Name: Kemirgen Ürogenital Sinüs mezenşimin ve İnsan Kök Hücre Doku Rekombinasyon kullanarak İnsan Prostat epiteli oluşumu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 44 s
Description: Keşfedin, kemirgen UGSM izolasyonu ve kök hücre rekombinasyonuyla insan prostat epiteli oluşumunu inceleyin. Bu yöntem, prostat kanseri başlangıç mekanizmalarını anlamak için değerli bir model sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz Dr Arieh Shalhav liderliğindeki Üroloji Chicago Bölüm Of Üniversitesi ve Ürolojik Araştırma Dr Carrie Rinker-Schaeffer Direktörü destek dolayı teşekkür etmek istiyoruz. Ayrıca Dr Michelle Le Beau liderliğindeki Chicago Kapsamlı Kanser Merkezi (UCCCC) Üniversitesi desteği kabul etmek istiyorum. Ayrıca Dr Mark Lingen liderliğindeki İnsan Doku Kaynak Merkezi çekirdek odası ve Leslie Martin ve Mary Jo Fekete yardımı uzman teknik yardım teşekkür ile. Ayrıca Terri Li tarafından yürütülen İmmünohistokimya Çekirdek Tesis teşekkür ederim. Bu çalışma Cerrahi Chicago Dalı, Üroloji Bölüm Üniversitesi tarafından finanse edildi; bir Amerikan Kanser Derneği Kurumsal Araştırma Bursu (ACS-IRG, # IRG-58-004), bir Kanser Merkezi Destek Hibe (P30 CA14599); Brinson Vakfı, Alvin Baum Aile Fonu; Chicago Kanser Araştırma Vakfı Kadın Kurulu Üniversitesi; S. Kregel bir HHMI tarafından desteklenmektedir: Med-içine-Grad Fellowskalça (56006772) ve Kanser Biyolojisi Eğitim Grant (T32-CA09594). Son olarak, yazının eleştirel değerlendirilmesi için Robert Clark, Dr VenkateshKrishnan ve Nathan Stadick teşekkür etmek istiyorum.

Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım Kılavuzu önerileri ile tam uyum içinde gerçekleştirilmiştir. Protokol Chicago Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu Üniversitesi&#39;nde (IACUC, protokol numaraları 72.066 ve 72.231) tarafından onaylanmıştır. Tüm cerrahi anestezi altında yapıldı ve tüm çabaları acı en aza indirmek için yapılmıştır. İnsan embriyonik kök hücre hattı WA01 (H1, NIH-kayıt # 0043) mTeSR1 medya kullanarak besleyici bağımsız protokolünü kullanarak WiCell (Madison, WI) ve kültürlü elde edildi (Hücre Teknolojileri Kök, Vancouver, BC). ES hücrelerinin çözdürme on geçişleri içinde kullanılmıştır. 1. Fare veya Rat Embriyolar gelen Ürogenital Sinüs izolasyonu <ol><li> 5 dakika boyunca CO 2 Solunduğunda bir zamanlı hamile fare (gün 17.5) veya sıçan (gün 18.5) euthanize. Ölüm sıçan vital bulgular kesilmesi ile doğrulanır. Daha sonra insanca boynunu kırmak. RBu noktada ötenazi. Karın cilt ve yanları sterilize etmek için% 70 etanol püskürtün. Karın cilt ve kas tabakaları kesin ve daha sonra, rahim kesmek amniyon kesesi gelen sıçan embriyolar ayrı ve göbek kordonu kesti. Buzla soğutulmuş Hank&#39;in dengeli tuz solüsyonu (HBSS) ihtiva eden 50 ml&#39;lik bir Falcon tüpüne embriyo transferi ve buz üzerinde tutmak. Fetus cerrahi makas ile kesilerek ötenazi. </li><li> 100 mm Petri kabındaki embriyo yerleştirin. Göbek (Şekil 1A) düzeyinde makas ile embriyo ikiye bölmek. Mide ve ince bağırsak çıkarın. Erkek embriyo (Şekil 1B ve 1C) olarak kadın embriyo ve testis yumurtalıklar ortaya koymaktadır. (Yumurtalıklar böbreklerin kaudal kutuplarda yer almaktadır. Testisler yaklaşık mesane düzeyinde bulunmaktadır). Bu gelişimsel aşamada, UGSM hem erkek hem de dişi embriyoların ana mevcudiyetinde bir prostat epitel soy uyarabildiğinden izoletestosteron. 4 Bu gelişme süresi noktadan sonra, ancak, prostat tomurcukları UGSM içine oluşturan başlar ve saf UGSM izolasyonu çok zor. 4 </li><li> Diseksiyon mikroskobu altında, mesane ve karın arka duvar ortaya çıkarmak için Vannas makas ile orta doğrultusunda karın duvarı kesti. Ekleri içermez üst genital sistem (erkek embriyolarda, üreter, Wolf kanal ve Müllerian kanal kesilmiş; kadın embriyolarda, üreter ve Müllerian kanal kesme). Göbek kordonu gelen mesane ücretsiz. Kasık kemiğine ve Dumont ince uçlu forseps ile ürogenital sinüs ön duvarından açıkça ayrı kesin. Son olarak, rektum ürogenital sinüs arka duvar ayırın. Alt ucunda (üretra itibaren) de mesane ile ürogenital sinüs kesin ve buz HBSS ürogenital sinüs en blok (mesane ile) saklayın. </li></ol> 2. Ürogenital Sinüs mezenşimin ayrılması <ol><li&gt; Diseksiyon mikroskobu (Şekil 1D) kapsamında ürogenital sinüs mesane çıkarın. </li><li> 1% Kalsiyum tripsin (Ca 2 +) ve Magnezyum (Mg 2 +) ücretsiz HBSS içeren bir şahin tüp ürogenital sinüs aktarın. 75 dakika boyunca 4 ° C &#39;de bir buzdolabında tüp yerleştirin. </li><li> Tripsin çıkarın ve DMEM/F12 ortamı içinde% 10 Fetal Bovin Serumu (FBS) ile nötralize tripsinizasyon. </li><li> Bu da kök hücre kaynaklı insan ile birlikte oluşturan kemirgen bezleri neden olabilir, dikkatli bir iğne veya Dumont ince uçlu forseps (sağlam epitel tüp mezenşimin epitel hücre kontaminasyon şansını azaltır bakımı ile epitel tüp yapışkan mezenkimal kol kızdırmak glandüler epitel) (Şekil 1D). 12 </li><li> DMEM/F12 ortamı + içeren yeni bir Falcon tüpüne transfer UGSM% 10 FBS +% 1 Penisilin / Streptomisin (pen / strep, 0.5 mg / ml) +% 1 Esansiyel olmayan amino asitler (NEAA) artı 1nM dozu R1881. Plas 37 ° C&#39;de bir inkübatör tüp% 5 CO 2 gece ile. </li><li> 200 xg doku santrifüj ve süpernatant atın. Fosfat tampon tuzu (PBS) (doku pelet rahatsız etmeyin) ile yıkayın. </li><li> Yeniden askıya dokuya% 0.2 kolajenaz (DMEM/F12) ekleyin. 1 saat boyunca hafif bir sallama ile 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Şiddetle girdap sindirim doku üç kez homojen tek hücreli karışımı olur ve DMEM/F12 orta + eklemek kadar% 10 FBS +% 1 P / S +% 1 NEAA + kollajenaz nötralize etmek 1nM dozu R1881. </li><li> 200 x g santrifüj ve sonra HBSS UGSM hücreleri yeniden askıya tarafından yıkayın ve tam UGSM yıkamak için üç kez tekrarlayın. Son olarak DMEM/F12 mezenkimal hücreler askıya ve Hemasitometre veya hücre sayımı cihazı kullanarak hücreleri saymak. </li><li> Bir Accutase sindirim (; Billerica, MA Millipore) kullanılarak; iEK hücreleri mTeSR1 medya (Vancouver, BC Kök Hücre Teknolojileri) ile kültür kullanarak besleyici-ücretsiz protokolü ayırmak. IEK hücreleri yıkayınsıcak DMEM/F12 medya kendi büyüme günlük aşamasında, sonra ılık 1x Accutase çözüm ekleyin ve tek hücre kolonilerden düzgün ayrışmış kadar 15-20 dakika 37 ° C&#39;de inkübe edin. Accutase nötralize ve yavaşça yukarı pipet ve aşağı hücre kümeleri karıştırmak ve parçalamak için; 1x tanımlanan tripsin inhibitör (Grand Island, NY Invitrogen) eşit miktarda ekleyin. Bir santrifüj tüpü ve 3 dakika 200 x g ve DMEM/F12 ortamı içinde yeniden askıya hücre pelletini için santrifüj içine pipetle hücreler. 200 tekrar xg az 3 dakika tüp santrifüj ve süpernatant kaldırmak, daha sonra istediğiniz ses seviyesinde soğuk HBSS veya DMEM/F12 yeniden askıya. </li><li> IEK / mezenkimal hücrelerin 1:2.5 oranı ile iEK hücreleri ekleyin. 3 Bu 10 ml enjeksiyon başına 4E 4 hESC (tek bir fare 2E 6 mezenkimal hücreler hakkında genellikle verim UGS) ile 1E 5 UGSM hücre hücresel bileşimi olacaktır. 5 dakika boyunca 200 x g&#39;de santrifüjden sonra supernatant atın. 75% Matrigel (BD Biosciences ile yeniden askıya,San Jose, CA, daha kolay kullanım için 25% soğuk HBSS ile karıştırılmış) ve alt böbrek kapsülü enjeksiyon için buz tüp yerleştirin. </li></ol> 3. Böbrek Kapsül altında Rekombinant Doku Nakli <ol><li> Bir steril cerrahi zemin hazırlayın. </li><li> Ksilizin / ketamin ip ile bir erkek atimik çıplak fare anestezisi, ketamin bir 01:01:08 oranı içeren yeni bir karışım kullanın: ksilizin: tuzlu. Dozlama 100 mg / kg ketamin ve 2.5 mg / kg &#39;Ksilazin olacaktır. Bir ayak-tutam tepkisiz Hayvanlar tam 20-30 dakika altında olmalıdır. </li><li> Cerrahi betadin çözüm ardından% 70 alkol üç alternatif mendil ile temizlik ve bir cerrahi örtü uygulayarak, cerrahi alan (çıplak bir fareyi kullanarak değilse) tıraş tarafından fare hazırlamak. </li><li> Anestezi sırasında kurumasını önlemek için fare gözünde göze nem merhem (Altalube göz merhemi) koyun. </li><li> Ameliyat sırasında, farelerin solunum hızı ve çekirdek vücut ısısı izlenir. Solunum oranları should istikrarlı ve 40-90 solunum / dakika içinde muhafaza olabilir. Çekirdek vücut ısısı mukoza renk ve ayak pembe tabanı gözlem ile izlenir. </li><li> Arkasında bir 1.0 cm uzunluğunda longitudinal cilt kesi yapmak. 0.5 cm boyuna kesi içinde karın duvarı kesmek için devam edin. </li><li> Yavaşça karın dışında böbrek sıkmak ve steril serum fizyolojik damla kullanarak böbrek yüzeyi nemli tutmak. </li><li> Yavaşça delinme boş bir 27-gauge enjektör iğnesi ile böbrek kapsülü. Çok sığ delik yeterlidir. Eğer cep karışımı enjekte etmek için künt bir iğne takın burada olacak. </li><li> Cep karışımı 10 ul ile 28-gauge künt şırınga iğne doldurun. Yavaş yavaş ponksiyon yerleştirin ve böbrek kapsülü altında bir alana ulaşmak için böbrek parankim nüfuz. Böbrek kapsülü altında böbrek üzerindeki bir kapsül oluşturmak üzere hücresel karışımı 10 ul enjekte edilir. Çekilme iğne. </li><li> Abdo için böbrek dönminal boşluğu. 4-0 naylon sütür ile periton kas tabakası sabitleyin. </li><li> Dikiş veya zımba ya ile cilt kapatın. </li><li> Steril tuzlu su kullanılarak, deriden kan temizleyin. </li></ol> 4. Ameliyat sonrası analjezi ve İzleme <ol><li> Ameliyat sonrası ağrı, ve 37 1 ml hayvan sıcak tutmak için ° C tuzlu ip yönetmek için buprenorfin (0.1 mg / kg, her 12 saat) kadar veya ketoprofen (serum fizyolojik her 12 saat, 3-5 mg / kg) ile hayvan enjekte ve su kaybını önlemek. </li><li> Temiz bir kafeste hayvan koyun ve hafif bir ısıtma yastığı yerleştirin. </li><li> Bu bilinci kazanmak ve kafes içinde hareket bir kez hayvan odasına geri hayvanlar gönder. </li><li> Aşağıdaki üç gün boyunca hastalık ve enfeksiyon belirtileri bakımından günlük olarak beklenmedik bir hayvan dikkate alınmalıdır. Fareler erişen gıda ve su operasyon sonrası 1 gün de dahil olmak üzere kafeslerde faaliyetlerinin gözlem ile takip edilmektedir. Fareler daha az faaliyetleri gösterirseniz, Ketoprofen intraperitoneal reklamdırGünde bir kez daha ministered. </li><li> Cilt zımba veya dikişler 2 hafta sonrası ameliyat çıkarın. </li><li> Xenograft dokular 8 hafta ameliyat sonrası gibi erken hasat edilebilir. Xenografts küçük hayvan ultrason (Şekil 2A) ve sabit dokular kesitli ve immünhistokimya (Şekil 3) kullanarak çeşitli proteinlerin için lekeli olabilir kullanarak in vivo olarak görüntülenebilir. </li></ol>

<ol><li>Taylor, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+human+prostate+tissue+from+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Formation of human prostate tissue from embryonic stem cells.</a> Nat. Methods. 3, 179-181 (2006).</li>
<li>Cunha, G. R., Chung, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal-epithelial+interactions--I.+Induction+of+prostatic+phenotype+in+urothelium+of+testicular+feminized+%28Tfm%2Fy%29+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Steroid+Biochem%22%5BJournal%5D)">Stromal-epithelial interactions--I. Induction of prostatic phenotype in urothelium of testicular feminized (Tfm/y) mice.</a> J. Steroid Biochem. 14, 1317-1324 (1981).</li>
<li>Cunha, G. R., Chung, L. W., Shannon, J. M., Taguchi, O., Fujii, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hormone-induced+morphogenesis+and+growth%3A+role+of+mesenchymal-epithelial+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Recent+Prog.+Horm.+Res%22%5BJournal%5D)">Hormone-induced morphogenesis and growth: role of mesenchymal-epithelial interactions.</a> Recent Prog. Horm. Res. 39, 559-598 (1983).</li>
<li>Staack, A., Donjacour, A. A., Brody, J., Cunha, G. R., Carroll, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+urogenital+development%3A+a+practical+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Mouse urogenital development: a practical approach.</a> Differentiation. 71, 402-413 (2003).</li>
<li>Cunha, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+and+abnormal+development+of+the+male+urogenital+tract.+Role+of+androgens%2C+mesenchymal-epithelial+interactions%2C+and+growth+factors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Androl%22%5BJournal%5D)">Normal and abnormal development of the male urogenital tract. Role of androgens, mesenchymal-epithelial interactions, and growth factors.</a> J. Androl. 13, 465-475 (1992).</li>
<li>Cunha, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+factors+as+mediators+of+androgen+action+during+the+development+of+the+male+urogenital+tract%5BTitle%5D)+AND+%22World+J.+Urol%22%5BJournal%5D)">Growth factors as mediators of androgen action during the development of the male urogenital tract.</a> World J. Urol. 13, 264-276 (1995).</li>
<li>Aboseif, S., El-Sakka, A., Young, P., Cunha, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+reprogramming+of+adult+human+epithelial+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal reprogramming of adult human epithelial differentiation.</a> Differentiation. 65, 113-118 (1999).</li>
<li>Marker, P. C., Donjacour, A. A., Dahiya, R., Cunha, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hormonal%2C+cellular%2C+and+molecular+control+of+prostatic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Hormonal, cellular, and molecular control of prostatic development.</a> Dev. Biol. 253, 165-174 (2003).</li>
<li>Cunha, G. R., Sekkingstad, M., Meloy, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterospecific+induction+of+prostatic+development+in+tissue+recombinants+prepared+with+mouse%2C+rat%2C+rabbit+and+human+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Heterospecific induction of prostatic development in tissue recombinants prepared with mouse, rat, rabbit and human tissues.</a> Differentiation. 24, 174-180 (1983).</li>
<li>Van der Griend, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+CD133+in+Normal+Human+Prostate+Stem+Cells+and+Malignant+Cancer+Initiating+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">The Role of CD133 in Normal Human Prostate Stem Cells and Malignant Cancer Initiating Cells.</a> Cancer Res. 68, 9703-9711 (2008).</li>
<li>Van der Griend, D. J., Konishi, Y., De Marzo, A. M., Isaacs, J. T., Meeker, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-label+centromere+and+telomere+FISH+identifies+human%2C+rat%2C+and+mouse+cell+contribution+to+Multispecies+recombinant+urogenital+sinus+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22Prostate%22%5BJournal%5D)">Dual-label centromere and telomere FISH identifies human, rat, and mouse cell contribution to Multispecies recombinant urogenital sinus xenografts.</a> Prostate. , (2009).</li>
<li>Vander Griend, D. J., Konishi, Y., De Marzo, A. M., Isaacs, J. T., Meeker, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-label+centromere+and+telomere+FISH+identifies+human%2C+rat%2C+and+mouse+cell+contribution+to+Multispecies+recombinant+urogenital+sinus+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22Prostate%22%5BJournal%5D)">Dual-label centromere and telomere FISH identifies human, rat, and mouse cell contribution to Multispecies recombinant urogenital sinus xenografts.</a> Prostate. 69, 1557-1564 (2009).</li>
<li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282, 1145-1147 (1998).</li>
<li>Ludwig, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feeder-independent+culture+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Feeder-independent culture of human embryonic stem cells.</a> Nat. Methods. 3, 637-646 (2006).</li>
<li>Prokhorova, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Teratoma+formation+by+human+embryonic+stem+cells+is+site+dependent+and+enhanced+by+the+presence+of+Matrigel%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Teratoma formation by human embryonic stem cells is site dependent and enhanced by the presence of Matrigel.</a> Stem Cells Dev. 18, 47-54 (2009).</li>
<li>Hameed, O., Sublett, J., Humphrey, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+stains+for+p63+and+alpha-methylacyl-CoA+racemase%2C+versus+a+cocktail+comprising+both%2C+in+the+diagnosis+of+prostatic+carcinoma%3A+a+comparison+of+the+immunohistochemical+staining+of+430+foci+in+radical+prostatectomy+and+needle+biopsy+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Surg.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical stains for p63 and alpha-methylacyl-CoA racemase, versus a cocktail comprising both, in the diagnosis of prostatic carcinoma: a comparison of the immunohistochemical staining of 430 foci in radical prostatectomy and needle biopsy tissues.</a> Am. J. Surg. Pathol. 29, 579-587 (2005).</li>
<li>Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+human+prostatic+epithelial+model+of+hormonal+carcinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">A human prostatic epithelial model of hormonal carcinogenesis.</a> Cancer Res. 61, 6064-6072 (2001).</li>
<li>Yao, V., Parwani, A., Maier, C., Heston, W. D., Bacich, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moderate+expression+of+prostate-specific+membrane+antigen%2C+a+tissue+differentiation+antigen+and+folate+hydrolase%2C+facilitates+prostate+carcinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Moderate expression of prostate-specific membrane antigen, a tissue differentiation antigen and folate hydrolase, facilitates prostate carcinogenesis.</a> Cancer Res. 68, 9070-9077 (2008).</li>
<li>Cunha, G. R., Cooke, P. S., Kurita, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+stromal-epithelial+interactions+in+hormonal+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Histol.+Cytol%22%5BJournal%5D)">Role of stromal-epithelial interactions in hormonal responses.</a> Arch. Histol. Cytol. 67, 417-434 (2004).</li>
<li>Xin, L., Ide, H., Kim, Y., Dubey, P., Witte, O. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+regeneration+of+murine+prostate+from+dissociated+cell+populations+of+postnatal+epithelia+and+urogenital+sinus+mesenchyme%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">In vivo regeneration of murine prostate from dissociated cell populations of postnatal epithelia and urogenital sinus mesenchyme.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, Suppl 1. 11896-11903 (2003).</li>
<li>Yu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+vectors+with+two+independent+internal+promoters+transfer+high-level+expression+of+multiple+transgenes+to+human+hematopoietic+stem-progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Lentiviral vectors with two independent internal promoters transfer high-level expression of multiple transgenes to human hematopoietic stem-progenitor cells.</a> Mol. Ther. 7, 827-838 (2003).</li>
<li>Anderson, J. S., Bandi, S., Kaufman, D. S., Akkina, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+normal+macrophages+from+human+embryonic+stem+%28hES%29+cells+for+applications+in+HIV+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Retrovirology%22%5BJournal%5D)">Derivation of normal macrophages from human embryonic stem (hES) cells for applications in HIV gene therapy.</a> Retrovirology. 3, 24(2006).</li>
<li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126, 663-676 (2006).</li>
<li>Maherali, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-efficiency+system+for+the+generation+and+study+of+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">A high-efficiency system for the generation and study of human induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 3, 340-345 (2008).</li>
</ol>

Yazarlar çalışma sundu ile herhangi bir çıkar çatışması var.

UGSM kullanarak doku rekombinasyon prostat gelişimi ve prostat kanseri inisiyasyon yol açan moleküler olayları araştırmak için inanılmaz faydalı bir tekniktir. UGSM bir endüktif potansiyel prostat araştırma çok çeşitli uygulamalar için kullanılmıştır; bu arttırıcı tümör stromal-epitelyal etkileşimler eğitim ve türler arası prostat rekombinantlar oluşturan, prostat hücre hatları ve tümörlerin almak dahil UGSM bir 7,17-20 doğru hazırlanması. Bununla birlikte, kemirgen epitel kirlenmesine glandüler oluşumuna ned...

Prostat kanserinin daha iyi insan modeli sistemleri için çok büyük bir ihtiyaç vardır. Özellikle, genetik olarak, prostat kanseri başlatılmasında belirli genlerin rolünü anlamak için manipüle edilebilir, normal, habis olmayan prostat dokularında ilgili insan modeli sistemler çok bilgilendirici olacaktır. Genomik çağın habercisi kanser oluşumunda rol olabilir çok sayıda gen tespit etti. Deneysel insan modeli sistemlerinin eksikliği, ancak, ciddi fonksiyonel test etmek ve aday prostat kanseri yatkınlık genleri karakterize yeteneğimizi bozar. İdeal bir model sistem uygun transgenik kemirgen model sistemler ile birlikte kanser duyarlılık genlerin hızlı ve daha hızlı fonksiyonel analiz kolaylaştıracaktır. Ayrıca, bu tür bir insan modeli sistemine yeni tedavilerin keşfi ve doğrulama doğru kanser prostat sinyal mekanizmalarının moleküler karakterizasyonu sağlayacakprostat kanseri oluşumunu önler. İnsan embriyonik kök hücreleri (hESC) xenogreftler insan prostat dokusu oluşturma yeteneğine sahiptir. 2006, Taylor et al. HESC 8-12 haftalık bir süre içinde kemirgen ürogenital sinüs mezenşim (UGSM) ile tekrar kombine edildiğinde in vivo olarak prostat epitel oluşturmak için uyarılabilir bildirmiştir. 1 Bu çalışmalar ile daha önceki çalışmaları dayandırılsaydı Bu kemirgen embriyonik UGSM gösteren Cunha laboratuvar 2,3 Prostat ürogenital sinüs (UGS) olarak adlandırılan bir embriyonik anlagen gelişir. kök hücre ve in vivo olarak embriyonik epitel hücre popülasyonlarının prostat farklılaşma teşvik ve önce embriyonik gün 17 (fare E17 olabilir , sıçan gün E18) UGS kaldırılır ve fiziksel olarak bölünmüş epitel (UGSE) içine ve mezenşimin (UGSM) 4 Bu doku rekombinasyon yaklaşım önemli ölçüde prostat gelişimi ve kanser, özellikle anlayışımızı artırmıştır edilebilir.ly büyüme faktörü ve hormonal sinyal iletim yolakları ve prostat stroma, epitel arasındaki moleküler ilişkilerin. 5-8 Bu yöntem, kök ya da aynı ya da farklı türlerden epitel hücreleri ile UGSM arasında ex vivo kombinasyonu içerir ve bu hücre / doku rekombinantlar implante ve yetiştirilen ve fare konak içinde ksenograftları. 4,9 in vivo büyüme döneminden sonra, implant stromal doku içinde gömülü prostat epitelyal glandüler yapılar içerir. Ayrıca boyama gibi yapılar gerçekten prostat ve insan kaynaklı olup olmadığını belirlemek için yapılabilir. 10,11

<table><tbody><tr><td>Hank' s Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS)</td><td>GIBCO</td><td>14170</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>GIBCO</td><td>11330</td><td></td></tr><tr><td>R1881</td><td>Sigma</td><td>965-93-5</td><td>Etanolde 1 ug/ml'ye karıştırın (1.000x stok)</td></tr><tr><td>NEAA</td><td>GIBCO</td><td>11140</td><td></td></tr><tr><td>Kalem-Strep Çözeltisi</td><td>GIBCO</td><td>15070</td><td>100x stok</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>KETASET (ketamin hidroklorür) </td><td>Fort Dodge Hayvan Sağlığı</td><td>NDC 0856-2013-01</td><td>100 mg / ml; steril salin </td></tr><tr><td>AnaSed (ksilazin) </td><td>VET-A-MIX, Inc.</td> içinde 1:10 oranında seyreltin.<td>NADA 139-236</td><td>20 mg / ml; steril salin</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>BD Biosciences</td><td>215240</td><td></td></tr><tr><td>Kollajenaz </td><td>Sigma</td><td>C2014</td><td></td></tr><tr><td>Ketoprofen </td><td>Fort Dodge</td><td>NDC 0856-4396-01</td><td>100 mg / ml içinde 1:1,000 seyreltin; steril tuzlu su</td></tr><tr><td>Altalube göz merhemi </td><td>Altaire Pharmaceuticals, Inc.</td> içinde seyreltin<td>NLC 56641-19850</td><td></td></tr><tr><td>Leica MZ16 F Stereomikroskop</td><td>Leica</td><td></td><td>Herhangi bir iyi diseksiyon kapsamı kullanılabilir.</td></tr><tr><td>Vannas yaylı makas</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>15001-08</td><td></td></tr><tr><td>Şırınga</td><td>Hamilton</td><td>84855</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton İğne, Küçük RN, 28 gauge, 0.5 inç, Nokta Stili #3 (Künt)</td><td>Hamilton</td><td>7803-02</td><td>Özel İğne </td></tr><tr><td>Etanol Hazırlama Pedleri</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-669-62</td><td></td></tr><tr><td>Steril Gazlı Bez Pedleri</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-415-469</td><td></td></tr><tr><td>Ethicon Vicryl Sütür (4-0 FS-2)</td><td>MedVet International</td><td>J392H</td><td>İğneli, çözünebilir sütür </td></tr><tr><td>Autoclip 9 mm Yara Klipsleri</td><td>Becton Dickenson</td><td>427631</td><td></td></tr><tr><td>PVP İyot Hazırlık Pedleri</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-669-98</td><td></td></tr><tr><td>Künt uçlu disektör makası</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>14072-10</td><td></td></tr><tr><td>Dumont ince uçlu forseps</td><td>İnce Bilim Araçları</td><td>11252-50</td><td></td></tr><tr><td>Makaslı İğne tutucu</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>12002-14</td><td></td></tr></tbody></table>

kemirgen Ürogenital sinüs mezenşimin ve İnsan kök hücre doku rekombinasyon kullanarak İnsan prostat epiteli oluşumu

Formation of Human Prostate Epithelium Using Tissue Recombination of Rodent Urogenital Sinus Mesenchyme and Human Stem Cells

Prostat kanseri araştırmalarında ilerleme ciddi prostat hastalığın başlangıcında altta yatan genetik ve moleküler olayları anlamak için yeteneğimizi sınırı insan kaynaklı ve hormon-naif model sistemler, durumu ile sınırlıdır. Kanser insan prostat çalışmak için daha iyi bir model sistemlerinin geliştirilmesi doğru, biz ve diğerleri, embriyonik kemirgen prostat stromanın eşsiz yanlısı prostat endüktif potansiyel yararlanmaktadır ürogenital sinüs mezenşimin (UGSM) olarak adlandırdığı. Embriyonik kök hücreleri gibi belirli pluripotent hücre popülasyonu ile rekombine olduğunda, UGSM bir testosteron bağımlı bir şekilde normal bir insan prostat epitel oluşumuna neden olur. Böyle bir insan modeli sistemi araştırmak ve deneysel olarak tipik bir kemirgen transgenik çalışmalara kıyasla daha hızlı bir biçimde aday prostat kanserine yatkınlık genlerinin yeteneğini test etmek için de kullanılabilir. İnsan embriyonik kök hücreleri (hESC) genetik kültür istimal olarak değiştirilebilir yanadoku rekombinasyon önce g indüklenebilir gen veya siRNA knock-down vektörler, böyle bir model genlerin fonksiyonel sonuçları test kolaylaştırır, ya da teşvik ya da kanser önlemek için düşünülen gen kombinasyonları,. UGSM hücre saf nüfus izole tekniği, ancak zordur ve genellikle öğrenme önceki uzmanlık kimse ile kişisel olarak öğretmek gerekir. Dahası, immün sistemi baskılanmış ana böbrek kapsülü altında hücre karışımlarının aşılama teknik zor olabilir. Burada anahat ve kemirgen embriyo ve insan prostat epitel oluşturmak için doku karışımları böbrek kapsül implantasyon gelen UGSM uygun izolasyon göstermektedir. Böyle bir yaklaşım, mevcut aşamada, embriyonik kök hücrelerin xenografting in vivo gerektirir; gelecekteki uygulamalar potansiyel in vitro bezi oluşumu veya uyarılmış pluripotent kök hücre popülasyonlarının (iPSCs) kullanımı dahil olabilir.

Taylor ve ark. Tarafından heyecan verici rapor üzerine inşa, bizim laboratuar yaygın olarak kullanılan H1 (NIH-tahsis edilmiş WA01, genetik olarak erkek) insan embriyonik kök hücre hattı. 1 Bu satır sıkı kalite kontrol için test edilmiş ve kullanarak bir yerleştirilmesiyle protokolü geliştirdi karyotipik normaldir 13 uygun kültüre zaman, embriyonik kök hücreleri genişletilmiş, muhafaza ve besleyici içermeyen kültür yöntemi (Kök Hücre Teknolojileri ile ticari besleyici ücretsiz sistemleri, ...

Prostat kanseri başlangıcı, yeni ve yenilikçi insan model sistemler ve yaklaşımlar altında yatan en erken moleküler mekanizmaları umutsuzca ihtiyaç vardır çözülmeye. Insan prostat epitel oluşturmak için pluripotent kök hücre popülasyonlarının ikna etmek için önceden prostat ürogenital sinüs mezenşimin (UGSM) potansiyel prostat araştırma güçlü deneysel bir araçtır.

Kemirgen Ürogenital Sinüs mezenşimin ve İnsan Kök Hücre Doku Rekombinasyon kullanarak İnsan Prostat epiteli oluşumu

Progress in prostate cancer research is severely  limited by the availability of human-derived and hormone-na&iuml;ve model systems,  which limit our ...

Bu prosedürün genel amacı, kemirgen embriyolarından ürogenital sinüs mezenşimini (UGSM) izole etmek ve insan prostat epitelyumu oluşturabilen doku karışımlarını renal kapsüle implante etmektir. Bu işlem, öncelikle fare veya sıçan embriyolarından ürogenital sinüsün izole edilmesiyle gerçekleştirilir. Ardından, ürogenital sinüs mezenşimi epitelden ayrıştırılır.Ardından, ürogenital sinus mezenşiminin tek hücre süspansiyonları plüripoten kök hücrelerle birleştirilir. Son olarak, hücre karışımı bir konak fareyle renal kapsül altına implante edilir. Nihayetinde, insana özgü PSA ekspresyonunun doğrulanması yoluyla, fare böbreği üzerinde insan prostat epitelinin oluştuğunu gösteren sonuçlar elde edilebilir.Bu yöntem prostat fonksiyonu ve hastalık başlangıcı hakkında bilgi sağlayabilse de, insan prostat tümörlerinin ksenogrefti ve tümör oluşturmak amacıyla haftalık tümörijenik hücre hatlarının indüklenmesi gibi diğer sistemlere de uygulanabilir. Zamanlanmış gebe bir fare veya sıçanı ötanize edip embriyoları izole ettikten sonra, onları amniyotik keseden ayırın, göbek kordonunu kesin ve buz gibi soğuk hanks içeren 50 mililitrelik bir tüpe aktarın. Dengeli tuz çözeltisini kullanın ve buz üzer

formation-human-prostate-epithelium-using-tissue-recombination-rodent

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Bu videoda, izole fare prostat epitel hücrelerinin matris jel halkası bazlı bir kültür tekniği kullanılarak kültürlenmesini gösteriyoruz. Bu yaklaşım, genetik veya farmakolojik manipülasyona yanıt olarak prostat epitel hücrelerinin 3D glandüler yapılar oluşturmak için farklılaşma kapasitesi hakkında tamamlayıcı bilgi sağlayabilir.

Prostat Organoid Testi: Prostat Epitel Hücrelerinin Farklılaşma Kapasitesini İncelemek İçin Matris Jel Halka Bazlı Ex Vivo Kültür Tekniği

Bu videoda, bir erkek fare modelinden ürogenital sistem veya UGS'nin diseksiyonu prosedürünü açıklıyoruz. Bu UGS, prostat bezini izole etmek ve prostat kanseri gelişimindeki rolünü incelemek için ex vivo olarak daha da diseke edilir.

Fare Ürogenital Sisteminden Prostat Çıkarılması: Erkek Farede Prostat Bezini Diğer İdrar ve Genital Sistem Organlarından Ayırma Tekniği

Bu farelere, sıkıştırılmış hormon peletlerin üretimi, hem de deri altından cerrahi implantasyon açıklar. Bu strateji, hormonal karsinojenezi ve iyi huylu prostat büyümesi düzenleme değerlendirmek için atimik çıplak farelerin böbrek kapsülünün altına hücre ve doku senograflarının büyümesi ile kombine edilebilir.

Prostat Karsinogenezde ve İyi Huylu Prostat Büyümesi ve Değerlendirilmesi için böbrek Kapsül Xenografting ve Derialtı Pelet İmplantasyonu

Bu protokol, Sprague Dawley sıçan böbreklerinin, deterjanların vaskülatür yoluyla antegrad perfüzyonu yoluyla hücreden arındırılmasını tanımlar ve insan böbrek epitel hücreleri ile yeniden popülasyon için şablon görevi gören aselüler renal hücre dışı matrisler üretir. Büyümeyi izlemek için resazurin perfüzyon testinin yeniden hücreselleştirilmesi ve kullanımı, özel olarak tasarlanmış perfüzyon biyoreaktörleri içinde gerçekleştirilir.

Epitel Hücre Repopulation ve Böbrek Doku Kalkınma Kemirgen Ekstrasellüler Matriks iskelelerinin hazırlanması

Bu el yazması laboratuvar fare prostat mikro diseksiyon ve cerrahi kastrasyon için protokolleri açıklar. Biz de bu protokoller tarafından üretilen temsilcisi sonuçları tasvir. Son olarak, biz avantaj ve bu protokollerin kullanımını tartışmak.

Mürin Prostat Mikro-diseksiyon ve Cerrahi Kastrasyon

Genetik fareler prostat kanseri mekanizmaları araştıran için yararlı modellerdir. Burada bir fare ürogenital sistemden prostat loblar incelemek, Histoloji üzerinde göre ayırt etmek ve yalıtmak ve pulcuklarının aşağı akım analizleri için olarak birincil Prostat hücreleri vitro kültür için bir iletişim kuralı mevcut.

Kimlik, histolojik karakterizasyonu ve için fare Vitro 3D küresel kültür modelleri prostat lob diseksiyonu

Burada, insan birincil prostat organoid kullanım kılavuzu sonra fenotip değerlendirmek için bitiş noktaları önermek için bir protokol mevcut. Tohum, kültür bakım, matris jel, kurtarma morfolojik miktar, katıştırma ve kesit, FFPE kesit, Bütün Dağı boyama ve ticari deneyleri uygulanması anlatılmaktadır.

Kullanım ve insan birincil prostat Organoid kültürü değerlendirilmesi

Fare prostat organoidleri farklılaşmayı düzenleyen mekanizmaları değerlendirmek için umut verici bir bağlam temsil eder. Bu makalede prostat organoidleri kurmak için geliştirilmiş bir yaklaşım açıklanır ve (1) organoidlerden protein lysate toplamak için yöntemler tanıttı, ve (2) tam monte konfokal mikroskopi için düzeltve leke organoidler.

Organoid Kültürü Kullanarak Fare Prostat Epitel Hücrelerinin Ayırt Etme Kapasitesinin Değerlendirilmesi

Rekonstrüktif cerrahi için doku mühendisliği implantları, karmaşık ve pahalı iskele bileşenleri içeren zahmetli ex vivo kültürleme nedeniyle nadiren klinik öncesi çalışmaların ötesine geçer. Burada, otolog mikrogreftler içeren erişilebilir kollajen bazlı tübüler iskele ile üriner diversiyon için tasarlanmış tek aşamalı bir prosedür sunuyoruz.

Minipiglerde Tek Aşamalı Doku Mühendisliği Ürotelyal Tüpler için Cerrahi Model

Bu protokol, 2D olarak yetiştirilen bir mare prostat organoidi tabanlı modelin oluşturulmasını tanımlar. Organoid ayrıştırma, hücre tohumlama, farklılaşma, epitel bütünlüğü değerlendirmesi ve üropatogenik Escherichia coli ile in vitro enfeksiyonu içerir. Model, apikal erişilebilirlik sağlar ve geleneksel 3B organoid sistemlerin sınırlamalarını aşarak konak-patojen etkileşimlerini incelemek için uygundur.

Konak-Patojen Etkileşimlerini İncelemek İçin Fare Prostat Organoid-Tabanlı Modelin Oluşturulması

Bu protokol, akım sitometrisi, immünboyama ve organoid kültür dahil olmak üzere aşağı akış analizleri için yetişkin dişi fare üretrasının epitel tabakasının izole edilmesi için optimize edilmiş bir yöntem sunar. Yöntemler, akış sitometrisi analizi, tam montaj görüntüleme ve verimli organoid oluşumu ile zenginleştirilmiş ve canlı üretral epitel hücreleri elde etmiştir.

Tek Hücreli ve İmmünoflüoresans Analizi İçin Dişi Fare Üretral Epitelini İzole Etmek İçin Optimize Edilmiş Bir Yöntem

Keşfedin, kemirgen UGSM izolasyonu ve kök hücre rekombinasyonuyla insan prostat epiteli oluşumunu inceleyin. Bu yöntem, prostat kanseri başlangıç mekanizmalarını anlamak için değerli bir model sunar.

Kemirgen Ürogenital Sinüs mezenşimin ve İnsan Kök Hücre Doku Rekombinasyon kullanarak İnsan Prostat epiteli oluşumu

Daha fazla video keşfet