Basınç kasılmaların kâğıda çizilmesi kullanarak Murine Direnç Arter Fonksiyon değerlendirilmesi

Aşağıdaki deneyin genel amacı, fare direnç arterinin in vitro ve fizyolojik koşullara yakın şartlardaki gerçek zamanlı vasküler reaktivitesini belirlemektir. Bu işlem, damarın küçük bir segmentinin iki mikro kanüle monte edilmesi ve fizyolojik lüminal basınçta tutulmasıyla gerçekleştirilir. Ardından, herhangi bir ilacın damarı genişletme yeteneğini incelemek amacıyla, damar bir alfa bir reseptör agonisti olan fenilefrin ile daraltılır.

Daralmış damarın asetilkolin ile uyarılması, endotel bağımlı bir mekanizma aracılığıyla genişleme yeteneğinin gerçek zamanlı olarak değerlendirilmesini sağlar. Sonuçlar, asetilkoline yanıt olarak lümen çapındaki yüzde değişimi göstermekte ve SGC alpha one eksikliğinin endotel bağımlı vazodilasyonun bozulmasına yol açtığını doğrulamaktadır. Bu tekniğin tel mamografisi gibi mevcut yöntemlere kıyasla temel avantajı, basınç mamografisinin, kan basıncı homeostazının korunmasında büyük iletim damarlarına göre daha önemli olan küçük mikrodamarların karakterize edilmesine olanak tanımasıdır.

Bu yöntem, makro dirençli damarların kritik rol oynadığı hipertansiyon gibi kardiyovasküler alandaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. İşleme bir fareyi pentobarbital ile ötanize ederek başlayın. Ardından karın boşluğunu açın ve mezenterik dokuyu diseke etmeye başlayın.

Şimdi üçüncü derece bir mezenterik arteri belirleyin ve onu bağ ve yağ dokusundan izole edin. Mikrodamar seviyesinde, damarların içinde kan olmadığında arterler ve venler arasında ayrım yapmak sorunludur. Bu nedenle, bu işlemin sağlam hayvanda yapılması tercih edilir.

Ardından, üçüncü derece mezenterik arterden iki ila üç milimetre uzunluğunda bir segment kesin ve bunu HEPES PSS tamponu içeren bir kaba yerleştirin. Arter segmenti herhangi bir dallanma içermemelidir.

Kanülleri, giriş ve çıkış valfleri aracılığıyla 10 mililitrelik bir şırınga kullanarak yavaşça HEPES PSS çözeltisi ile doldurarak myo kabini hazırlayın; aşırı basıncın kanüllere bağlı hassas transdüsere zarar verebileceğini unutmayın. Kanülleri tamamen doldurduktan sonra her iki valfi de kapatın. Şimdi izole edilen arter segmentini kabine aktarın ve damarın bir ucunu sağ kanüle sabitleyin.

İnce bir naylon sütür ile dikkatlice bağlayın; bir şırınga yardımıyla yıkayın ve giriş valfi aracılığıyla damarı HEP çözeltisi ile doldurun. Şimdi damarın diğer ucunu sol kanüle monte edin ve kanülü naylon sütür ile damara sabitleyin. Hazneyi 10 milliliters kadar HEP çözeltisi ile doldurun.

Bir şırınga yardımıyla giriş valfinden heap çözeltisini nazikçe iterek sızıntı kontrolü yapın. Şimdi hazneyi video kamerasının altına yerleştirin. Giriş valfi kapalıyken ve ilk heap çözeltisi rezervuarından gelen P1 tüpüne bağlıyken, oksijeni başlatın ve hazneyi 37 °C'ye ısıtın.

Tüpte hiç kabarcık kalmayana kadar tüm kabarcıkların ve çözeltinin tüpten geçmesine izin verin. Ardından valfi açın. P iki numaralı tüp ile haznenin sol valfine bağlayın.

Basınç regülatöründen başlayarak tüm sistemde hava kabarcığı veya sızıntı olmadığından emin olun. myo arayüz panelindeki veya yazılımdaki basınç menüsüne gidin; akışı kapatırken pompayı çalıştırın. Programı açın ve topla butonuna tıklayın.

Damar lümen çapının ve duvar kalınlığının izlenmesi ve analizi artık mümkündür. Lümen içi basıncı kademeli olarak artırmak için P1 basıncını seçin ve artan bir basınç dizisi girin. Basınç 5 ile 60 mmHg değerlerine yükselirken damarlar bazen bükülebilir veya kıvrılabilir; bu nedenle, dikey veya boylamsal bir mikro konumlandırıcı yardımıyla gerginliği veya zorlamayı uygun şekilde ayarlayın.

Basınç 60 mm'ye ve banyo 37 °C'ye ulaştığında, dengeleme süresi boyunca kabı en az 45 dakika ve bir saate kadar dengeleyin. Banyo solüsyonunu bir kez önceden ısıtılmış solüsyonla değiştirin. Arteriyel kesit dengelendiğine göre, 37 °C'de 10 mL potasyum klorür depolarizasyon solüsyonu uygulayın.

Düz kas tamamen depolarize olacak ve maksimum daralmaya ulaşacaktır. Stabil bir daralma elde ettikten sonra, banyoyu 10 dakikalık aralıklarla üç kez HEP çözeltisi ile durulayın. Şimdi damarın canlılığını ve endotelin bütünlüğünü kontrol edin.

İlk olarak, 10⁻⁵ mol/L konsantrasyona ulaşacak şekilde fenilefrin ekleyerek damarı önceden daraltın. Stabil bir daralma elde edildiğinde, 10⁻⁹ ile 10⁻⁵ mol/L arasında artan dozlarda asetilkolin ardışık olarak ekleyerek kümülatif konsantrasyon vazodilatasyon yanıt eğrisi oluşturun. Son asetilkolin dozundan sonra, preparatı 10 dakikalık aralıklarla üç kez HEPES ile yıkayın.

Şimdi, kaydedilen izlerden faydalanarak, litre başına iki milimol EGTA içeren kalsiyumsuz PSS uygulayarak pasif lümen çapını belirleyin. Tüm parametrelerin hesaplanmasında kullanılacak olan lümen çapını her doz yanıtı için ölçün. Asetilkolin gevşeme yanıtını, agonist tedavisi ile kalsiyumsuz tamponun, fenilefrinle indüklenen konstriksiyonu lümen çapı açısından ne kadar değiştirdiğinin bir karşılaştırması olarak ifade edin.

Vild tip ve S6 ve B6 arka planlarına sahip SGC alpha one nakavt farelerden izole edilen ve fenilefrin ile önceden daraltılan mezenterik direnç arterlerinde, asetilkoline yanıt olarak gelişen vasküler relaksasyonu incelemek için durum basınçlı miyografi kullanılmıştır. SGC alpha one eksikliğinin, incelenen farelerin genetik arka planından bağımsız olarak, asetilkolinin vasküler relaksasyonu indükleme yeteneğinin azalmasıyla ilişkili olduğu görülmüştür. Bununla birlikte, SGC Alpha one null farelerin endotel bağımlı relaksasyonu, S6 arka planında B6 arka planına göre daha belirgin şekilde bozulmuştur.

Bu bulgular birlikte, damar sisteminin endotel bağımlı gevşemeye karşı azalmış duyarlılığının, SGC Alpha one nakavt farelerdeki streine özgü hipertansiyona katkıda bulunabileceğini göstermektedir. Uzmanlaşıldığında, bu teknik uygun şekilde uygulandığı takdirde bir veya iki saat içinde tamamlanabilir. Bu prosedüre ek olarak, canlı kan damarları üzerinde konfokal mikroskopi gibi diğer yöntemler eş zamanlı olarak uygulanabilir. Bu durum, örneğin, altta yatan sinyal mekanizmalarının tanımlanmasına yardımcı olabilecek hücre içi demir konsantrasyonlarının ölçülmesine olanak tanır.