ve atık portundaki nano porttan 13,5 mikrolitre toplayın.

36.5 mikrolitre R-T-P-C-R master yükleyin. Atık portundaki nano portta karıştırın ve 50 mikrolitrelik bir R-T-P-C-R reaksiyonu için şablon RNA ile karıştırın. Ardından R-T-P-C-R karışımını hafif bir vakumla RT kanalına yükleyin.

Nano bağlantı noktasını kapalı bir bağlantı parçasıyla kapatın. Isıtıcıya 35 volt uygulayın. Isıtıcı 50 santigrat derecede dengelendikten sonra reaktifleri 30 dakika RT kanalında tutun.

Isıtıcı 95 santigrat derecede dengelendikten sonra reaktifleri 15 dakika RT kanalında tutun. Daha sonra, ısıtıcıya 27 volt ve ısıtıcıya 50 volt, ısıtıcıyı dengelemek için iki, biri 60 santigrat derecede ve ısıtıcı iki 95 santigrat derecede uygulayın. Reaktifleri dakikada 0,5 mikrolitre hızla PCR kanalına itin.

Yaklaşık 20 dakika sonra reaktifler serpantin kanalının sonuna yaklaştığında, Agilent yüksek hassasiyetli DNA testi için uygun boyutta bir pipetleyici ve uç kullanarak PCR ürünlerini çıkışta toplayın. Testten 30 dakika önce Agilent yüksek hassasiyetli DNA kitini buzdolabından çıkarın. Biyoanalizörü açın ve 2.100 uzman yazılımını açın.

Test için bir mikrolitre PCR ürünü yükleyin ve Agilent protokolünü izleyin. Bu iş akışındaki verileri analiz edin ve kaydedin. Hastanın nazal faringeal örneği lizis tamponu ile karıştırılır ve çipe uygulanır.

Çip çalıştırılır ve influenza virüsünün PCR ürünleri, ticari bir kılcal elektroforez çipi kullanılarak kırmızıdır. Her hastanın örneğindeki farklı miktarlarda influenza virüsü nedeniyle, PCR ürününün nihai konsantrasyonu değişecektir. İyi bir sonuç, pozitif numune için 35 ve 10, 380 baz çiftindeki merdiven tepe noktalarını ve 107 baz çiftinin tasarlanan ürün boyutunda tek bir ürün tepe noktasını temizlemek için düşük gürültüye sahip olmalıdır.

Bu videoyu izledikten sonra, influenza a virüsünü tespit etmek için mikro sıvı çipinin nasıl üretileceğini ve çalıştırılacağını iyi anlamış olmalısınız.