Kemirgen Ürogenital Sinüs mezenşimin ve İnsan Kök Hücre Doku Rekombinasyon kullanarak İnsan Prostat epiteli oluşumu

Bu prosedürün genel amacı, kemirgen ürogenital, sinüs mezenşimi veya UGSM'yi kemirgen embriyolarından ve insan prostat epitelini oluşturabilen böbrek kapsülüne implant doku karışımlarından izole etmektir. Bu, önce ürogenital sinüsün fare veya sıçan embriyolarından izole edilmesiyle gerçekleştirilir. Daha sonra, ürogenital sinüs mezenşimi epitelden ayrılır.

Daha sonra ürogenital sinüs mezenşiminin tek hücreli süspansiyonları pluripotent kök hücrelerle birleştirilir. Son olarak, hücre karışımı bir konakçı farenin böbrek kapsülünün altına implante edilir. Sonuç olarak, insana özgü PSA ekspresyonunun doğrulanması yoluyla fare böbreğinde oluşan insan prostat epitelini gösteren sonuçlar elde edilebilir.

Bu yöntem prostat fonksiyonu ve hastalığın başlangıcı hakkında fikir verebilse de, insan prostat tümörlerinin ksenogrefti ve tümörleri oluşturmak için haftalık tümörojenik hücre hatlarının indüksiyonu gibi diğer sistemlere de uygulanabilir. Zamanlanmış bir hamile fare veya sıçanı ötenazi yaptıktan ve embriyoları izole ettikten sonra, onları amniyotik kesekten ayırın, göbek kordonunu kesin ve buz gibi soğuk çileler içeren 50 mililitrelik bir tüpe aktarın. Tuz çözeltisini dengeleyin ve buz üzerinde tutun.

Bir embriyoyu 100 milimetrelik bir Petri kabına yerleştirin ve bolus seviyesinde ikiye bölmek için makas kullanın. Mideyi ve ince bağırsağı çıkarın ve daha sonra böbreklerin burun kutuplarında bulunan dişi embriyodaki yumurtalıkları veya erkeklerde mesane seviyesinde bulunan testisleri bulun. Bir diseksiyon kapsamı altında.

Mesaneyi ve karnın arka duvarını ortaya çıkarmak için karın duvarını kesmek için Venedik makası kullanın. Üst genital sistemi eklerden kurtarın ve göbek kordonunu serbest bırakın. Kasık kemiğini ve dumont ince uçlu forseps ile kesin.

Açıkça, ürogenital sinüsün ön duvarından ayırın. Ürogenital sinüsün arka duvarını rektumdan ayırın ve ürogenital sinüsü alt uçta mesane ile kesin. Sonra mesaneyi ürogenital sinüsten ayırın.

Ürogenital sinüsü saklayın ve buz gibi soğuk HBSS'de bloke edin. Ürogenital sinüsü kalsiyum ve magnezyum içermeyen HBSS'de% 1 tripsin içeren 50 mililitrelik bir tüpe aktarın ve 30 dakika boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. İnkübasyondan sonra, tripsini çıkarın ve sindirimi nötralize etmek için% 10 FBS ve DM A MF 12 ortamı ekleyin.

Daha sonra, bir iğne veya ince uçlu forseps kullanın Yapışkan mezenkimal manşonu epitel tüpünden dikkatlice çıkarmak için. Epitel tüpünün sağlam tutulması, mezenşimin epitel hücresi kontaminasyonu olasılığını azaltır. Bu, kök hücreden türetilmiş insan glandüler epiteli ile birlikte kemirgen bezlerinin oluşmasına neden olabilir.

UGSM'yi %10 FBS, %1 kalem strep, %1 esansiyel olmayan amino asitler ve bir nanomolar içeren DMM F 12 ortamı içeren 50 mililitrelik yeni bir tüpe aktarın. R 1 8 81 Tüpü gece boyunca %5 CO2 ile 37 santigrat derecede inkübe edin. Ertesi gün dokuyu 200 G'de santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve peleti yıkamak için PBS kullanın.

PBS'yi çıkardıktan sonra, dokuyu D-M-A-M-F 12'de% 0.2 Kollajenaz içinde yeniden süspanse edin ve bir saat boyunca hafifçe sallanarak 37 santigrat derecede inkübe edin, homojen bir tek hücre karışımı haline gelene kadar sindirim dokusunu üç kez kuvvetlice girdap haline getirin ve kollajenazı nötralize edin: %10 FBS, %1 kalem strep, %1 esansiyel olmayan amino asitler ve bir nanomolar R 1 8 81 ile DMAMF 12 ortamı. Hücreleri 200 G'de peletleyerek ve Resus bunları HBSS'de süspanse ederek üç kez yıkayın. Son olarak, resus, mezenkimal hücreleri DMM F 12'de askıya alın ve nakli gerçekleştirmek için bunları saymak için bir hemo sitometre kullanın.

Steril bir cerrahi alan hazırladıktan ve metin protokolüne göre bir IP ketamin ksilazin enjeksiyonu ile bir erkek atletik çıplak fareyi uyuşturduktan sonra, sedasyon seviyesini doğrulamak için bir ayak parmağı çimdikleme yapın Gerekirse cerrahi bölgeyi tıraş ederek fareyi cerrahi olarak hazırlayın ve üç alternatif %70 alkol mendili ve ardından Betadine çözeltisi ile temizleyin. Göz merhemi sürdükten sonra, sırtta bir santimetre boyuna bir kesi yapın ve 0,5 santimetre boyuna bir kesi ile karın duvarını kesmeye devam edin. Böbreği karından nazikçe sıkın ve nemli tutmak için steril salin damlaları kullanın.

Daha sonra, 27 gauge bir şırınga iğnesi kullanarak, hücre karışımı için bir enjeksiyon bölgesi oluşturmak üzere böbrek kapsülünü hafifçe delin. Daha sonra 28 gauge şırınga iğnesini 10 mikrolitre hücre karışımı ile doldurun ve böbrek parankimine nüfuz ederek yavaşça delinme bölgesine yerleştirin. Böbrek kapsülünün altındaki bir alana ulaşmak için.

Böbrek kapsülünün altındaki böbrekte bir bolus oluşturmak için 10 mikrolitre hücresel karışım enjekte edin ve iğneyi geri çekin. Böbreği karın boşluğuna geri koyun ve peritonun kas tabakasını dört adet naylon sütürle sabitleyin. Cildi dikiş veya zımba ile kapatın ve ciltteki kanı temizlemek için steril salin kullanın.

Burada, implantasyondan sekiz hafta sonra büyüyen bir ksenogreftin ultrason görüntüsü gösterilmektedir. Daire içine alınmış alan, böbrek yüzeyindeki ksenogrefti temsil eder. Bu görüntüler böbrek yüzeyinde ksenogreft büyümesini göstermektedir.

12 hafta sonra, ürogenital sinüs yokluğunda implante edilen insan ES hücreleri, mezenşim büyük bir teratom oluştururken, tek başına implante edilen ürogenital sinüs mezenşimi herhangi bir fark edilebilir yapı oluşturamaz. Ortada gösterilmiştir. Bu şeklin panelleri, kök hücreden türetilmiş insan prostat epitelinin yetişkin insan prostat dokusuna karşı temsili immünohistokimyasal boyamalarıdır.

Burada solda gösterildiği gibi, bezler bir AR pozitif luminal epitel tabakası içerir. Bu aynı zamanda PSA pozitif, bir P 63 pozitif bazal epitel hücre tabakası ve nadir kromogranindir. Bir nöroendokrin hücre olan bezler, konak kastrasyonu üzerine negatif A-M-A-C-R boyanması ile gösterildiği gibi kanser değildir.

AR PSA pozitif luminal hücreler artık mevcut değildir ve bu da karakteristik androjen bağımlılığını gösterir. Bu prosedürü denerken, ürogenital sinüs mezenşimini epitelden ayırmaya büyük özen göstermeyi unutmamak önemlidir. Kirletici ürogenital sinüs epiteli bezleri oluşturacak ve potansiyel olarak sonuçlarınızı karıştıracaktır.