İnsan Cilt Biyopsiler içinde Nosiseptif İntraepidermal Sinir Elyaf üç boyutlu görüntüleme

Bu prosedürün genel amacı, ağrılı nöropati ile ilişkili intraepidermal sinir liflerinin morfolojik değişikliklerini üç boyutlu görüntüleme aracılığıyla incelemek için insan deri biyopsi kesitlerinde immünohistokimya gerçekleştirmektir. Bu işlem, öncelikle münferit insan deri biyopsi kesitleri üzerinde üç günlük yüzer kesit immünohistokimya protokolünün uygulanmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım ise, 50 mikron kalınlığındaki deri kesitlerinin konfokal mikroskop kullanılarak görüntülenmesidir.

Ardından, orijinal immunofloresan görüntülerinden üç boyutlu bir film dosyası oluşturmak için akış görünümü görüntü dosyaları MRS yazılımı ile çalıştırılır. Son adım, film dosyasını sıkıştırmak için vdw yazılımı veya benzeri bir yazılım kullanmaktır. Nihayetinde, üç boyutlu görüntüleme sonuçları, ağrılı nöropati ile ilişkili morfolojik değişikliklerin incelenmesine olanak tanır.

Günümüzde, intraoperatif epidermal sinir lifi yoğunluğu, nöropatiyi teşhis etmek için nicel bir yöntem olarak kullanılmaktadır. Bu intradermal sinir liflerinin nosiseptif biyobelirteç ile birlikte etiketlenmesi, bu komplikasyonla ilişkili ağrıya ışık tutma potansiyeline sahiptir. Mevcut iki boyutlu görüntüleme protokolü, sinir liflerinin üst üste binmesi de dahil olmak üzere birçok sınırlamaya sahiptir.

Buna karşılık, üç boyutlu görüntüleme, aksonal şişme ve beyazlama gibi nöropati ile ilişkili morfolojik değişikliklerin yanı sıra aksonal hacim ölçümleri için daha detaylı analiz imkanı sunar. Anlamlı üç boyutlu animasyonlar oluşturmak için kaliteli görüntüler elde etmek adına gerekli önlemlerin alınması gerektiğini belirtmek önemlidir; bu yöntem ağrılı nöropati hakkında bilgi sağlayabilir. Ayrıca, üç boyutlu morfolojideki karmaşık değişiklikleri incelemek ve ölçmek için kalın organ kültürleri veya üç boyutlu hücre kültürleri gibi diğer örneklere de uygulanabilir.

Bu protokolün yazılı kısmında belirtildiği şekilde insan deri biyopsileri fikse edilip kesitleri alındıktan sonra, bu görüntüde gösterildiği gibi boyama için kullanılacak bir 96 kuyucuklu plakayı etiketleyin. Ardından, etiketlenen 96 kuyucuklu plakanın birinci sırasındaki her bir kuyucuğa 150 µL image ITFX sinyali ekleyin ve ikinci ile üçüncü sıradaki tüm kuyucuklara 150 µL one XPBS pipetleyin. Bir hastanın distal bacak biyopsisinden alınan 50 mm'lik bir kesiti, image içeren kuyucuklardan birine aktarmak için bir ekim özesi kullanın.

Ardından, aynı hastanın proksimal beşlisinden alınan 50 milimetrelik bir kesit, görüntü içeren bir sonraki kuyucuğa aktarılır. Bu prosedür, diğer üç hastadan alınan distal bacak ve proksimal uyluk kesitleri ile tekrarlanır. Kesitler, biyopsi kesitleri inkübe olurken düz bir sallayıcı üzerinde 30 dakika boyunca inkübe edilir; bu sırada %5'lik bir bloklama çözeltisi hazırlanır ve 30 dakika geçtikten sonra BSA tamamen çözünene kadar çözelti vortekslenir.

Kesitleri ikinci sıradaki PBS'ye aktarın ve 10 dakika boyunca sallayın, ardından üçüncü sıradaki PBS ile 10 dakika boyunca durulayın. Yine sallama işlemiyle birlikte, dördüncü sıradaki her bir kuyucuğa 150 µL %5'lik BSA bloklama çözeltisi pipetleyin ve kesitleri bu kuyucuklara aktarın; kesitleri %5'lik BSA bloklama çözeltisinde, oda sıcaklığında, düz bir sallayıcı üzerinde bir ila iki saat inkübe edin. Bu inkübasyon sırasında, BSA tamamen çözünene kadar vorteksleyerek %1'lik durulama çözeltisini hazırlayın ve ardından primer antikorları bu çözelti içerisinde gerekli konsantrasyona seyreltin.

Ardından, 96 kuyucuklu plakanın beşinci sırasındaki kuyucuklara 150 µL seyreltilmiş birincil antikor ekleyin. İnkübasyon süresi dolduktan sonra, kesitleri bloklama solüsyonundan uygun birincil antikor kuyucuklarına aktarın. Daha sonra, kurumayı ve ışığa maruz kalmayı önlemek için plakayı parafilm ve alüminyum folyo ile kapatın ve düz bir sallayıcı üzerinde 4 °C'de gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün, altıncı, yedinci ve sekizinci sıradaki her bir kuyucuğa 150 µL %1 BSA yıkama solüsyonu ekleyin ve plakayı her yıkama sırasında ışıktan koruduğunuzdan emin olarak, oda sıcaklığında bir saat boyunca sallayarak kesitleri bu yıkama aşamalarından geçirin. Kesitler %1 BSA yıkama solüsyonundaki son durulamada inkübe olurken, ikincil antikorları protokollerin yazılı bölümündeki talimatlara göre %1 BSA yıkama solüsyonu ile seyreltin.

İnkübasyon süresi dolduğunda, 96 kuyucuklu plakanın dokuzuncu sırasındaki belirlenmiş kuyucuklara 150 µL seyreltilmiş sekonder antikor ekleyin. Kesitleri bu kuyucuklara aktarın, plakayı parafilm ve alüminyum folyo ile kapatın ve düz bir sallayıcı üzerinde 4 °C'de gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün, 10, 11 ve 12. sıralardaki her bir kuyucuğa 150 µL %1 BSA durulama çözeltisi ekleyin ve kesitleri daha önce olduğu gibi her bir çözeltide birer saat boyunca durulayın.

Biyopsi kesitleri %1BSA durulama çözeltisinin son durulama aşamasında inkübe edilirken, her seferinde bir lama 50 µL %1BSA durulama çözeltisi pipetleyerek mikroskop lamlarını hazırlayın. Kesiti son durulamadan çıkarın ve belirlenen mikroskop lamındaki 50 µL'lik %1BSA durulama çözeltisi damlasının içine yerleştirin. Kesitin konumunu optimize ettikten sonra, örneğe temas etmemeye dikkat ederek fazla %1BSA durulama çözeltisini ampul uçlu cam pipetle alın.

Mikroskop lamındaki biyopsinin yakınına DPI içeren bir damla prolonged gold anti fade montaj reaktifi damlatın. Ardından 22 by 22 milimetrelik bir mikroskop lameli alın ve biyopsi ile montaj reaktifi damlasının üzerine nazikçe yerleştirin. Bir pipet ucu kullanarak hava kabarcıklarını giderin ve fazla prolonged gold'ü silin.

Antifa reajanı. Her bölüm için işlemi tekrarlayın ve mikroskop lamlarının oda sıcaklığında, karanlıkta gece boyunca kurumasına izin verin; ertesi gün görüntüleme yapın. Floresan sinyallerini, 40 x yağ daldırma objektifli bir Olympus flow view 500 lazer taramalı konfokal mikroskop kullanarak görüntüleyin; burada flow view versiyon 5.0 yazılımı ile iki kat yakınlaştırma kullanılmıştır.

543 nanometre helyum neon yeşil lazeri ve 633 nanometre helyum neon kırmızı lazeri sırasıyla uyarmak için Alexa floor 4 88 ve Alexa floor 6 47'yi kullanın. Sinyalleri artırmak için her detektörün konfokal açıklıklarını 400 mikron olarak ayarlayın. Ardışık taramalar 10 24 x 10 24 çözünürlükte gerçekleştirilmelidir.

Sinyal ayrımını maksimize etmek için, MRSX 64 veya benzeri bir yazılımda önce akış görünümü dosyalarını açıp kalman iki kare ortalamasıyla akış görünümü yazılımı tarafından hesaplanan optimal tarama birimine dayanarak 1.2 mikron Z adım aralıklarını kullanarak üç boyutlu Z serileri yakalayın. 3D görüntü setlerini görselleştirmek için, sinire özgü sinyalin kontrastını artıracak şekilde ekranı gerektiği gibi ayarlayın. Dermal epidermal sınırı görselleştirmek için bir yüzey oluşturun.

Sınırı çizmek için çizim modundaki kontur aracını kullanın. Alttaki floresan sinyallerini görmek ve 3D floresan sinyallerinin durağan görüntülerini yakalamak için sınıra yarı saydam bir yüzey atayın. 3D videonun anlık görüntülerini oluşturmak için, saniyede 15 kare hızında animasyon yapılan ve 200 kareden oluşan videolar oluşturmak üzere animasyon özelliğini kullanarak bir 3D video seti animasyonu oluşturun.

Her videoyu ham AVI dosyası olarak kaydedin ve final AVI videosunu VirtualDub yazılımı veya benzeri bir yazılımla sıkıştırın. Bu video, nosiseptif intraepidermal sinir liflerinin 3B görüntülerini göstermektedir. İlk görüntü, toplam intraepidermal sinir liflerini temsil eden, yeşil renkli PGP pozitif intraepidermal sinir liflerini ve ayrıca nosiseptif intraepidermal sinir liflerini temsil eden, kırmızı renkli TRKA pozitif intraepidermal sinir liflerini göstermektedir.

Ve son olarak, birinci vakadan alınan bir deri örneğinde PGP pozitif nosiseptif intraepidermal sinir liflerini gösteren görüntü ortaya çıkmıştır; ölçek çubuğu 20 mikronu temsil etmektedir. Aşağıdaki video, ağrılı nöropatilerin intraepidermal sinir liflerindeki aksonal şişkinliklerin 3D görüntülerini göstermektedir. Ok uçlarıyla belirtilen aksonal şişkinlikler, subdermal pleksus içerisinde yeşil sinyal ile PGP tarafından etiketlenmiş intraepidermal sinir lifleri boyunca görülebilir.

İkinci vakadan alınan bir deri örneğinde, ölçek çubuğu 10 mikronu temsil etmektedir. Bu 3D görüntü, ağrılı nöropatinin intraepidermal sinir liflerindeki aksonal dallanmayı göstermektedir. Üçüncü vakadan alınan bir deri örneğinde, PGP ile yeşil sinyal şeklinde işaretlenmiş intraepidermal sinir lifleri boyunca, ok başlarıyla belirtilen aksonal dallanmalar görülebilmektedir.

Ölçek çubuğu 20 mikronu temsil etmektedir. Bu teknik bir kez ustalıkla öğrenildiğinde, immünohistokimya için günde üç buçuk saatten dört günde ve konfokal görüntüleme ile 3D animasyon için örnek başına 35 dakikada tamamlanabilir. Bu prosedür uygulanırken, numune örneklerinin yırtılmasını veya kopmasını önlemek için önlemler alarak dokuların uygun şekilde transfer edilmesi ve monte edilmesi gerektiğini hatırlamak önemlidir. Bu prosedürün ardından, kutanöz inovasyonun değerlendirilmesi için üç boyutlu tric analizi gibi diğer yöntemler, ek soruları yanıtlamak amacıyla gerçekleştirilebilir.

Örneğin, abdominal sinir liflerinin dallanması, ağrılı nöropati gelişiminde önemli bir rol oynar mı?