Name: İnsan Cilt Biyopsiler içinde Nosiseptif İntraepidermal Sinir Elyaf üç boyutlu görüntüleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 22 s
Description: Öğrenin, insan cilt biyopsilerinde immünohistokimya ve konfokal mikroskopi kullanarak ağrılı nöropatilerde intraepidermal sinir liflerinin morfolojik değişikliklerini üç boyutlu görüntüleme yöntemiyle incelemeyi.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Sağlık Hibeler Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenmiştir K08 NS061039-01A2, Nöroloji Araştırma ve Keşif ve Michigan Üniversitesi&#39;nde A. Alfred Taubman Tıp Araştırma Enstitüsü için Programı. Bu çalışma, Morfoloji ve Diyabet ve Sindirim ve Böbrek Hastalıkları Ulusal Enstitüsü&#39;nden Sağlık Hibe 5P90 DK-20572 Ulusal Enstitüleri tarafından finanse edilen Michigan Diyabet Araştırma ve Eğitim Merkezi, resmi Analizi Çekirdek kullanılır. Yazarlar nosiseptif biyolojik immünhistokimya tekniği ilk gelişimini desteklemek için insan deri örneklerinde kendi cömert bağış için Robinson Singleton ve Gordon Smith (Utah Üniversitesi) teşekkür etmek istiyorum.

Bir Bölüm: İmmünohistokimya Arka plan boyama Delme deri biyopsisi 96 oyuklu plaka hazırlanması ve önlenmesi insan denekler toplandı ve sabitleştirici çözelti içinde 12-24 saat (2% 0.75 M L-Lizin çözeltisi (pH 7.4) ile paraformaldehit ve 0,05 mM sodyum periodat) inkübe edilir 4 ° C sıcaklıkta, daha önce tarif edildiği 8. Örnekler daha sonra daha sonra montaj medya optimum kesim sıcaklık (OCT), bir kriyostat 50 mikron kalınlığında bölüme kesitli gömülü, en fazla 1 hafta için 4 az 20% gliserol ° C ile tuzlu su (PBS) tamponlu fosfat cryoprotected vardır. Aşağıda tarif edilen protokole eden bir 96-çukurlu plaka içinde serbest bir immünohistokimya geçmesi deri kesitleri, maksimum sayıda olası, 8 deri kesitleri için tasarlanmıştır. 1. GÜN: 1. Stratum corneum Non-spesifik İmmünreaktivitesi önlenmesi <ol><li> Etiket 96 oyuklu plaka Şekil 1 &#39;de gösterildiği gibi. </li&gt; <li> Resim-IT 96-plaka Satır 1 her kuyuya arka plan boyama 11,12, engelleme etkili FX Sinyal (Resim-IT), 150 ul ekleyin. </li><li> 96-kuyulu plakanın Sıra 2 ve 3, her kuyuya 1X PBS 150 ul ekle. </li><li> Hasta başına iki adet 50 mikron bölümleri edinin: DL alınan biyopsi itibaren bir bölümü, PT alınan biyopsi gelen bir bölüm. Bir aşılama döngü (LeLoop) morfolojik zarar görmemesi için bir sonraki durulama birinden bölümleri aktarmak için kullanılır. Yavaşça Resim-IT içeren, iyi Satır 1 bir birey haline, bir aşılama döngü kullanarak, her 50 mikron bölümü aktarmak. Düz rocker oda sıcaklığında 30 dakika için Resim-IT bölümleri inkübe edin. </li><li> Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca PBS 1X (satırlar 2 ve 3) ile iki kez bölümleri durulayın. Durulama arasında düz bir rocker plaka yerleştirin. </li></ol> 2. % 5 BSA Engelleme Çözümü ve% 1 Yıkama Çözüm hazırlanması <ol><li> Biyopsi bölümleri Resim-BT kuluçka olsa da, çözüm engelleme 5% hazırlamaktın (% 5 BSA tamamen eriyene kadar BSA,% 0.3 TX-100, 0.1 M PBS-Vortex çözelti) eklenmiştir. </li><li> Satır 4 her kuyuya% 5 BSA engelleme çözeltisi 150 ul ekle. </li><li> , Bir aşılama döngü kullanılarak,% 5 BSA bloke çözeltisinin bireysel kuyulara bölümleri transfer. Düz rocker 1-2 oda sıcaklığında saat 5% BSA engelleme çözümü bölümleri inkübe edin. </li></ol> 3. Primer Antikorlar 1% BSA Durulama Çözüm ve Seyreltme hazırlanması <ol><li> Kesitler% 5 BSA çözeltisi içinde bloke kuluçka iken,% 1 durulama çözeltisi (% 1 BSA,% 0.3 TX-100, 0.1 M PBS-BSA çözeltisi Vorteks tamamen eriyene kadar) hazırlanması. </li><li> Kesitler% 5 BSA engelleme çözeltisi içinde inkübe edilir olsa da,% 1 çözeltisi durulama primer antikorlar seyreltin. <ol><li> Sekiz bölümden (8 x 150 ul = 1.200 ml) 1.200 ul toplam gereklidir. Primer antikor 1.500 ul (% 20 ilave hacim kadar) içinde yapılır. </li><li> Birincil antikor çözeltiler: PGP, 1:500; Trk A,1:500 1% BSA çözeltisi durulama. </li></ol></li></ol> 4. İlköğretim Antikor içinde Kesitli Biyopsiler inkübasyonu <ol><li> 96-kuyulu plakanın belirlenmiş oyuklara (sıra 5) içine seyreltilmiş birincil antikor 150 ul ekle. </li><li> Belirlenen primer antikor kuyular (Satır 5) içine% 5 engelleme çözümü (Satır 4) bölümleri aktarın. </li><li> Kurutma ve hafif etkilenmemesi için parafilm ve alüminyum folyo ile 96 plaka mühür. </li><li> Düz bir rocker 96-plaka 4 O / N ° C inkübe edin. </li></ol> 2. GÜN: 5. % 1 BSA Yıkama Çözüm Biyopsiler durulayın <ol><li> Her Serisi 6 iyi, 7, ve 8 içine% 1 BSA durulama solüsyonu 150 ul ekleyin. </li><li> 1 saat oda sıcaklığında her bir kez% 1 BSA durulama çözeltisi (satır 6, 7 ve 8) ile bölümler üç kez yıkayın. Durulama arasında düz rocker alüminyum folyo ve yer ile plaka Kapak. </li></ol> 6. İkincil antikorlar seyreltilmesi &lt;ol&gt; <li> Bölümler (Satır 8),% 1 BSA durulama çözeltisinin son durulama içerisinde inkübe edilir olsa da,% 1 BSA durulama çözeltisi içinde seyreltilmiş sekonder antikor: <ol><li> Sekiz bölümden (8 x 150 ul = 1.200 ml) 1.200 ul toplam gereklidir. İkincil antikorlar 1.500 ul (% 20 ilave hacim kadar) içinde yapılır. </li><li> İkincil antikor seyreltileri:% 1 BSA durulama çözeltisi içinde Trk A (Alexa Fluor 647 eşek anti-keçi, 1:250) PGP (Alexa Fluor 488 eşek anti-tavşan, 1:250) için. </li></ol></li></ol> 7. İkincil Antikor içinde Kesitli Biyopsiler inkübasyonu <ol><li> 96-kuyulu plakanın kendi belirlenmiş oyuklara (satır 9) içine seyreltilmiş sekonder antikor, 150 ul ekleyin. </li><li> De ikincil antikor içine% 1 BSA engelleme çözümü (Satır 8) (Row 9) bölümleri aktarın. </li><li> Kurutma ve hafif etkilenmemesi için parafilm ve alüminyum folyo ile 96 plaka mühür. </li><li> Belirlenen sekonder antikor O bölümleri inkübe4 de / N ° düz rocker C. </li></ol> 8. % 1 BSA Yıkama Çözüm Biyopsiler durulayın <ol><li> Sıra 10, 11, ve 12 her kuyuya% 1 BSA yıkama çözeltisi 150 ul ekle. </li><li> 1 saat oda sıcaklığında her bir kez% 1 BSA durulama çözeltisi (satır 10, 11, ve 12) ile bölümler üç kez yıkayın. Durulama arasında düz bir rocker alüminyum folyo ve yer ile plaka Kapak. </li></ol> 9. Mikroskop Slaytlar ve Montaj Kesitli Biyopsiler hazırlanması <ol><li> Biyopsi bölüm 1% BSA durulama solüsyonu (Satır 12) Son yıkamada kuluçka olsa da, mikroskop slaytlar hazırlamak. </li><li> Her seferinde bir slayt üzerinde% 1 BSA yıkama çözeltisi 50 ul koyun. </li><li> 1% BSA durulama solüsyonu (Satır 12) bölümleri çıkarın ve belirlenen mikroskop lamı üzerine 1% BSA durulama çözüm 50 ul damla yerleştirin. Bölümün konumunu optimize sonra, önlemlerin alınması, bir soğan biçiminde cam pipet ile fazla% 1 BSA durulama çözüm kaldırmakörnek dokunmamak için. </li></ol> NOT: bölümünün üzerine katlanmış olmadığından emin olun, numune mikroskop lamı yüzeyine karşı düz olmalıdır. <ol start="4"><li> Yeri 1 damla mikroskop lamı üzerine biyopsi yakın DAPI ile reaktif montaj Altın antifade uzatır. Bir 22x22 mm mikroskop cam lamel alın ve yavaşça biyopsi üzerine yerleştirin ve bir damla DAPI damla ile Altın antifade reaktif uzatmak. Her bölüm için tekrarlayın. </li><li> Karanlıkta oda sıcaklığında O / N mikroskop slaytlar kurumasını bekleyin. </li></ol> NOT: Bir pipet kullanarak herhangi bir hava kabarcıklarını çıkarın. Altın antifade reaktif uzatmak uzak aşırı silin. Bölüm B: Konfokal Görüntüleme 10. Konfokal Görüntüleme <ol><li> 40X yağ daldırma (1.3 NA) objektif ve Fluoview sürüm 5.0 yazılımı ile zoom iki kez konfokal mikroskop tarama bir Olympus Fluoview 500 lazer kullanarak görüntü floresan sinyalleri. </li&gt; <li> Sırasıyla 543-nm HeNe yeşil lazer ve 633-nm HeNe Kırmızı lazer, heyecanlandırmak için Alexa Fluor 488 ve Alexa Fluor 647 kullanın. Alexa Fluor 488 sinyal kırmızı bir LUT tarafından masa yeşil bir görünüm (LUT) ve Alexa Fluor 647 ile temsil edilir. </li><li> Sinyalleri geliştirmek için 400 mikron her dedektör için konfokal diyafram ayarlayın. Sıralı tarama sinyal ayırma üst düzeye çıkarmak için 1.024 x 1.024 çözünürlükte alınmalıdır. </li><li> Kalman ortalama (iki kare) ile 1.2 mikron z adım aralıklarla (Fluoview yazılımı tarafından hesaplanan en uygun tarama ünitesi dayalı) kullanarak üç boyutlu z serisi yakalamak. </li></ol> Bölüm C: Üç boyutlu Görselleştirme ve Animasyon 11. Üç boyutlu (3D) Görselleştirme ve Animasyon <ol><li> Imaris x64 yazılım açık Fluoview dosyaları (sürüm 7.3, Bitplane AG) 3D görüntü setleri görselleştirmek için. </li><li> Ayarlayın gibi sinir belirli bir sinyal kontrast arttırmak için gerekli görüntüler. </li><li> Bir su oluşturmakdermal-epidermal sınır görselleştirmek için RFaCe. Sınır çizmek için beraberlik modunda Kontur aracını kullanın. </li><li> Temel floresan sinyalleri görmek için sınır bir yarı saydam yüzey atayın. </li><li> 3D film Anlık görüntüler oluşturmak için 3D floresan sinyallerin fotoğraf yakalayın. </li><li> Bir 3D film oluşturmak için animasyon özelliğini kullanın. Görüntüler (Şekil 2, 3, ve 4) ayrı ayrı ve birleştirilmiş her sinyal göstermek için 360 derece birkaç kez döndürülebilir. Saniyede 15 kare animasyon 200 kare oluşan filmleri oluşturmak için animasyon ayarlayın. Bir ham AVI dosyası olarak her bir film kaydedin. </li><li> VirtualDub yazılımı (versiyon 1.9.4) ile son AVI film sıkıştırın. </li></ol>

<ol><li>Lauria, G., Holland, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+innervation%3A+changes+with+aging%2C+topographic+location%2C+and+in+sensory+neuropathy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Epidermal innervation: changes with aging, topographic location, and in sensory neuropathy.</a> J. Neurol. Sci. 164 (2), 172-178 (1999).</li>
<li>Sullivan, K. A., Hayes, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+diabetic+neuropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol.+Dis%22%5BJournal%5D)">Mouse models of diabetic neuropathy.</a> Neurobiol. Dis. 28 (3), 276-285 (2007).</li>
<li>McArthur, J. C., Stocks, E. A., Hauer, P., Cornblath, D. R., Griffin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+nerve+fiber+density%3A+normative+reference+range+and+diagnostic+efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Epidermal nerve fiber density: normative reference range and diagnostic efficiency.</a> Arch. Neurol. 55 (12), 1513-1520 (1998).</li>
<li>Griffin, J. W., McArthur, J. C., Polydefkis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+cutaneous+innervation+by+skin+biopsies%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Assessment of cutaneous innervation by skin biopsies.</a> Curr. Opin. Neurol. 14 (5), 655-659 (2001).</li>
<li>Cheng, H. T., Dauch, J. R., Hayes, J. M., Yanik, B. M., Feldman, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nerve+growth+factor%2Fp38+signaling+increases+intraepidermal+nerve+fiber+densities+in+painful+neuropathy+of+type+2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol.+Dis%22%5BJournal%5D)">Nerve growth factor/p38 signaling increases intraepidermal nerve fiber densities in painful neuropathy of type 2 diabetes.</a> Neurobiol. Dis. 45 (1), 280-287 (2012).</li>
<li>Lauria, G., Lombardi, R., Camozzi, F., Devigili, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+biopsy+for+the+diagnosis+of+peripheral+neuropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Histopathology%22%5BJournal%5D)">Skin biopsy for the diagnosis of peripheral neuropathy.</a> Histopathology. 54 (3), 273-285 (2009).</li>
<li>Vlckova-Moravcova, E., Bednarik, J., Dusek, L., Toyka, K. V., Sommer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+validity+of+epidermal+nerve+fiber+densities+in+painful+sensory+neuropathies%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+Nerve%22%5BJournal%5D)">Diagnostic validity of epidermal nerve fiber densities in painful sensory neuropathies.</a> Muscle Nerve. 37 (1), 50-60 (2008).</li>
<li>Casanova-Molla, J., Morales, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+fluorescence+quantitation+provides+a+new+approach+to+assess+cutaneous+innervation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Axonal fluorescence quantitation provides a new approach to assess cutaneous innervation.</a> J. Neurosci. Methods. 200 (2), 190-198 (2011).</li>
<li>Wang, L., Hilliges, M., Jernberg, T., Wiegleb-Edstrom, D., Johansson, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+gene+product+9.5-immunoreactive+nerve+fibres+and+cells+in+human+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Protein gene product 9.5-immunoreactive nerve fibres and cells in human skin.</a> Cell Tissue Res. 261 (1), 25-33 (1990).</li>
<li>Lauria, G., Morbin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+capsaicin+receptor+immunoreactivity+in+human+peripheral+nervous+system+and+in+painful+neuropathies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Peripher.+Nerv.+Syst%22%5BJournal%5D)">Expression of capsaicin receptor immunoreactivity in human peripheral nervous system and in painful neuropathies.</a> J. Peripher. Nerv. Syst. 11 (3), 262-271 (2006).</li>
<li>Penna, G., Fibbi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+benign+prostatic+hyperplasia+stromal+cells+as+inducers+and+targets+of+chronic+immuno-mediated+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Human benign prostatic hyperplasia stromal cells as inducers and targets of chronic immuno-mediated inflammation.</a> J. Immunol. 182 (7), 4056-4064 (2009).</li>
<li>Lentz, S. I., Edwards, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+DNA+%28mtDNA%29+Biogenesis%3A+Visualization+and+Duel+Incorporation+of+BrdU+and+EdU+Into+Newly+Synthesized+mtDNA+In+Vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial DNA (mtDNA) Biogenesis: Visualization and Duel Incorporation of BrdU and EdU Into Newly Synthesized mtDNA In Vitro.</a> J. Histochem. Cytochem. 58 (2), 207-218 (2010).</li>
<li>Polydefkis, M., Hauer, P., Griffin, J. W., McArthur, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+biopsy+as+a+tool+to+assess+distal+small+fiber+innervation+in+diabetic+neuropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Technol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Skin biopsy as a tool to assess distal small fiber innervation in diabetic neuropathy.</a> Diabetes Technol. Ther. 3 (1), 23-28 (2001).</li>
<li>Lauria, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+fibre+neuropathies%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Small fibre neuropathies.</a> Curr. Opin. Neurol. 18 (5), 591-597 (2005).</li>
<li>Sorensen, L., Molyneaux, L., Yue, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relationship+among+pain%2C+sensory+loss%2C+and+small+nerve+fibers+in+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Care%22%5BJournal%5D)">The relationship among pain, sensory loss, and small nerve fibers in diabetes.</a> Diabetes Care. 29 (4), 883-887 (2006).</li>
<li>Lauria, G., Morbin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+swellings+predict+the+degeneration+of+epidermal+nerve+fibers+in+painful+neuropathies%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Axonal swellings predict the degeneration of epidermal nerve fibers in painful neuropathies.</a> Neurology. 61 (5), 631-636 (2003).</li>
<li>Herrmann, D. N., McDermott, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+nerve+fiber+density%2C+axonal+swellings+and+QST+as+predictors+of+HIV+distal+sensory+neuropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+Nerve%22%5BJournal%5D)">Epidermal nerve fiber density, axonal swellings and QST as predictors of HIV distal sensory neuropathy.</a> Muscle Nerve. 29 (3), 420-427 (2004).</li>
<li>Navarro, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+27%3A+Neural+plasticity+after+nerve+injury+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+Rev.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Chapter 27: Neural plasticity after nerve injury and regeneration.</a> Int. Rev. Neurobiol. 87, 483-505 (2009).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etmek.

IENFD ölçümü yaygın periferik nöropatiler 13,14 derecesini belirlemek için kullanılmıştır. Şu anda, en sık kullanılan protokol sadece epidermisin bazal membran nüfuz sinir liflerinin yoğunluğu ölçer, bu dikkate aksonal dallanma ve / veya sinirlerin morfolojik değişiklikler almaz. Buna ek olarak, mevcut IENFD analiz PN 15 ağrı varlığı ile IENFD ilişkili olduğu gösterilmiştir olmamıştır. Daha önce nosiseptif IENFD artan sayıda db / db farelerinde ağrı davranışları, tip 2 ...

Şu anda, küçük lif nöropatiler 3, 6-8 teşhis etmek için kullanılabilir deri punch biyopsi, gelen intraepidermal sinir lifi yoğunluğu, (IENFD) ölçmek için hekimler için yaygın bir uygulamadır. Biyopsiler distal bacak (DL), lateral malleol üzerinde 10 cm, ve proksimal uyluk (PT), anterior iliyak 9 aşağıda 20 cm alınır. Tüm İESL protein gen ürünü 9.5 (PGP), bir pan nöronal belirteç 10-12 kullanılarak etiketlenir. Şu anda, standart kullanarak küçük lif nöropati teşhis etmek için uygulama aydınlık mikroskobu 6 ile PGP boyama tarafından belirlenir IENFD. Olduğu Ayrıca, çeşitli araştırma grupları PGP immünhistokimya 7-9 için immunofluorescent protokolleri kullandık. Küçük lif nöropati genellikle nöropatik ağrı ile ilişkilidir. Daha fazla ağrı işlem için gerekli İESL rolünü anlamak için, biz ağrı oluşturmak lifleri ile birlikte etiket toplam İESL için bir teknik geliştirdi. Nocicepözellikle Aö tive İESL ve C lifleri, PGP ile İESL bir arada-etiketleme ve nosiseptif işaretleyici, tropomiyozin-reseptör-kinaz A (Trk A) 5 üzerinden incelenebilir. Trk A nosisepsiyon gelişimi için gerekli olan bir sinir büyüme faktörü için yüksek afiniteli reseptördür. Trk A pozitif nosiseptif sinir lifleri peptiderjik lifleri olduğunu ifade P maddesi (SP) ve kalsitonin gen ilişkili peptid (CGRP). Daha önce, Lauria ve arkadaşları PN, 10 bir nosiseptif işaretleyici ile birlikte etiketleme PGP pozitif İESL incelemek için çift etiketleme tekniği uygulanır. Daha önceki çalışmada, Trk A pozitif İESL, ancak Trk A-negatif İESL, ağrılı diyabetik nöropati 5 bir hayvan modelinde upregulated olduğunu göstermiştir. Bu ortak etiketleme tekniği IENFD ve PN ile ilişkili morfolojik çalışma yeteneği toplam nosiseptif IENFD ölçümü karşılaştırmak için yeteneği sağlar. Nosiseptif İESL ve iştigal görselleştirmek için yeteneğinosiseptif IENFD toplam IENFD yeniden ölçümü PN ile ilişkili ağrının şiddeti içine objektif ağrı varlığı için kanıt, ve muhtemelen fikir verebilir. Bu teknik ayrıca, hayvan modelleri arasında cilde uygulanabilir. Daha önceki çalışmalarda ile karşılaştırıldığında, mevcut protokol 2D görüntü analizi oluşabilir hataları önlemek için fırsat yaratmak, 3D görüntü analizi için yöntemler anlatılmaktadır.

<table><tbody><tr><td>10X PBS</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP399-4</td><td>1X PBS</td></tr><tr><td>Image-IT FX Sinyal</td><td>İnvitrojeni</td><td>oluşturmak için I36933</td><td>Image-IT</td></tr><tr><td>Protein Gen Ürünü 9.5 (Poliklonal tavşan)</td><td>AbD Serotec</td><td>7863-0504</td><td>PGP</td></tr><tr><td>Tropomyosin İlgili-Kinaz A (Poliklonal keçi)</td><td>R& D Sistemleri</td><td>AF1056</td><td>Trk A</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 eşek & alfa ;-tavşan</td><td>Invitrogen</td><td>A21206</td><td>AF488 eşek & alfa ;-keçi</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 eşek & alfa ;-keçi</td><td>Invitrogen</td><td>A21447</td><td>AF647 eşek & alfa ;-keçi</td></tr><tr><td>Albümini, Sığır</td><td>Serumu Sigma-Aldrich</td><td>A7906-100</td><td>BSA</td></tr><tr><td>Triton X- 100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td>TX-100</td></tr> Serisi<tr><td>Kalibre edilmemiş Loop</td><td>LeLoop</td><td>MP 199025</td><td>aşılama Loop</td></tr><tr><td>96 kuyulu tahlil plakası</td><td>Corning Incorporated</td><td>3603</td><td>Kuyu plakası</td></tr><tr>DAPI <td>Invitrogen</td><td>P36931</td><td>DAPI</td>Mikroskop Kapak Camı 22x22 mm ile<td>Altın antifade reaktifini uzatın</td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>12-541-B</td><td>Lameller</td></tr><tr><td>Superfrost Plus Mikroskop Slaytları</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td>Mikroskop Slaytları</td></tr><tr><td>Olympus Fluoview Lazer Tarama Konfokal Mikroskop</td><td>Olympus</td><td>FV500</td><td>Konfokal Mikroskop</td></tr><tr><td>Optimum Kesme Sıcaklığı</td><td>Sakura</td><td>4583</td><td>EKİM</td></tr><tr><td>Leica kriyostat</td><td>Leica</td><td>CM1850</td><td>Kriyostat</td></tr></tbody></table>

İnsan cilt biyopsiler içinde nosiseptif İntraepidermal sinir elyaf üç boyutlu görüntüleme

Three-dimensional Imaging of Nociceptive Intraepidermal Nerve Fibers in Human Skin Biopsies

Bir deri punch biyopsi sık periferik polinöropati 1,2 tanısında intraepidermal sinir lifi yoğunluğu (IENFD) ölçmek için kullanılır. Şu anda, distal bacak (DL) ve uzunluk bağımlı polinöropatiler 3 değerlendirilmesi için proksimal uyluk (PT) 3 mm biyopsi toplamak için yaygın bir uygulamadır. Ancak, IENFs ve çok yönlü olması nedeniyle, iki boyutlu (2B) görüntüleme analizi yoluyla sinir yapıları üst üste incelemek zordur. Alternatif olarak, üç boyutlu (3D) görüntüleme Bu ikilem için daha iyi bir çözüm sağlayabilir. Mevcut raporda, ağrılı nöropati (PN) incelemek için 3D görüntüleme uygulamak için yöntemler mevcut. IENFs tespit etmek amacıyla, deri örneklerinde protein gen ürünü, 9.5 (PGP), bir pan nöronal belirteç immunofloresans analizi için işlenir. Şu anda, IENFD caydırmak kullanarak küçük lif nöropati teşhis etmek için standart bir uygulamadıraydınlık mikroskobu 4 kullanarak PGP immünohistokimyasal tarafından mayınlı. Mevcut çalışmada, PGP kullanılarak, toplam IENFD belirlemek için çift immunofloresans analizi uygulandı ve nosiseptif İESL, sinir büyüme faktörü 5 A (Trk A), yüksek afiniteli reseptör tropomiyozin-reseptör kinaz tanıyan antikorların kullanımı yoluyla. PGP ve Trk A antikorları ile birlikte boyama İESL avantajları açıkça PGP pozitif, nosiseptif lifler boyanarak PN çalışma yararlanır. Bu floresan sinyalleri PN ile ilişkili İESL nosiseptif IENFD ve morfolojik değişiklikleri belirlemek için ölçülebilir. Floresan görüntüler konfokal mikroskobu ile elde edilen ve 3D analiz için işlenir. 3D görüntüleme daha PN ile ilişkili morfolojik analiz dönme yetenekleri sağlar. Birlikte ele alındığında, floresan ortak boyama, konfokal görüntüleme ve 3D analiz açıkça PN çalışma yarar.

Biz PN hastalardan PT ve DL biyopsi İESL morfolojisini incelemek için geçerli protokol uygulanır. Cilt, üç konulardan, PN ile ilişkili pathomorphology göstermek için Utah Üniversitesi&#39;nde toplandı. Konular şunlardır: Durum 1: tip 2 diyabet (: 14 ay; ağrı skoru: süresi 51); PN öyküsü olan 51 yaşındaki erkek Durum 2: PN öyküsü olan 56 yaşındaki erkek ve Durum 3: Tip 2 diyabet (: 42 ay; ağrı skoru: süresi 46) PN bir geçmişi olan 66 yaşındaki erkek; tip 2 diyabet (:; 47 ağrı skoru 108 ay süreli) bir. Kantitatif duyusal ...

Ağrılı nöropatiler (PN) olarak nosiseptif intraepidermal sinir lifleri (IENFs) değişiklikleri incelemek için, doğrudan nosiseptif IENFs gözlenen üç boyutlu morfolojik değişiklikleri incelemek olabilir protokolleri geliştirmiştir. IENFs üç boyutlu analiz PN İESL morfolojik değişiklikleri değerlendirmek için bir potansiyele sahiptir.

İnsan Cilt Biyopsiler içinde Nosiseptif İntraepidermal Sinir Elyaf üç boyutlu görüntüleme

A punch biopsy of the skin is commonly used to quantify intraepidermal nerve fiber densities (IENFD) for the diagnosis of peripheral polyneuropathy 1,2. ...

Bu prosedürün genel amacı, ağrılı nöropati ile ilişkili intraepidermal sinir liflerinin morfolojik değişikliklerini üç boyutlu görüntüleme aracılığıyla incelemek için insan deri biyopsi kesitlerinde immünohistokimya gerçekleştirmektir. Bu işlem, öncelikle münferit insan deri biyopsi kesitleri üzerinde üç günlük yüzer kesit immünohistokimya protokolünün uygulanmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım ise, 50 mikron kalınlığındaki deri kesitlerinin konfokal mikroskop kullanılarak görüntülenmesidir.Ardından, orijinal immunofloresan görüntülerinden üç boyutlu bir film dosyası oluşturmak için akış görünümü görüntü dosyaları MRS yazılımı ile çalıştırılır. Son adım, film dosyasını sıkıştırmak için vdw yazılımı veya benzeri bir yazılım kullanmaktır. Nihayetinde, üç boyutlu görüntüleme sonuçları, ağrılı nöropati ile ilişkili morfolojik değişikliklerin incelenmesine olanak tanır.Günümüzde, intraoperatif epidermal sinir lifi yoğunluğu, nöropatiyi teşhis etmek için nicel bir yöntem olarak kullanılmaktadır. Bu intradermal sinir liflerinin nosiseptif biyobelirteç ile birlikte etiketlenmesi, bu komplikasyonla ilişkili ağrıya ışık tutma potansiyeline sahiptir. Mevcut iki boyutlu görüntüleme protokolü

three-dimensional-imaging-nociceptive-intraepidermal-nerve-fibers

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

In vivo ağrı ve inflamasyon aracılık biyokimyasalın ölçümü için ilgili doku siteleri (deneysel iltihaplı cilt) interstisyel sıvı örneklerinin toplanması için bir teknik sunulmuştur.

Nosiseptif ve İnflamatuar Arabulucular Doku Özel Ölçüm İnsan In-Vivo Biyoassay

Algoritmalar insan deneklerin deneysel iltihaplı deride ısı ve mekanik ağrı eşikleri değerlendirilmesi gösterilmiştir. Iki ağrı test paradigmalar, acı verici, iki büyük periferik sinir lifi popülasyonları bağımsız nosiseptif işleme incelemek, yani miyelinli olmayan C lifleri ve küçük A-delta lifleri miyelinli.

İnsan denekler üzerinde iltihaplı cilt ısı ve mekanik ağrı eşiğini Belirlenmesi

Periferik duyusal sinir lifi alt tiplerinin İmmünositokimyasal kimlik (ve orada protein ekspresyonu tespit), periferik hissi altında yatan moleküler mekanizmaları anlamak için kilit öneme sahiptir. Burada periferik duyusal sinir lifleri belirli immün için, deri ve bacak kemikleri gibi periferik / visseral doku örnekleri, hazırlama yöntemleri açıklanmaktadır.

Deri ve Kol ve bacak kemikleri innerve Fare Duyusal Sinir Lif doku hazırlanması ve immün

Bu video, sıçanlarda C-fiber sinir iletiminin tek lifli bir kaydını göstermektedir. Anestezi uygulanmış bir sıçan, alt ekstremitelere duyusal ve motor besleme sağlayan siyatik siniri açığa çıkarmak için kesilir. Tek tek C-lifleri daha sonra açığa çıkar. Ayağa yerleştirilen uyarı elektrotları kullanılarak elektriksel stimülasyon sağlanır ve tek bir sinir lifinden yanıt kaydedilir.

Sıçanlarda siyatik sinir C-liflerinin in vivo tek lif kaydı

Kaynak: Hamid, H. S.,  et al. İnsan İntraepidermal Sinir Liflerinde Mitokondrinin Üç Boyutlu Görüntülenmesi ve Analizi. J. Vis. Uzm. (2017) Bu video, üç boyutlu görüntüleme kullanarak sinire özgü mitokondriyi görselleştirme yöntemini göstermektedir. Önceden etiketlenmiş intraepidermal sinir liflerinin sıralı taramalarını elde etme ve sinir yapılarıyla ilişkili olarak mitokondriyi izole etmek ve görüntülemek için 3D yüzey görüntüleri oluşturma sürecini ana hatlarıyla belirtir.

İntraepidermal Sinir Lifleri İçinde Mitokondrinin Görselleştirilmesi

Dinamik boyuna görüntüleme ve muhabiri transgenik farelerin sinir uçlarının selektif lazer lezyon için protokol sunulmuştur.

Cilt Tek Sinir Endings Vivo İki-Foton Mikrokopisi

Bu tür saç folikülleri ve sinir uçları gibi - - mekansal organizasyon farklı desen sergileyen Memeli cilt yapıları çeşitli bir dizi içerir. Düz bir montaj olarak cilt analiz deri yapıları tam kalınlığı yüksek çözünürlüklü görüntüler üretmek için bu doku 2-boyutlu geometri yararlanır.

Fare Cilt ve Saç Folikül Desenlendirme ve Duyusal Akson Morfoloji Analizi Uygulanması Düz ​​Görüntüleme Dağı

Bu iletişim kuralı görselleştirmek ve sinir özgü mitokondri ölçmek için üç boyutlu (3D) görüntüleme ve çözümleme teknikleri kullanır. Teknikleri bir floresan sinyal başka bir floresan sinyalinden gelen verilerin bir alt kümesini yalıtmak için kullanıldığı diğer durumlar için geçerlidir.

Üç boyutlu görüntüleme ve mitokondri içinde insan Intraepidermal sinir lifleri analizi

Tek lifli kayıt, merkezi ve periferik sinir sistemleri için geçerli olan etkili bir elektrofizyolojik tekniktir. Bağlı siyatik sinir ile bozulmamış DRG hazırlanması ile birlikte, iletim yetmezliği mekanizması incelenir. Her iki protokol de periferik sinir sisteminin ağrı ile ilişkisini geliştirmek.

İletim Yetmezliği Mekanizmasını İncelemek Için Bağlı Siyatik Sinir ile In Vivo Tek Lifli Kayıt ve Bozulmamış Dorsal Kök Ganglion Kullanımı

Doku kesitlerinin kalınlığı deri innervasyonunun morfolojik çalışmasını sınırladı. Mevcut protokol, konfokal mikroskopi altında kalın 300 μm doku kesitlerinde kutanöz sinir liflerini görselleştirmek için benzersiz bir doku temizleme tekniğini tanımlamaktadır.

Çoklu Floresan Boyama ve Doku Temizleme Yaklaşımları Kullanarak Tüylü ve Glabrous Cilt İnnervasyonunu 3D Desende Göstermek

Bu çalışma, farelerin ön pençe derisindeki düşük eşikli mekanoreseptör (LTMR) akson terminallerinin görselleştirilmesi için in vivo iki fotonlu görüntüleme yaklaşımını sunmaktadır. Bireysel aksonların tekrarlanan, yüksek çözünürlüklü görüntülemesi kullanılarak, bu yöntem gelişim sırasında ve yetişkinlerde deri duyusal devresinin yapısı ve işlevini incelemek için yeni bir platform sağlar.

Fare Derisindeki Dokunma Duyusal Akson Morfolojisinin İntravital İki Fotonlu Görüntülemesi

Öğrenin, insan cilt biyopsilerinde immünohistokimya ve konfokal mikroskopi kullanarak ağrılı nöropatilerde intraepidermal sinir liflerinin morfolojik değişikliklerini üç boyutlu görüntüleme yöntemiyle incelemeyi.

İnsan Cilt Biyopsiler içinde Nosiseptif İntraepidermal Sinir Elyaf üç boyutlu görüntüleme

Daha fazla video keşfet