Bilinçli Farelerde Glomerüler Filtrasyon Hızı Ölçümü için bir Yüksek verimli Yöntemi

Bu prosedürün genel amacı, diğer araştırmacılara uyanık farelerde böbrek fonksiyonunun nasıl belirleneceğini göstermektir. Bu, önce 24 saat boyunca diyaliz, floresein izotiyosiyanat veya FSE inülini ve enjeksiyon için konsantrasyonunun belirlenmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, fareyi tartmak, retrobulbar enjeksiyon için doğru hacimlerde fitzy inülin hazırlamak ve fareyi uyuşturmaktır.

Daha sonra, Retrobulbar Fitzy inülin enjeksiyonu gerçekleştirilir ve 75 dakikalık bir süre boyunca sekiz kan örneği alınır. Son adım, bir mikro hacimli floro spektrometresi kullanarak Fitz Nulin'i ölçmek ve iki fazlı bir üstel bozunma modeli kullanarak böbrek fonksiyonunu hesaplamaktır. Sonuç olarak, Fiti Nulin tek bolus enjeksiyon yönteminin hassasiyetini floro spektrometrenin mikro hacim kapasitesi ile birleştirmek, farelerdeki genetik modifikasyonlar, diyet değişiklikleri veya ilaç uygulamalarının neden olduğu böbrek fonksiyonundaki farklılıkların tespit edilmesine olanak tanır.

Bu tekniğin sürekli infüzyon ve anestezi koşulları, radyoaktif inülin kullanan ozmotik mini pompaların implantasyonu gibi mevcut yöntemlere göre en önemli avantajları ameliyat gerektirmemesidir. Bu bir terminal deneyi değildir. İdrar toplanmasına gerek yoktur ve günde 24 M'ye kadar ölçüm yapmak mümkündür.

Bu prosedürü, Fitzy Nulin enjeksiyon solüsyonunu hazırlamak için laboratuvarımdan bir araştırma görevlisi olan Maria Azimo ile birlikte göstereceğim. % 5'lik bir çözeltinin iki mililitresi için yeterli ZI inülini tartın, etiketli inülini tamamen eriyene kadar 90 santigrat dereceye ısıtarak% 0.85 sodyum klorür çözeltisi içinde çözün. Membrandan kalan sodyum asidi çıkarmak için 20 santimetrelik bir diyaliz membranı parçasını 30 dakika boyunca çift damıtılmış suya yerleştirin, daha sonra membranı birkaç kez yıkayın, diyaliz membranını çözünmüş fitzy inülin contası ile kapaklarla düzgün bir şekilde doldurun ve ardından tüm membranı tartın.

Çözünmüş fitzy inülinin bir litre% 0.85 sodyum klorür çözeltisi içinde diyalize girmesine izin verin ve diyalizi takiben oda sıcaklığında 24 saat boyunca ışıktan korunarak yavaşça karıştırın, tüm diyaliz membranını tekrar tartın ve yeni konsantrasyonu hesaplayın. Su ozmotik olarak zarın içine doğru hareket edecek ve bağlanmamış FSI zarın dışına çıkacaktır. Böylece, FSI inülin konsantrasyonu önemli ölçüde azalacaktır.

C'nin yeni konsantrasyon olduğu bu formülü kullanarak yeni fit e inülin konsantrasyonunu hesaplayın. N, başlangıçtaki uygun E inülin miktarıdır ve V, diyaliz öncesi ve sonrası diyaliz tüpünün ağırlığındaki fark ve ayrıca ilk fitzy inülin çözeltisinin hacmi olan yeni hacimdir. Daha sonra, diyaliz solüsyonunu 0.22 mikronluk bir şırınga filtresinden süzülerek sterilize edin.

Deneyden önce foto ağartmayı önlemek için fitzy inülini her zaman ışıktan korumayı unutmayın. Fareleri %4 ila %5 ISO flor ile kısa bir süre uyuşturduktan sonra farelerin vücut ağırlığını alın. Toin refleksi ile anestezi derinliğini kontrol edin, hava kabarcıklarını gidermek için yarım inç uzunluğunda 26 gauge iğne ile 100 mikrolitrelik bir Hamilton şırınga kullanarak diyaliz fitzy nulin vücut ağırlığının gramı başına iki mikrolitre aspir edin, ardından enjeksiyon için yarım inç uzunluğunda, 30 gauge iğneye geçin.

Diyalize edilmiş fitzy inülini retroorbital pleksusa enjekte etmeye devam edin. Farelerin ev kafeslerinde kendiliğinden iyileşmelerine izin verin. Bir milimetre fare kuyruğunu bir kez makasla kaplayın ve sodyum heparin mini kılcal damarlarına enjeksiyondan sonra birden fazla zaman noktasında kan toplayın.

Kan alındıktan sonra mini kılcal damarları cha contası ile kapatın ve numuneleri ışıktan koruyun. Mühürlü mini kılcal damarları hematokrit kılcal damarlarının içine koyun ve santrifüjlemeyi takiben beş dakika santrifüjleyin. Elmas kesici kullanarak mini kılcal damarları kırın ve tüm plazmayı pipetleyerek 0,2 mililitrelik bir tüpe aktarın.

Yeni bir 0,2 mililitrelik tüpte iki mikrolitre plazma ve litre başına 18 mikrolitre 0,5 mol kullanarak bir ila 10 seyreltme yapın. Daha sonra, seyreltilmiş numunenin iki mikrolitresini NanoDrop 3, 300 ile altı farenin yüksek verimi için çift olarak ölçün. Tek bolus enjeksiyon yöntemiyle tüm böbrek GFR'sini ölçmek için lütfen metin protokolünde verilen akış şeması protokolünü izleyin: FSE nulin enjeksiyonundan 3, 5, 7, 10, 15, 35, 56 ve 75 dakika sonra sekiz kan örneği toplanmalıdır.

Bu akış şemasında, sayılar toplama zaman noktalarını gösterirken, parantez içindeki sayılar numune numarasını gösterir dikey kırmızı çizginin solundaki zaman noktaları enjeksiyon zaman noktalarını gösterir. Her fare farklı bir renkle işaretlenmiştir. Sıralı kan alımları almak için okları takip edin.

Gri kutular, bu protokolü kullanarak enjeksiyondan önce bir sonraki farenin flor anestezisi için ne zaman hazırlanması gerektiğini gösterir. Farklı farelerden iki kan alımı arasındaki minimum süre, metin protokolünde listelenen standart seyreltmeleri elde etmek için seyreltilmiş fare plazması ile bir dakikalık seyreltilmiş fitzy nulin enjeksiyon çözeltisidir. Standartların konsantrasyonu diyalize bağlı olacaktır ve FSI nulin'in her bir preparatı için her zaman farklı olacaktır.

Bu nedenle, her seferinde standart eğri için konsantrasyonun girilmesi gerekir. Bilinçli farelerde GFR'yi ölçmek için metin protokolünde ayrıntılı olarak açıklandığı gibi iki fazlı üstel bozunma fonksiyonu kullanarak glomerüler filtrasyon hızını veya GFR'yi uygun yazılımla hesaplamak için verileri analiz edin. GFRA'nın hesaplanması için tek doz intravenöz enjeksiyonu takiben ZI inülinin plazma kinetiği kullanılırken, iki bölmeli modelde iki bölmeli model kullanılmıştır.

İlk hızlı bozunma fazı, fitzy inülinin intravasküler bölmeden hücre dışı sıvıya yeniden dağıtılmasını temsil eder. Fitzy inülin konsantrasyonunda daha yavaş bozunma ile sonraki faz, ağırlıklı olarak plazmadan sistemik klerensi yansıtır. Tip 1 diabetes mellitus, streptozotosinin intraperitoneal uygulaması ile indüklendi.

Diyabet indüksiyonundan önce ve indüksiyondan beş hafta sonra GFR belirlendi, tip bir diyabetik hayvanlarda glomerüler hiperfiltrasyon belirgin olarak görülüyordu. Bu videoyu izledikten sonra, tek bir bolus enjeksiyon tekniği kullanarak ve iki fazlı üstel bir DK modeli kullanarak büyük farelerde GFR'nin nasıl ölçüleceğini iyi anlamış olmalısınız.