Name: Kemirgen Merkezi Sinir Sistemi İlaçların doğrudan Intraventriküler teslim (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 55 s
Description: Öğrenin, kemirgenlerde merkezi sinir sistemine ilaç teslimi için kateter implantasyonu ve bolus enjeksiyonu yöntemlerini. Antisens oligonükleotidlerin etkili dağılımı bu tekniklerle sağlanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Biz Asos ile laboratuar sağlamak için bir bütün olarak ICV bolus cerrahi ile ilgili, hem de Isis İlaç tavsiye sağlamak için Isis Pharmaceuticals Curt Mazer teşekkür etmek istiyorum. Ayrıca, biz bu makaleye için Carey Shaner teşekkür etmek istiyorum. TMM ve SLD NIH Hibe P50AG005681, K08NS074194 ve R01NS078398 tarafından desteklenmektedir.

Aşağıdaki protokol St Louis Washington Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komiteleri tarafından onaylanmış ve Deney hayvanlarının kullanımı için Sağlık kuralları Ulusal Sağlık Enstitüleri uygun değil. Bu cerrahisine ilk defa ise, biz 14 başlamadan önce bir giriş olarak kemirgen operasyonlarında vallahi makale bakarak öneririz. Asos ozmotik pompa infüzyon ve tek ICV bolus hem boyunca fare MSS teslim edilebilir. Bu nedenle, aşağıda ayrıntılı prosedürü iki parça halinde kadar bozuldu. Her yöntem için artılarını ve eksilerini Tartışma bölümünde değinilecektir. Protokolleri kullanılan koordinatları yetişkin C57BL6 ve B6C3 fareler içindir. Sorumlu sıçan koordinatları Tablo 1&#39;de bulunabilir. Alzet ozmotik POMPA 1. Alzet Ozmotik Pompalar hazırlanması <ol><li> Steril bir drap uzandıE ve doğrudan kısırlık korumak için bir şey dokunmamaya dikkat çekerken dikkatle üzerine aşağıdaki öğeleri bırakın: ozmotik pompa (lar), akış modülatörü (ler), 1 ml steril şırınga (ler), neşter bıçak ve boru bölümleri (boru = 5 pompa 1 adet). 14 gün, 28 gün ve 42 gün (Şekil 2A): fareler için, pompalar için üç seçenek vardır. </li><li> Kapağını çıkarın ve 15-20 ml serum fizyolojik ile steril 50 ml konik tüpler doldurun. Kadar 6 monte pompa konik tüp başına eklenebilir. </li><li> % 100 etanol ile bir p60 Petri kabı doldurun. Etanol kateter uygun sayıda ekleyin. Fareler için, kateter uzunluğu 2.5 mm&#39;dir. </li><li> Gerekli olduğu kadar çok 1.5 ml lik Eppendorf tüpleri içine her ASO filtre. Tüp doldurmak için steril% 0.9 tuzlu su ile dolu bir Eppendorf tüpü içerir. </li><li> Her şey hazırlandıktan sonra, steril eldiven koymak. Steril olmayan bir şey dokunmamaya dikkat edin. Gerekirse eldiven değiştirin. </li><li> Her ASO kullanılmak üzere, bir 1 ml şırınga dolguve üst deliğe iğne yerleştirerek ve yavaş yavaş kadar aşırı sızıntı doldurarak loadpumps. Pompaların doldurulana kadar devam edin. </li><li> Akış modulatöru kapağını çıkarın ve pompa takın. Bir 3-5 mm boşluk bırakarak, hemen hemen tüm yol akışını-modülatör itin. </li><li> Neşter bıçak kullanarak, 5 eşit parça halinde boru her parça kesti. Hortumun bir parça alır, bir 1 ml şırınga kullanarak steril tuzlu su ile doldurun ve Hortumun bir ucunu akış modülatör üst yerleştirin. Daha sonra etanolden bir kanül almak ve borunun diğer ucuna bağlanmalıdır. Pompa şimdi tam monte edilir. </li><li> Astar için tuzlu su ile steril bir 50 ml&#39;lik konik bir tüp içine tam olarak monte edilmiş pompa yerleştirin. Astar ilaç dağıtım başlatmak için sıvı içinize yanı sıra uygun sıcaklığa gelmesini pompalar için izin verir. Astar süresi: 14 gün pompalar: 4-6 saat, 28 gün pompalar: 40 saat, 42 gün pompalar: 60 saat. Pompa montajı bittiğinde, bir temiz konik tüpler ve yer kap37 ° cerrahi kadar C su banyosu. </li></ol> 2. Ön cerrahi Prosedürü <ol><li> Alan sterilize ve steril bir alan oluşturmak için masa üstü ve stereotaksi üzerine steril örtüler bırakmaya% 70 etanol ile her şeyi silin. Bu, tüm ameliyat boyunca steril alanın dikkatli olmak önemlidir. Aşağıdaki açın: Boncuk Sterilizatör, ısıtma pedi, Işık, Dijital Okuma ve Oksijen / İsofluranın Sistemi (Şekil 1). </li><li> Forseps 1 çift, 1 kavisli hemostat, küçük makas 1 çift, küçük kavisli künt makas 1 çift, 1 sıçan kemik kesici: Tek bir ameliyat veya bir bütün toplu ameliyatları rutin gibi birini yaparak, aşağıdaki öğeleri gerekecektir , 1 düz hemostat, 5-0 naylon sütür,% 70 etanol ile 1 konik tüpler,% 95 etanol ile 1 konik tüp, iyot ile 1 konik tüp, hidrojen peroksit ile 1 konik tüp, steril pamuklu paket, süper 1 şişe tutkal, 1 tüp antibiyotik merhem, göz 1 tüpyağ ve 1 elektrikli tıraş makinesi. </li><li> 15 saniye için boncuk sterilizatör içine makas, forseps, ve kavisli hemostatı iki çift ipuçları yerleştirin. Çıkarın ve% 70 etanol içinde. Birden fazla ameliyat yaparken, hayvanlar arasında araçların ipuçları yeniden sterilize. </li><li> % 4 izofluran ve O 2-0,4 L / dk ve odasına doğrudan gaz akışını açın. Biz anestezi uygun miktarda teslim olmasını sağlamak için yılda en az bir kalibre bizim izofluran / oksijen sistemi var. Yeri odasında fare ve nefes kadar beklemek önemli ölçüde yavaşlar. Fareyi çıkarın ve fare tamamen bilinçsiz olmasını sağlamak için bir ayak tutam gerçekleştirin. </li><li> Kadar göz arasında &#39;de omuz üstünden saç tıraş. Fare uyanmak başlarsa fare bir ayak tutam ile teyit, yine tamamen bilinçsiz kadar, odasına geri fare yerleştirin. Stereotaksi üzerine anestezi fare yerleştirin ve burun üzerinde burun konisi itin.Dişleri ve kemikleri kırılgan gibi nazik olun. </li><li> Fare anestezi tutmak için stereotaksi için gaz akışını yönlendirmek. Bu zaman zaman fare ameliyat boyunca bir ayak tutam tamamen bilinçsiz olduğundan emin olmak için kontrol etmek önemlidir. Kulak çubukları ile baş sabitleyin. Biz lateral ventrikül hedef olsa da, kulak çubukları tesviye tercih, mükemmel düzeyde kafatası nedeniyle ventrikül büyük olması gerekli değildir. </li><li> Bakım için% 2.0 için izofluran seviyesini aşağı çevirin. Her bir göz damlasını, göz merhemi. Videoda görüldüğü gibi boyun ve baş sadece temel maruz böylece, fare üzerinde bir steril örtü yatıyordu. Daha sonra traş alanının merkezinde başlayan ve çubuk çubuk iyot batırılmış bir pamuk takip,% 95 etanol batırılmış bir pamuk ile ilk dışa doğru hareket eden bir dairesel hareketlerle baş ve boyun üst silerek cerrahi alan dezenfekte edin. </li><li> Biz sağlayan bir rektal prob geri besleme sıcaklık kontrollü ısıtma sistemi kullanmanızı öneririzfare sıcaklığı istikrarlı bir 37 ° C &#39;de devam Fare sıcaklığı ameliyat sırasında azalırsa, ameliyat sonrası iyileşme daha uzun sürebilir ve ortaya çıkan hipotermi protein Tau 15 ilişkili mikrotübül bir hiperfosforilizas dahil olmak üzere, anormal protein aktivite yol açabilir. Isıtma sistemi kurduktan sonra, artık ameliyat için hazırız. </li></ol> 3. Alzet Ozmotik Pompa implantasyonu <ol><li> Ameliyat başlamadan önce, steril eldiven yeni bir çift koymak. Daha sonra, forseps ve makas küçük bir çift kullanarak, gözler arasında en fazla hayvanın kafatası üzerinde boyun tabanından deride bir kesi yapmak </li><li> Yukarı bakacak şekilde eğrisi ile künt makas alın ve sol bacak doğru boyun sırt dibinde cilt altında kaydırın. Hiçbir direniş olmalıdır. Varsa, makas kaldırıp tekrar deneyin. Bu, ozmotik pompa için deri altı cep oluşturur. </li><li> Wipe bir pamuklu çubukla takip steril pamuklu çubukla temiz kafatası, bregma geliştirmek için hidrojen peroksit batırılmış. </li><li> Pompaların sterilite korumak için pompaları içeren 50 ml konik tüpler silin. Dikkatlice pompa konik tüp kenarlarına temas edip etmediğini özen göstererek, kavisli hemostat kullanarak konik tüp bir pompa almak. Forseps ile pompanın tabanı tutun ve kavisli hemostatla şekilde geri kalanında akış modülatör itin. </li><li> Akış modülatör ve boru kavisli hemostat ile bir araya pompa tutun. Boyun dibinde deri altına pompa takın ve şu ana kadar bu direniş olmadan gidecek gibi sol bacak doğru geri itin. Kateter dokunmatik bir şey izin için dikkatli olun. </li><li> Kavisli hemostatla, üst kaide karşılayan oluk de kanül kapmak. Yerine kanül sürücü hareket ettirin ve yerine sabitleyin. </li><li> Kanül baz süper yapıştırıcı bir damla yerleştirin. Irinh sürücü ve boru düz geri işaret böylece pozisyona kanül üst. </li><li> Bregma için kateter ucu dokunun ve Dijital ekranda koordinatları sıfır. Kateter kaldırın ve sağ-arka 0.5 mm (Şekil 2B) yanal olarak 1,1 mm hareket etmektedir. Kavisli hemostatla yolumdan cilt tutun. </li><li> Plastik kanül tabanı güvenli bir kafatasının üst karşı basılana kadar kafatası ile ince metal kateter sürün. Metal kateter göreli ince kafatası nedeniyle farelerde kafatası doğrudan sürülebilir. Sıçan kullanıyorsanız, kateter indirmeden önce kafatasında bir delik açın. </li><li> Uzak kafatası Üzerinde yapışkan olan herhangi bir cilt çekin. Yerine kanül / kateter tutan kanül sürücü ile, tam kuru tutkal için 1-2 dakika bekleyin. </li><li> Kateter yerleştirme değerlendirmek için, pratik zaman, boru (Şekil 2C) ile% 2.5 FastGreen Boya 20-40 ul enjekte. 2-3 dk, Perfüzyonun bekleyin1X PBS 0.03% heparin ile e fare, ve beyin çıkarın. Kateter yerinde koronal kesin. Kateter ventriküle yerleştirildi durumunda, boya fare ventriküler sistemine (Şekil 2B) boyunca perfüze edilir. </li><li> Sürücü yükselterek kavisli hemostatla kateter yerinde tutun. Yavaşça kanül düzgün kafatasına güvenli olduğundan emin olmak için hemostat bırakın. </li><li> Bir pamuklu çubukla, kanül üst bastırın. Kanül üst ve taban arasındaki koru içine sıçan kemik kesme makineleri takın. Hala pamuklu çubukla tuşuna basılı iken kanül üst kapalı klibi. Kesme seviyesi denemek ve devam böylece kafatası kanül ayırmak için değil. Kanül Neşesiz geliyor yoksa, hızlı bir şekilde yeniden yapıştırıcı ve ek 2 dakika süreyle bir pamuklu çubukla basınç uygulayın. </li><li> Sağ kanül üzerinde ekstra dikkat, 5-0 dikiş ipliği, düzenli hemostat ve forseps, tam açılış boyunca dikiş kullanma. Bir runnin kullanınkafatası üzerinde büyük bir kesi nedeniyle g yatay yatak sütür (bkz. Şekil 5). </li><li> Baş ve boyun antibiyotik merhem bir dab uygulayın. Sökün kulak çubukları ve burun konisi gevşetin. Kurtarma için bir ısınma pad üzerinde stereotaksi ve yerden fareyi çıkarın. Tipik olarak 10-30 dakika arasında değişen, iyileşme süresi boyunca yakından fareler izleyin. Fare dolaşıyor ve kendisini tımar başlayana kadar her 2-3 dakikada bir kontrol edin. </li></ol> 4. Ameliyat sonrası Bakım <ol><li> Ilk hafta için ameliyat sonrası günlük fareler izleyin. </li><li> Bir fare ağrı veya sıkıntı gibi görünüyor, biz ağrı gidermek için en fazla 5 gün boyunca her 24 saat bir kez Carprofen bir 5 mg / kg deri altı enjeksiyonu ile fare sağlayan tavsiye ederiz. </li><li> Bir enfeksiyon olması görünüyorsa, cömertçe günlük bölgeye antibiyotik merhem uygulamak ve yara doğru iyileşir sağlamak için bir Katılan Veteriner danışın. </li><li> R5-0 naylon dikiş dikiş ipliğinin gelen tahrişi önlemek için ameliyat sonrası 7-10 gün kaydının silinmesi. </li></ol> 5. Alzet Ozmotik Pompa değiştirme veya kaldırma Pompa aktif ASO beslerken yapıldıktan sonra, ya değişti ya da tamamen kaldırılabilir. <ol><li> Aşağıdaki değişikliklerle yukarıda aynı ön-cerrahi prosedürü takip edin: 1) Eğer kavisli makas, eğri hemostat, sıçan kemik kesiciler, ne de Dijital Ekran gerekmez, ve fare yerine başkanı hazırlıyor 2), tıraş ve Pompa ve boru kavşağında fare arka dezenfekte. </li><li> Forseps ve makas kullanarak, dik pompa / boru kavşak, fare arkasında bir 1.5 cm kesi olun. Dikkatle önemli ölçüde çekerek / bu kateter kavanoz olabilir boru üzerinde koymadan kesi dışarı pompa çekin. </li><li> Pompayı kaldırmak için, hakkında 0.5 cm akışını modülatörü üzerindeki boru klibi ve boru t yapıştırıcı temaso mühür onu kapattı. Kuru tutkal için 1-2 dakika bekleyin. Boru geri kesi ve dikiş kapalı içine yerleştirin. Sütüre cilt ve yer ısıtılmış bir kurtarma pad üzerinde fareyi üzerine dab antibiyotik merhem. </li><li> Pompa değiştirmek için, taze% 95 etanol ile dolu bir 10 cm tabak birlikte pompa hazır hale gelmiştir. Kateterler yeni pompa ile gerekli değildir. </li><li> Forseps ile yeni bir pompa tut. Etanol içine parmaklarınızı batırın, pompa tutun, ve akış-modülatör atın. Daha sonra, dikkatlice ve yavaşça tüp ve kanül bağlı akış modülatöründen eski pompa çekin. En kısa sürede onu olduğu gibi, yavaş yavaş akış modülatörü Farenin dış ile hiç temas etmez sağlamak, üzerinde yeni pompa kaydırın. </li><li> Deri altı paket ve dikiş cilt geri kesiden yeni pompa yeniden takın. Kurtarma pad üzerinde yara ve yerde fare dab antibiyotik merhem. </li><li> Sadece pompa implantasyonu olduğu gibi, p kontrol etmek için ameliyattan sonra günlük fareler izlemekain / rahatsızlık ve enfeksiyonlar. Gerekli gördüğü gibi Carprofen ve antibiyotik ile tedavi. </li></ol> ICV BOLUS 6. Ön cerrahi Prosedürü <ol><li> , 2) ile sterilize edilmiş su ve yük ile 10 ul Hamilton şırınga ve iğne temiz 1) kavisli makas, eğri hemostat ya da fare kemik kesiciler gerekmez: aşağıdaki değişikliklerle birlikte yukarıda Bölüm 2&#39;de olduğu gibi aynı önceden cerrahi prosedürü izleyin ASO ve 3) kanül sürücü bulunduğu stereotaksik aparat için şırınga ve iğne takın. </li></ol> 7. ASO Bolus Enjeksiyon <ol><li> Forseps ve makas küçük bir çift kullanarak, gözler arasında en fazla boyun tabanından bir kesi yapmak. </li><li> Çubukla bregma geliştirmek için hidrojen peroksit batırılmış bir pamuk takip steril pamuklu çubuk, temiz kafatası silin. </li><li> Yerine şırınga / iğne taşımak ve güvenli. İğnenin kesik kısmı arka baktığından emin olun. Altiğne Bregma dokunduğu kadar. Koordinatları tüm Zero. Doğru 1.0 mm ve 0.3 mm anterior (Şekil 3A) yanal olarak iğne hareket ettirin. </li><li> Iğne deliği kafatasının üst ile aynı hizada sadece kadar yavaşça kafatası yoluyla iğne sürücü. Yine, bu fare kafatası inceliği nedeniyle yapılabilir. Z-koordinat sıfır, 1 mm / saniye (Şekil 3B) bir oranda -3.0 mm iğne düşük. Iğnenin mühür beyin için 2-3 dakika bekleyin. </li><li> Saniyede 1 ul&#39;lik bir oranda ASO tam 10 ul sağlar. 2-3 dakika bekleyin. Bu oran farklı ilaçlar arasında farklılık olsa Biz, ventrikül içine Asos için 1 ul infüzyon hızı kullanın. Çalışma sırasında,% 2.5 FastGreen Boya 10-20 ul sunarak iğne doğru yerleştirilmesi için kontrol edin. Boya infüzyon kısa bir süre sonra 1X PBS 0.03% heparin ile fare serpmek ve boya ventriküler sistemi (Şekil 3C) olduğunu doğrulamak için beynin koronal bölümleri yapmak. </li> &lt;li&gt; iğne tabanında kafatası karşı bir pamuklu çubuk tutun. Saniyede 1 mm bir oranda iğne kaldırın. En kısa sürede iğne kafatası dışında olduğu gibi, iğne deliğinin üzerine pamuklu rulo ve dışarı sızmasını herhangi ASO önlemek için 1 dakika tutun. </li><li> , Kapalı deri dikin antibiyotik merhem uygulamak, ve ısıtmalı kurtarma pad üzerinde yer fare. ASO konsantrasyonuna bağlı olarak, tamamen kurtarmak için birkaç saat için 20 dakika sürebilir. </li><li> Sadece pompa implantasyonu gibi, ağrı / rahatsızlık ve enfeksiyon kontrol etmek için ameliyat sonrası günlük fareler izlemek. Gerekli gördüğü gibi Carprofen ve antibiyotik ile tedavi. </li></ol>

<ol><li>Crooke, S. T., Bennett, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+in+antisense+oligonucleotide+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Pharmacology+and+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Progress in antisense oligonucleotide therapeutics.</a> Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 36, 107-129 (1996).</li>
<li>Sazani, P., Kole, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+potential+of+antisense+oligonucleotides+as+modulators+of+alternative+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Therapeutic potential of antisense oligonucleotides as modulators of alternative splicing.</a> The Journal of Clinical Investigation. 112 (4), 481-486 (2003).</li>
<li>Taylor, J. P., Hardy, J., Fischbeck, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxic+Proteins+in+Neurodegenerative+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Toxic Proteins in Neurodegenerative Disease.</a> Science. 296 (5575), 1991-1995 (2002).</li>
<li>Ross, C. A., Poirier, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+aggregation+and+neurodegenerative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Protein aggregation and neurodegenerative disease.</a> Nature Medicine. 10, S10-S17 (2004).</li>
<li>Miller, T. M., Smith, R. A., Kordasiewicz, H., Kaspar, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene-Targeted+Therapies+for+the+Central+Nervous+System%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Gene-Targeted Therapies for the Central Nervous System.</a> Archives of Neurology. 65 (4), 447-451 (2008).</li>
<li>Vickers, T. A., Koo, S., Bennett, C. F., Crooke, S. T., Dean, N. M., Baker, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+Reduction+of+Target+RNAs+by+Small+Interfering+RNA+and+RNase+H-dependent+Antisense+Agents%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Efficient Reduction of Target RNAs by Small Interfering RNA and RNase H-dependent Antisense Agents.</a> The Journal of Biological Chemistry. 278, 7108-7118 (1074).</li>
<li>Smith, R. A., Miller, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antisense+Oligonucleotide+therapy+for+neurodegenerative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Antisense Oligonucleotide therapy for neurodegenerative disease.</a> The Journal of Clinical Investigation. 116 (8), 2290-2296 (2006).</li>
<li>Rosen, D. R., Siddique, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+Cu%2FZn+superoxide+disumutase+gene+are+associated+with+familial+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mutations in Cu/Zn superoxide disumutase gene are associated with familial amyotrophic lateral sclerosis.</a> Nature. 362, 6415-62 (1993).</li>
<li>Haidet-Phillips, A. M., Hester, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytes+from+familial+and+sporadic+ALS+patients+are+toxic+to+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Astrocytes from familial and sporadic ALS patients are toxic to motor neurons.</a> Nature Biotechnology. 29, 824-828 (2011).</li>
<li>Furukawa, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathological+roles+of+wild-type+Cu%2CZn-superoxide+dismutase+in+Amyotrophic+Lateral+Sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology+Research+International%22%5BJournal%5D)">Pathological roles of wild-type Cu,Zn-superoxide dismutase in Amyotrophic Lateral Sclerosis.</a> Neurology Research International. 2012, 1-6 (2012).</li>
<li>Hua, Y., Sahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antisense+correction+of+SMN2+splicing+in+the+CNS+rescues+necrosis+in+a+type+III+SMA+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">Antisense correction of SMN2 splicing in the CNS rescues necrosis in a type III SMA mouse model.</a> Genes and Development. 24, 1634-1644 (2010).</li>
<li>Passini, M. A., Bu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antisense+Oligonucleotide+Delivered+to+the+Mouse+CNS+Ameliorate+Symptoms+of+Severe+Spinal+Muscular+Atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Antisense Oligonucleotide Delivered to the Mouse CNS Ameliorate Symptoms of Severe Spinal Muscular Atrophy.</a> Science Translational Medicine. 3 (72), (2011).</li>
<li>Kordasiewicz, H. B., Stanek, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sustained+Therapeutic+Reversal+of+Huntington%27s+Disease+by+Transient+Repression+of+Huntingtin+Synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Sustained Therapeutic Reversal of Huntington's Disease by Transient Repression of Huntingtin Synthesis.</a> Neuron. 74 (6), 1031-1044 (2012).</li>
<li>Pritchett-Corning, K. R., Mulder, G. B., Luo, Y., White, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+Rodent+Surgery+for+the+New+Surgeon%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Principles of Rodent Surgery for the New Surgeon.</a> J. Vis. Exp. (47), e2586(2011).</li>
<li>Planel, E., Richter, K. E. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anesthesia+Leads+to+Tau+Hyperphosphorylation+through+Inhibition+of+Phosphatase+Activity+by+Hypothermia%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Anesthesia Leads to Tau Hyperphosphorylation through Inhibition of Phosphatase Activity by Hypothermia.</a> The Journal of Neuroscience. 27 (12), 3090-3097 (2007).</li>
<li>Southwell, A. L., Skotte, N. H., Bennett, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antisense+oligonucleotide+therapeutics+for+inherited+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Antisense oligonucleotide therapeutics for inherited neurodegenerative diseases.</a> Trends in Molecular Medicine. , In press, corrected proof (2012).</li>
<li>Kole, R., Krainer, A. R., Altman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+therapeutics%3A+beyond+RNA+interference+and+antisense+oligonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">RNA therapeutics: beyond RNA interference and antisense oligonucleotides.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 11, 125-140 (2012).</li>
</ol>

Yazarlar, Isis Pharmaceuticals kendi anti-his oligonükleotidler alır.

Video gösterildiği gibi MSS küresel ilaç teslim yeteneği hem öğrenmek ve kullanımı kolay son derece güçlü bir tekniktir. Uygulama ile, bir tek pompa implantasyonu veya ICV bolus aynı zamanda tedavi edilmesi farelerin büyük kohort için izin, 10 dakika içinde tamamlanabilir. Fare davranış için daha fazla sayıda önemli farklılıklar görmek yardımcı olmak için önemli olduğu gibi bu, bir davranış okuma ile çalışmalar için özellikle yararlıdır. Pompalar ve bolus enjeksiyon yoluyla Asos teslim bizim deneyimlerine dayanarak, biz her yöntem için bazı artıları ve eksileri gözlemledik. Bu laboratuarımızda görüşleri ve tüm fare ve sıçan modelleri için doğru olmayabilir unutulmamalıdır. Bu pompa kullanılmasının bir avantajı, ASO zaman çok daha uzun bir süre boyunca dağıtıldığı için, ASO yüksek bir miktar vermek için yeteneğidir bulabilirsiniz. Bu genellikle aktif sonra uzun süreli demonte veya yapıştırma eşittirASO infüzyon, ama bu her zaman böyle olmayabilir. Pompaları da ASO teslimat kesin bir zaman dilimi (14 gün, 28 gün, 42 gün) için izin verir ve pompalar da uzun süre aktif ASO enfüzyon izin vermek için bir kez değiştirilebilir. Bununla birlikte, birden fazla pompa değişen düzgün bir emici-akışkan pompa önlemek pompasının çevresindeki lifli cepleri oluşumu nedeniyle değişkenlik artırdığını fark ettik. Pompa bir dezavantajı, bir farenin hem de diğerleri pompa tolere kalmamasıdır. Çalıştığınız transgenik hat daha kırılgan ise, bir pompa çok hantal olabilir. Pompalar başka cerrahi ve katma anestezi fareler tabi, son infüzyon sonra kaldırılması gerekir. Davranışı işi, bu pompa kaldırmak ve pompanın varlığı, farelerin bazı davranışlarını etkiler çünkü geri en az 1-2 hafta içinde izin vermek için özellikle önemlidir. ICV bolus enjeksiyonları ile, bir avantajı maliyetidir. Bir varayarlıyoruz yatırım şırınga ve iğneler satın almak, ama satın almak için pompa / boru / kateter hiç olmadığından zaman içinde, bolus enjeksiyonları daha maliyet-etkilidir. Genel olarak, kanül ve pompalar eksikliği nedeniyle ICV bolus enjeksiyonları ile yukarı tutmak daha az bulunmaktadır. Ayrıca ICV bolus genç ve / veya daha kırılgan farelere Asos sunmak için kullanılabileceğini bulmak. ICV bolus bir dezavantajı, tek bir enjeksiyon olmasıdır. Kadar genel ASO bu rota üzerinden teslim edilebilir ve kullanılan ASO etki süresi kısa ise, demonte / yapıştırma etkileri de kısa ömürlü olacak değil. Ozmotik pompalar gibi ICV hem de büyük hap Ásos teslim etmek yeteneğine sahip olduğunu olabilir demonte proteinler ya da bütün kemirgen MSS genlerin yapıştırma, çoklu nörolojik ilgili alanlarda geniş uygulama alanı vardır bir teknik değiştirebilir. En iyi s için uygundur uygulama hangi yol emin değilseniz Biz teslimat her iki yöntem pilot öneririzpecific çalışma.

Bazı ilaçlar doğrudan Merkezi Sinir Sistemi (MSS) teslim gerektiren, kan beyin bariyeri (KBB) çapraz edemiyoruz. BBB aşmak için, ilaç tarif edilen yöntemler kullanılarak, beyin içine doğrudan teslim edilebilir. Laboratuar ve anti-his oligonükleotidler ile ilgili kağıt detaylı tarifnamede odaklanma (Ásos) gibi küçük moleküller, antikorlar, gene terapi vektörleri, vb. Gibi diğer ilaçlar, aynı zamanda aynı yaklaşımla iletilebilirken. Bazı proteinlerin nörodejeneratif hastalıkların patogenezinde bir rol oynamaktadır. Bu proteinler genellikle nihai nöronal ölüm ve daha sonraki nörolojik hastalık 3-4 yol, agrega zehirli türler oluşturur ve birikir. Bu hastalıkların ilerlemesini yavaşlatmak ya da durdurmak için bir çaba, bir tedavi seçeneği doğrudan hedef ve neden olan protein azaltmak için olabilir. Bununla birlikte, bu proteinler çoğu zaman zor hale e, merkezi sinir sistemi boyunca her yerde her zaman bulunur<html> v erimli küresel ölçekte onları hedef. Tüm MSS boyunca genlerin hedef için, biz BBB atlamak için lateral ventrikül ile fare beyin omurilik sıvısı (BOS) içine Asos yönetmek. Bu özel yöntem Asos yaygın dağıtımı sağlayan, tüm beyin ve omurilik banyoları fare ventriküler sistemi yararlanır. Biz demonte yol açan mRNA aşağılamak veya B) alternatif yapıştırma 1 kaydırmak için ya A) işe RNaz-H, ASO kimyasal değişiklikler bağlı olarak, doğrudan hedef mRNA dizisi bağlamak 18-20 mer RNA benzeri moleküllerdir Asos kullanın ve , 2,16,17. Bu, birden fazla shRNA moleküller de dahil olmak üzere, in vivo olarak belirli bir protein devrilmesi için var olduğunu belirtmek gerekir. Bu moleküllerin bu makalenin odak değildir yana, makaleler yorumlayan okuyucu yönlendiren Daha çok detay demonte etki mekanizmaları ve her 5-6 avantajları / dezavantajları. önceki çalışmada jove_content &quot;&gt;, biz Amyotrofik Lateral Skleroz (ALS) 7 (Şekil 4) bir transgenik fare modelinde protein süperoksit dismutaz 1 (SOD1) hedef Asos kullandık. SOD1 mutasyonlar gerçekleşen tüm ALS yaklaşık% 2 durumlarda 8, son zamanlarda SOD1 başlangıcı belirgin 7 artış sonra ALS transgenik fare, hayatta kalma toplam SOD1 seviyeleri azaltarak de 9-10. sporadik ALS önemli bir rol oynayabilir öne sürülmüştür rağmen. Bu önemli verileri ilk idi MSS bir ASO tedavi nörolojik bir hastalık modeli üzerinde derin olumlu bir etkisi olabileceğini göstermek için. O zamandan beri, insan SOD1 hedeflenmektedir Asos minimal yan etkileri (Clnicaltrails.gov NCT01041222) ile girmiş ve başarılı bir şekilde, insan klinik Faz tamamlamış , gibi Nöroloji 2012 64 inci yıllık Amerikan Akademisi&#39;nde sundu. II çalışmalarda Faz ileri Asos taşımak için Planları şu anda devam etmektedir. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; SOD1 nörolojik bir hastalığı tedavi etmek için Asos kullanarak ilk gösteri oldu hedeflerken, diğer bazı çalışmalarda bu yana farklı hastalıklar ve kendi protein hedeflerine bakarak yapılmıştır. 2010 ve 2011 yılında, o Asos motor nöron 2 (SMN2) protein hayatta kalma kayması ekleme spinal kas atrofi (SMA) transgenik fare modellerinde kullanılan ve hastalık fenotipleri 11,12 önemli bir iyileşme ile sonuçlanmıştır. Bu yapıştırma Asos Faz şimdi SMA çocukların (Clinicaltrails.gov NCT01494701) I klinik çalışmalar vardır. Ayrıca, son zamanlarda huntingtin protein düzeyleri başlangıç ​​13 döndü sonra bile, huntingtin gen karşı hedef Asos geçici yönetimi önemli ölçüde Huntington fare modeli kurtarmak için mümkün olduğu gösterilmiştir. Bu çalışmaların tümünde, Asos ile toplam gen düzeyleri azaltmak veya gen ekleme değiştirme lateral ventrikül teslim edilditüm merkezi sinir sistemi. Ozmotik pompalar ve tek bir bolus enjeksiyon, her ikisi de CSF Ásos sunmak için de kullanılabilir. Intraserebroventriküler (ICV) bolus hızlı, tek seferlik enjeksiyon ise Pompalar, yavaş, sürekli teslimat için izin verir. Biz tek bir transgenik doğrultusunda pompa ve bolus arasındaki doğrudan bir karşılaştırma rapor değil olsa Biz, başarı ile bu yöntemlerin her ikisi de kullandık. MSS Asos kullanan toplam protein düzeyleri ve / veya birkaç proteinlerin değişimi yapıştırma azaltmak için güçlü bir yoldur. Biz nörolojik hastalıkları için bir tedavi olarak sadece Asos kullanırken, diğer alanlar da bu tekniği yararlanabilir farkındayız. Ilgi protein sürece MSS ifade ve nihai hedefi göstermiştir teknikleri Asos kullanılarak gen ifadesinde MSS çapında değişiklikler, elde etmektir gibi çok yararlı olabilir.

<table><tbody><tr><td colspan="4">ALZET OZMOTİK POMPALARIN HAZIRLANMASI</güçlü> </td></tr><tr><td>Alzet Ozmotik Pompa 14 gün</td><td>DURECT</td><td>Model 1002</td><td></td></tr><tr><td>Alzet Ozmotik Pompa 28 gün</td><td>DURECT</td><td>Model 2004</td><td></td></tr><tr><td>Alzet Ozmotik Pompa 42 gün</td><td>DURECT</td><td>Model 2006</td><td></td></tr><tr><td>2,5 mm Kateterler</td><td>PlasticsOne</td><td>3280PM/SPC</td><td>Özel sipariş 2,5 mm Kateter Uzunluğu</td></tr><tr><td>Vinil Kateter Boru</td><td>DURECT</td><td>7760</td><td>ID: 0.027 ", OD: 0.045"</td></tr><tr><td>% 0.9 Sodyum Klorür, Sulama, USP</td><td>Baxter</td><td>2F7124</td><td>Pompalarda veya borularda KULLANILMAMALI</td></tr> %<tr><td>0.9 Sodyum Klorür, Enjeksiyon, USP</td><td>Hospira</td><td>NDC 0409-4888-10</td><td></td></tr><tr><td>p60 Petri Kabı (Sterilize)</td><td>TRP</td><td>93060</td><td></td></tr><tr><td>Cerrahi Bıçaklar (Steril)</td><td>Butler Schein</td> <td># 007319</td><td></td></tr><tr><td>Lateks Cerrahi Eldiven (Steril)</td> <td>Mikro Dokunuşlu</td><td></td><td>Kedi Hayır, gereken eldivenin boyutuna bağlı olacaktır</td></tr><tr><td>Steril Havlu Örtüsü</td><td>Dynarex</td><td>4410.2um</td><td></td></tr> <tr><td>Şırınga Filtreleri</td><td>PALL</td><td>4192</td><td></td></tr><tr><td>1 ml Şırınga (Steril)</td><td>BD</td><td>309625</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Konik Tüpler</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>%100 Ethanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">PUMP & BOLUS CERRAHİSİ PROTOKOLLERİ</güçlü> </td></tr><tr><td>Kavisli Forseps</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>11001-12</td><td></td></tr><tr><td>Kavisli Hemostat</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>13009-12</td><td></td></tr><tr><td>İnce Keskin Makas</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>14060-09</td><td></td></tr><tr><td>Kavisli Künt Makas</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>14029-10</td><td></td></tr><tr><td>Kemik Kesici</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>16104-14</td><td></td></tr><tr><td>Düz Hemostat</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>12002-12</td><td></td></tr><tr><td>Şırınga</td><td>Hamilton</td><td>7653-01</td><td>10 &mu; l çıkarılabilir iğneler ile gaz geçirmez</td></tr><tr><td>İğneler</td><td>Hamilton</td><td>7758-04</td><td>26 gauge, Nokta Stili: 2</td></tr><tr><td>5-0 Naylon Sütür İpliği</td><td>Covidient</td><td>SN-871</td><td></td></tr><tr><td>Alkol Pedleri</td><td>Select</td><td>#521</td><td></td></tr><tr><td>Pamuklu Çubuklar (steril)</td><td>Püriten</td><td>REF 806-WC</td><td></td></tr><tr><td>Süper Yapıştırıcı</td><td>Loctite</td><td></td><td>Uzun Boyunlu Şişeler</td></tr><tr><td>DİKKAT: FastGreen</td><td>Dye Sigma</td><td>F7252-5G</td><td>Bu ürünü kullanırken Göz Kalkanları ve Eldivenler giyin</td></tr><tr><td>Antibiyotik Krem</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Göz Merhemi</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Elektrikli Tıraş Makinesi</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>%70 Etanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>%10 Provadon İyot</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>%3 Hidrojen Peroksit</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isınma Pedi Boncuk</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sterilizatörü</td><td>SouthPointe Cerrahi</td><td>GRM5-1450</td><td></td></tr><tr><td>Küçük Hayvan Stereotaksik</td><td>Kopf</td><td>Model 940</td><td></td></tr><tr><td>Burun Konisi</td><td>Kopf</td><td>Model 923-B</td><td></td></tr><tr><td>Kulak Çubukları</td><td>Kopf</td><td>Model 921</td><td>Bu model isteğe bağlıdır</td></tr><tr><td>Kanül Sürücü</td><td>Kopf</td><td>Model 1966</td><td></td></tr><tr><td>Şırınga Tutucu</td><td>Kopf</td><td>Model 1972</td><td></td></tr><tr><td>Sıcaklık Kontrol Sistemi</td><td>Kopf</td><td>Model TCAT-2LV</td><td>Opsiyonel</td></tr><tr><td>Oksijen/İzofluran Sistemi</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

kemirgen merkezi sinir sistemi İlaçların doğrudan intraventriküler teslim

Direct Intraventricular Delivery of Drugs to the Rodent Central Nervous System

, Kan-beyin bariyerinden geçebilme bir yetersizlik nedeniyle, bazı ilaçların doğrudan merkezi sinir sistemi (MSS) teslim edilmesi gerekir. Burada video gösterilen teknikler de merkezi sinir sistemine diğer ilaçların bir bolluk sunmak için kullanılabilir ama bizim laboratuar, antisens oligonükleotidler (Asos) odaklanır. Antisens oligonükleotidler (Asos) demonte dizisi özel hedefler 1 hem de belirli genlerin 2 vardiya izoformu oranları için yeteneği var. Farenin merkezi sinir sistemi yaygın gen demonte veya yapıştırma elde etmek için, biz Ásos video gösteren her ikisi de yönetim iki ayrı yolları kullanarak beyin içine gönderilmesi mümkün olmaktadır. Birinci kullanır cerrahi lateral ventrikül içine implante bir kateter bağlı ozmotik pompalar, Alzet. Bu Ásos sürekli bir zaman süresi için, CNS nüfuz etmesine izin verir. İkinci bir yüksek tek bir bolus enjeksiyonu içerirsağ lateral ventrikül içine ASO gh konsantrasyonu. Çalışmanın gereksinimlerine bağlı olarak, tek bir yöntem diğer tercih edilebilir olsa da her iki yöntem de, tüm beyin ve omurilik ASO sunmak için, fare serebral ventriküler sistemi kullanır.

Pompa infüzyon veya ICV bolus enjeksiyon sonrası belirli bir süre sonra (biz rutin olarak dört hafta kullanın), bu Asos etkisini test etmek önemlidir. Her iki ya da Western blot veya ELISA ile hem de protein düzeyi olarak kantitatif gerçek zamanlı PCR kullanılarak mRNA düzeyi (yayınlanmış örneğin, Şekil 4 de, hedef geni seviyelerini / izoformları ölçmek için beynin farklı bölgelerinde ve omurilik alarak tavsiye .) Bu farklı MSS bölge genelinde ASO etkinliğini belirlemenize yardımcı olur. Hedeflenen proteinin yarı ömrü uzunsa, biz en fazla protein demonte veya yapıştırma değerlendirmek amacıyla ASO infüzyon sonra uzun bekleme tavsiye ederiz. Bu oligo dağıtım test etmek de önemlidir. Daha yüksek ASO konsantrasyonu genellikle yakın ventriküler sistemi 16 alanları görülür rağmen pompa infüzyon, aynı taraf ve karşı her iki yarımkürede ile dağıtım neden. ICV bolus enjeksiyonları daha Unifo verimMSS 16 ile oligo rm dağılımı, etkileri uzun ömürlü olmayabilir ama. Biz Southwell ve arkadaşları için okuyucu doğrudan. Bolus oligo dağıtım 16 karşı pompa doğrudan bir karşılaştırma görmek. Ayrıca her ASO in vivo olarak biraz farklı davranacaktır çünkü birden fazla doz yanı sıra Asos etki süresi test tavsiye. Asos genellikle birkaç ay sonra ASO teslim süren hedef devirme ya da yapıştırma ile, eylem oldukça uzun bir süre var. Ayrıca, bazı Asos diğerlerinden daha iyi çalışır ve bazı gen hedefleri diğerlerine göre demonte daha kolay olacaktır. Bu nedenle, tarama kurşun aday belirlemek için Asos, biz bir n in vivo olarak en az 3-5 Asos test tavsiye = bir ilk geçiş olarak ASO başına 4-6 yetişkin fareler. Asos dışında bir ilaç kullanıyorsanız, aynı zamanda pilota önemli olacaktır ideal ilaç konsantrasyonu, etki ilaç süresi ve CNS ilaç, belirli bir bileşik için daha önce dağılımı. <img alt="Tablo 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50326/50326table1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50326/50326table1.jpg" /> Tablo 1. Cerrahi Koordinat. Koordine eden intraserebroventriküler (ICV) bolus performans hem de osmotik pompalar implante zaman fareler ve sıçanlar hem de sağ lateral ventrikül vurmak için kullanılır. Her iki koordinatları, pompalar ve ICV bolus için, sağ lateral ventrikül hedef. Bu biz en çok deneyime sahip ve ASO mükemmel dağılımını sağlamak bildiklerini, çünkü iki farklı ayarlar kullanabilirsiniz. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/50326/50326fig1.jpg" /> Şekil 1. Stereotaksik Kurulum. Alzet pompa ve Bolus enjeksiyon ameliyatları için (A) gerekli stereotaksik donanım. I) Cam Boncuk sterilizer. ii) Dijital Okuma. iii) hareketli kollar ile Stereotaksik taban. iv) Sıcaklık Kontrollü Isıtma Pedi. v) Oksijen Sistemi / İsofluranın. vi) İsofluranın Odası. (B) burun konisi ve kulak çubukları kadar kapatın. (C) İki ekleri gerekli. Sol: Şırınga / ICV bolus enjeksiyon için iğne tutucu. Sağ: Ozmotik pompa implantasyonu için Kanül Sürücüsü. <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/50326/50326fig2.jpg" /> Şekil 2. Ozmotik Pompa İmplantasyonu Alzet. Fareler için (A) Alzet ozmotik pompa seçenekleri. . 14 günlük pompalar (0.25 ul / saat), 28 günlük pompalar (0.25 ul / saat), 42 gün pompalar (0.15 ml / saat) (B), ikinci pompa, bregmaya implantasyon için Koordinat: Arka -0.5 mm, lateral -1.1 mm ( Sağ) ve ventral -2.5 mm (kateterin uzunluğu). (C) yoluyla sürüş sonra kateterkafatası ve yapıştırma kanül, boya lateral ventrikül içinde kateterin doğru yerleştirilmesi değerlendirmek için kateter aracılığıyla temizlendi. boya (C) olarak uygulanan hemen sonra (D) Perfüze beyin. Kateter başarıyla ventrikül yerleştirilirse, boya fare ventriküler sistem boyunca dağıtılacak. <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/50326/50326fig3.jpg" /> Şekil 3,. Intraserebroventriküler Bolus Enjeksiyon. (A) bregma gelen bolus enjeksiyon için Koordinat: +0.3 mm Ön, Yanal -1.0 mm (Sağ) ve ventral -3.0 mm (B) ventral kafatası -3.0 mm ile iğne sürüş sonra, boya şırınga ile itilir. kısa bir süre (B) &#39;de uygulanan boya sonra ortamdaki ventrikül. (C) Perfüze beyindeki iğne doğru yerleştirilmesi değerlendirmek. Iğne başarıyla ventrikül, yerleştirilirseboya fare ventriküler sistem boyunca dağıtılacak. <img alt="Şekil 4," fo:content-width="5.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50326/50326fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50326/50326fig4.jpg" /> Şekil 4. Duyarlılık karşıtı oligonükleotidler (Smith ve ark. 7 şirketinden alınmış, Şekil) ve in vivo sıçan SOD1 azaltır. (AD) Antisens SOD1 oligonükleotidler r146192 SOD veya SOD 100 mikrogram / ​​gün normal farelerin sağ lateral ventrikül içine 28 gün boyunca infüze edildi şifreli. Beyin ve omurilikten (A) Endojen SOD1 mRNA düzeyleri Mah-PCR ile ölçülen. ( B) SOD1 ve a-tubulin protein düzeyleri ASO infüzyonu takiben. tübülin ve SOD1 için (C ve D) Protein seviyeleri beyin infüzyonla farklı bölgeler için sayılabilir. presenilin 1 ya da GSK-3 ve beta karşı (E) Ásos, Sağ temporal / frontal korteks değerlendirildi transgenik olmayan fare ve mRNA düzeylerinin sağ lateral ventrikül içine 2 hafta infüze edildi. Klinik Araştırmalar için American Society izniyle yayınlanmıştır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50326/50326fig4large.jpg" target="_blank">büyük rakam görmek için buraya tıklayın</a> . <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/50326/50326fig5.jpg" fo:content-width="3in" fo:src="/files/ftp_upload/50326/50326fig5highres.jpg"/> Şekil 5,. Yatay Yatak Dikiş Koşu. 5-0 naylon dikiş ipliği cilt içinde dokunan ve dışında olan, ön başlayan ve arka çalışma, kanül üzerinde daha fazla konsantre. Bir kez en arka noktasına ulaşmış, dikiş ipliğinin sonra geri getirdi ve bir kez daha kanül üzerinde dişli. Bu uygun yara kapama sağlar ve deri yoluyla çalışmasını kanül / boru engeller.

Ya bir kateterin yerleştirilmesi ya da farelerde sağ yan ventrikül içine, bir bolus enjeksiyonu gerçekleştirerek merkezi sinir sistemi ilaçları hedeflemek için bir yöntem açıklanmaktadır. Biz antisens oligonükleotidler teslim odaklanmıştır. Bu teknik, diğer ilaçlara ve sıçanlara, kolaylıkla adapte edilebilir.

Kemirgen Merkezi Sinir Sistemi İlaçların doğrudan Intraventriküler teslim

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses ...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, bu protokolde görüldüğü gibi, antisense oligonükleotidler gibi ilaçların kemirgen merkezi sinir sistemine lateral ventrikül aracılığıyla doğrudan uygulanmasıdır. Bu, iki farklı yöntemle gerçekleştirilir. Birincisi, bir zet ozmotik pompaya bağlı metal bir kateterin farenin sağ lateral ventrikülüne cerrahi olarak implante edilmesini içerir.Pompa ilacı iletmeyi tamamladığında, tedavinin sonlandırılmasına olanak tanıyan tamamen çıkarma işlemi veya aktif tedavinin sürdürülmesine olanak tanıyan değiştirme işlemi gerçekleştirilebilir. İlacı iletmenin ikinci yöntemi, sağ lateral ventriküle yapılan tek bir bolus enjeksiyona dayanmaktadır. Antisense oligonükleotidlerin tüm kemirgen merkezi sinir sistemine başarıyla iletildiğini kanıtlamak için, bu yöntem kullanılarak belirli bir miktar ilaç tüm merkezi sinir sistemine hızla boşaltılabilir.Bu protokolde gösterildiği üzere, oligo infüzyonunu takiben birkaç farklı beyin bölgesindeki mRNA ve protein seviyeleri ölçülmelidir. Bu yöntem, antisense oligonükleotidlerin merkezi sinir sistemine nasıl doğrudan uygulanabileceği konusunda bilgi sağlayabildiği gibi; antikorlar, gen tedavileri, vektörler ve küçük moleküller dahil olmak üzere diğer ilaçlar için de uygulanabilir.Tüm cerrahi prosedürler, steril ekipman ve solüsyonlar kullanılarak, steril koşullar altında ve kurum ile hükümet kılavuzlarına uygun olarak gerçekleştirilmelidir. Detaylar metin protokolünde ve kurumsal iacuc kılavuzlarında bulunabilir. Fareyi bir indüksiyon odasında isof fluorine ile anestezi ettikten sonra, fareyi çıkarın ve tamamen bilinçsiz olduğundan emin olmak için ayak parmağı sıkıştırma testi yapın.Omuzların üzerinden gözlerin arasına kadar olan bölgedeki tüyleri hızlıca tıraş edin. Ardından, anestezi altındaki fareyi dikkatli ve nazik bir şekilde stereo takas üzerine yerleştirin. Burun konisini burnun üzerine itin ve gaz akışını stereo takaslara yönlendirin.Fareyi anestezi altında tutmak için başı kulak barlarıyla sabitleyin. Burada kulak barı dengeleyicileri kullanılmıştır; ancak lateral ventrikülü hedeflediğiniz için ventrikülün büyük boyutu nedeniyle kafatasının tamamen düz olması gerekmez. Anestezinin sürdürülmesi için izofluran seviyesini %2'ye düşürün ve göz pomadı uygulayın.Her iki gözün üzerine, başın üst kısmını ve boynu önce %95 Ethanol daldırılmış bir pamuklu çubukla, ardından cerrahi alanı sterilize etmek için iyot daldırılmış bir pamuklu çubukla silin. Ayrıca, farenin üzerine steril bir örtü yerleştirin. Farenin vücut sıcaklığının 37 °C seviyesinde kaldığından emin olun.Burada, rektal prob geri bildirimli, sıcaklık kontrollü bir ısıtma sistemi kullanılır. Ardından zat pompasının implantasyonuna geçiniz. Gerekli infüzyon gün sayısına göre uygun pompayı seçiniz ve pompayı protokolün metin kısmındaki talimatlara göre hazırlayınız.Boyun tabanından iki göz arasındaki bölgeye kadar bir insizyon yaptıktan sonra, küt uçlu makasları eğriliği yukarı bakacak şekilde boyun tabanındaki derinin altına nazikçe yerleştirin. Makasları sol arka ekstremiteye doğru kaydırın ve deri altında bir cep oluşturmak için hafifçe açın. Kafatasını önce steril pamuklu çubuklarla, ardından hidrojen peroksit batırılmış bir pamuklu çubukla temizleyin.bgma'yı geliştirmek için, pompanın konik tüpün kenarlarına değmediğinden emin olarak, kavisli hemostatı kullanarak konik tüpten dikkatlice bir pompa alın. Pompanın tabanını pensle tutun ve akış modülatörünü tamamen içeri itin. Kavisli hemostat ile, akış modülatörü ve tüpün birleştiği noktada pompayı sabit tutun.Pompayı boynun tabanındaki deri altına yerleştirin ve dirençle karşılaşmadığınız sürece dikkatlice sol arka ekstremiteye doğru mümkün olduğunca geriye itin. Kavisli hemosta ile kateterin herhangi bir şeye temas etmemesine dikkat edin. Kanülü, üst kısmın kaideyle birleştiği oluktan tutun.Kanül sürücüsünü konumuna getirin ve yerine sabitleyin. Ardından, kanülün tabanına tek bir damla hızlı yapıştırıcı sürün ve kanülün üst kısmını sürücüye doğru iterek tüpün düz arkaya bakacak şekilde konumlandırın. Hızlıca hareket ederek, cildi kenara çekili tutarken kateter ucunu bgma'ya değdirin ve dijital ekrandaki koordinatları sıfırlayın.Kavisli hemostat ile kateteri kaldırın ve 1,1 milimetre sağa lateral olarak ve 0,5 milimetre posterior yönde hareket ettirin. Bu diyagramda gösterildiği gibi, kanül tabanı kafatasına sıkıca bastırılana kadar kateteri hızlıca kafatasından içeri itin. Kafatasının nispeten ince olması nedeniyle, kateter doğrudan kafatası ve farelerin içinden sürülebilir.Üzerinde yapıştırıcı bulunan herhangi bir deri parçasını kafatasından uzaklaştırın. Ardından, kanül sürücüsü ile kanülü sabit tutarak yapıştırıcının tamamen kuruması için bir ila iki dakika bekleyin. Sonra, sürücüyü yukarı kaldırırken kavisli hemostatik pens ile kanülü yerinde sabit tutun.Kanülün kafatasına düzgün bir şekilde sabitlendiğinden emin olmak için hemostatı yavaşça bırakın. Kanülün üst kısmına bastırmak için bir pamuklu çubuk kullanın. Steril sıçan kemik makasını, kanülün üstü ile tabanı arasındaki oluğa, makaslar düz bir seviyede olacak şekilde yerleştirin.Kanülün kafatası klipsinden ayrılmasını önlemek için, pamuklu çubukla aşağıya doğru bastırmaya devam ederken kanülün üst kısmını kesin. Beş sıfır naylon sütür, standart hemostatik pens ve forseps kullanarak, kanülün üzerindeki bölgeye ekstra dikkat ederek tüm açıklık boyunca sütür atın. Baş ve boyun bölgesine bir miktar antibiyotikli merhem uygulayın.Kulak barlarını sökün ve burun konisini gevşetin. Fareyi stereo takımlardan çıkarın ve iyileşmesi için bir ısıtma pedine yerleştirin. Ağrı, rahatsızlık veya enfeksiyon olup olmadığını kontrol etmek için fareleri cerrahi müdahaleden sonra günlük olarak izleyin ve onaylanmış bir protokole uygun olarak karprofen gibi analjeziklerle gerektiği şekilde tedavi edin.Kullanılmış bir pompayı çıkarmak için, tüpleri belirgin şekilde çekmeden veya itmeden, farenin sırtındaki pompa bağlantısına dik olarak yapılmış 1,5 santimetrelik bir kesiden pompayı dikkatlice dışarı çekin. Ardından, tüpleri akış modülatörünün yaklaşık 0,5 santimetre üzerinden kesin ve tüpü kapatmak için üzerine hızlı yapıştırıcı sürün. Yapıştırıcının kuruması için bir ila iki dakika bekleyin.Tüpleri tekrar insizyon bölgesine yerleştirin ve insizyonu sütürle kapatın; sütürlenen deri üzerine antibiyotikli merhem sürün ve fareyi ısıtılmış bir iyileşme pedine yerleştirin. Pompa değiştirilecekse, yeni pompayı %95 ethanol ile doldurulmuş 10 santimetrelik bir kapla birlikte hazır bulundurun. Yeni pompayı kavramak için forseps kullanın.Ardından diğer elinizin parmaklarını %95 ethanol içine batırın ve pompayı tutun. Yeni pompa akış modülatörünü atın ve eski pompayı akış modülatöründen dikkatlice çekip çıkarın. Eski pompa çıkar çıkmaz, akış modülatörünün farenin dış kısmına asla temas etmediğinden emin olarak yeni pompayı tübe ve kanüle yavaşça kaydırarak yerleştirin.Yeni pompayı insizyon yoluyla deri altı cebine tekrar yerleştirin ve cildi daha önce olduğu gibi dikin; cilt dikildikten sonra yaranın üzerine antibiyotikli pomad sürün ve fareyi bir iyileşme pedine yerleştirin. Ameliyat sonrası fareleri ağrı, rahatsızlık veya enfeksiyon açısından her gün takip etmeye devam edin ve gerektiğinde analjezikler uygulayın; intraserebroventriküler bolus uygulamak için, daha önce olduğu gibi bir kafa derisi insizyonu yapılır ve hayvanın kafatası temizlenip hidrojen peroksit ile tedavi edilir.Ardından, ilaç yüklü şırıngayı uygun konuma getirin. İğnenin eğimli ucunu posteriora doğru yönlendirin ve yerine sabitleyin. İğneyi bgma'ya değene kadar indirin.Tüm koordinatları sıfırlayın, ardından iğneyi sağa doğru lateral olarak 1.0 milimetre ve anterior olarak 0.3 milimetre hareket ettirin. İğnenin eğimli ucu kafatasının üst yüzeyiyle aynı seviyeye gelene kadar iğneyi yavaşça kafatasından içeri sürün. Tekrar belirtmek gerekirse, bu işlem fare kafatasının inceliği sayesinde gerçekleştirilebilir.Z koordinatını ayarlayın ve iğneyi saniyede 1 mm hızla -3.0 mm seviyesine indirin. Beyin dokusunun iğne etrafında sızdırmaz hale gelmesi için iki ila üç dakika bekleyin. 10 µL antisense oligonükleotidin tamamını saniyede 1 µL hızla uygulayın.İki ila üç dakika bekleyin. Oligonükleotidlerin ventriküle infüzyonu için saniyede bir mikrolitrele infüzyon hızı kullanılır. Bu hız farklı ilaçlar arasında değişiklik gösterebilse de, iğne tabanında kafatasına bir pamuklu çubuk tutun.İğneyi saniyede bir milimetre hızla yukarı kaldırın. İğne kafatasından çıkar çıkmaz, herhangi bir ilacın sızmasını önlemek için pamuklu çubuğu iğne deliğinin üzerinde gezdirin ve bir dakika boyunca basılı tutun. Cilt dikişle kapatılıp antibiyotikli pomad uygulandıktan sonra, fareyi ısıtmalı bir iyileşme pedine yerleştirin.Oligo konsantrasyonuna bağlı olarak, tam iyileşme 20 dakikadan birkaç saate kadar sürebilir. Ameliyat sonrası fareleri ağrı, rahatsızlık veya enfeksiyon açısından her gün izlemeye devam edin ve gerektiğinde analjezikler uygulayın. Bu görüntü, ventriküle uygulama için zet osmotik pompa yerleştirme koordinatlarını test etmek amacıyla fast green boyasının uygulanmasının hemen ardından perfüze edilmiş bir beyni göstermektedir.Bu videoda gösterildiği üzere, kateter ventriküle başarıyla yerleştirilirse, boya burada görüldüğü gibi fare ventriküler sistemine yayılacaktır. Bu görüntü, intra serebroventriküler bolus enjeksiyon koordinatlarını ve prosedürünü test etmek için fast green boyası uygulamasından kısa bir süre sonra perfüze edilmiş bir beyni göstermektedir. İğne ventriküle başarıyla yerleştirildiyse, boya yine fare ventriküler sistemine yayılacaktır.Aşağıdaki görüntüler, sıçanlarda in vivo antisense yoluyla So D one seviyelerini azaltmaya yönelik bir antisense oligonükleotid deneyinin sonuçlarını göstermektedir. So D one oligonükleotidleri, normal sıçanların sağ lateral ventrikülüne 28 gün boyunca günlük 100 micrograms dozunda infüze edilmiştir. Bu görüntü, beyin ve omurilikteki endojen OD one mRNA seviyelerinin azaldığını göstermektedir.Q-R-T-P-C-R ile ölçülen SOD1 oligo infüzyonunun ardından, bu görüntü SOD1 protein seviyelerinin de azaldığını göstermektedir. Buradaki SOD1 antisense oligonükleotid infüzyonunu takiben, infüzyon sonrası beynin farklı bölgelerindeki tübülin ve SOD1 protein seviyeleri nicelleştirilmiş ve SOD1 oligonun SOD1 nakavtuna özgü olduğu gösterilmiştir. Ek olarak, nontransgenik farelerin sağ lateral ventrikülüne iki hafta boyunca presenilin 1 veya GSK3β'ya karşı oligolar infüze edilmiş ve mRNA seviyeleri değerlendirilmiştir.Bu sonuç, antisense oligonükleotidler kullanılarak modüle edilebilen geniş hedef yelpazesini ortaya koymaktadır. Bu teknikler bir kez kavrandığında, uygun şekilde uygulandıkları takdirde hem pompa ve implantasyon hem de bolus enjeksiyon 10 dakika içinde gerçekleştirilebilir.

direct-intraventricular-delivery-drugs-to-rodent-central-nervous

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Kapsamlı preklinik test merkezi sinir sistemine etkili ilaçların genellikle belirli uygulama yolları ile bağlantılı olarak değerlendirilmesi ve ilaç biodistribution karşılaştıran içerir. Burada, yaygın olarak kullanılan üç sistemik teslimat yöntemleri (intravenöz, intraperitoneal ve sözlü) yanı sıra yerel teslimatı için bir yöntem (konveksiyon gelişmiş teslimat) farelerde gösterilmiştir.

Kemirgen Modeller Merkezi Sinir Sistemi Hastalıkları Tedavisinde Sistemik ve Yerel İlaç Taşıyıcı

Merkezi sinir sistemi içine yenidoğan farelerin beyin (intraserebroventriküler) ve (intravenöz) 2) sistemik tedavi ajanları tanıtmak içine 1): Bu makale, enjeksiyon iki çok farklı yöntemler göstermektedir.

Fare intraserebroventriküler sayesinde Terapötik Ajanlar teslimi (ICV) ve intravenöz (IV) Enjeksiyon

Kaynak: Poland, R. et al. Motive edilmiş davranışın moleküler substratlarını incelemek için kemirgen beyin mikroenjeksiyonu. J. Vis. Uzm. (2015)Bu videoda, hassas ilaç iletimi için bir şırınga ve mikroenjektör hortumundan oluşan su dolu bir mikroenjeksiyon kurulumu kullanılmıştır. Önceden implante edilmiş bir kılavuz kanülü olan bir sıçan, hedefe yönelik beyin mikroenjeksiyonuna tabi tutulur ve bu da uyanık hayvanlarda minimum doku hasarı ile terapötik ajanların doğru bir şekilde uygulanmasını...

Terapötik Bir Ajanın Uyanık Bir Kemirgen Beynine Mikroenjeksiyon Tabanlı Verilmesi

Bu video, bir fare modelinde ommaya aracılı intraserebroventriküler enjeksiyonu göstermektedir. Yöntem, potansiyel ilaç adaylarının lokalize olarak verilmesini sağlar ve kan-beyin bariyerinden kaçar.

Farede İntraserebroventriküler Enjeksiyon: Fare Beyninin Serebral Ventriküllerine İlaç Vermek İçin Ommaya Aracılı Doğrudan İlaç Uygulama Yöntemi

Kaynak: Chen, Y., et al. Sıçan merkezi sinir sisteminde antisens oligonükleotidlerin intratekal iletimi. J. Vis. Uzm. (2019)Bu video, bir sıçan modelinin lomber omurgasına implante edilen bir kateter yoluyla beyin omurilik sıvısına (BOS) bir test bileşiğinin verilmesini göstermektedir. Bileşik, BOS boyunca beyne ve omuriliğe dolaşır, nöronlara girer ve terapötik potansiyel sunar.

Bir Test Bileşiğinin Sıçan Merkezi Sinir Sistemine İntratekal Verilmesi

Pediatrik hastalığın hayvan modelleri erken başlangıçlı ve agresif hastalığın ilerlemesini yaşayabilirsiniz. Klinik genç fare modelleri ile ilgili tedavi teslimat teknik olarak zor olabilir. Bu protokol, yaşamın ilk iki doğum sonrası gün içinde yeni doğmuş fareler için invazif olmayan bir damar içi enjeksiyon yöntemi tarif etmektedir.

Yenidoğan Farelerde intravenöz enjeksiyonlar

Burada, omurganın lomber intratekal uzayına bir kateter yerleştirerek sıçan merkezi sinir sistemine ilaç teslim etmek için bir yöntem açıklıyoruz. Bu yöntem diğer terapötik yöntemlerin de teslimi için uygun olsa da, antisense oligonükleotidlerin teslimatına odaklanıyoruz.

Sıçan Merkezi Sinir Sisteminde Antisense Oligonükleotidlerin İntinal Teslimi

Iskemik inme sonrası yaygın karotis arter (fare) veya eksternal karotis arter (sıçan) yoluyla, enjekte çözeltileri veya süspansiyonlar için uyarlanabilir nöral kök hücreleri teslim etmek için bir yöntem bildirilmiştir. Enjekte edilen hücreler beyin parankim boyunca geniş bir şekilde dağıtılır ve doğumdan sonra 30 d'ye kadar tespit edilebilir.

Nöral Kök Hücrelerin Sıçan ve Fare Beynine İntra-Arteriyel Teslimatı: Serebral İskemiye Uygulama

Burada, farelerde serbest el yaklaşımı kullanarak (yani stereotaksik bir cihaz olmadan) intraserebroventriküler enjeksiyonlar yapmak için basit ve hızlı bir yaklaşım açıklanmaktadır.

Farelerde Serbest El İntraserebroventriküler Enjeksiyonlar

Sıçanlarda doğrudan vagus siniri enjeksiyonu için bir protokol sunuyoruz ve enjeksiyon sonrası komplikasyonlar olmadan doğrudan sinir içine ilaç verilmesini sağlıyoruz. Bu yöntem, otonom sinir sistemi manipülasyonunu içeren klinik öncesi nörolojik çalışmalar için geçerlidir. Sıçanlarda ve diğer türlerde diğer sinirler için gerekli modifikasyonlarla doğrudan sinir enjeksiyonu için kullanılabilir.

Sıçanlar İçin Doğrudan Vagus Sinir Enjeksiyon Protokolü

Öğrenin, kemirgenlerde merkezi sinir sistemine ilaç teslimi için kateter implantasyonu ve bolus enjeksiyonu yöntemlerini. Antisens oligonükleotidlerin etkili dağılımı bu tekniklerle sağlanır.

Kemirgen Merkezi Sinir Sistemi İlaçların doğrudan Intraventriküler teslim

Daha fazla video keşfet