Name: Bir In vitro Model (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: Öğrenin, yoğunluk gradyanı santrifüjasyonu ve negatif boncuk izolasyonu ile insan periferik kanından monositleri izole edip makrofajlara farklılaştırma yöntemini. Bu model, polarizasyon belirteçlerinin qPCR ile analizi için kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz mükemmel teknik yardım için Nadine Wambsganss teşekkür ederim. Bu çalışma CAG İnovasyon Fonu FRONTIER (Heidelberg Üniversitesi) bir hibe ile Deutsche Forschungsgemeinschaft (GL599/1-1) bir hibe ile ve kısmen desteklenmiştir

1. Protokol <ol><li> Aşağıdaki gibi tamponlar hazırlamak: <ol><li> Hücre izolasyonu için tampon hazırlayın: &quot;tampon yıkayın&quot; PBS içinde =% 0.02 EDTA (kullanımı 0.5 M EDTA). </li><li> Monosit izolasyonu için tamponu hazırlayın: &quot;durulama MACS tamponu&quot; =% 0.5 BSA (250 mg) + 2 mM EDTA (200 ul) + PBS (50 mL) eklenmiştir. Degas tampon. </li><li> &quot;FACS tampon&quot; PBS =% 10 FCS ve &quot;sabitleme tampon&quot; PBS =% 1 PFA: hücrelerin FACS boyaması ve depolama tamponu hazırlayın. </li></ol></li><li> Bir kol damardan 30 ml tam kan çizin. Antikoagulan olarak EDTA kullanın. </li><li> Aşağıdaki gibi hücre (Histopaque) izole: <ol><li> Iki steril 50 ml tüpler (no poli-stiren) hazırlayın. </li><li> PBS 1.1 ile birlikte, adım 2 kan sulandırmak. </li><li> + 25 ml tam kan / PBS tüp başına 25 ml histopaque ekleyin. Histopaque ve kan karışmaz emin olun. </li><li> RT, hiçbir fren az 30 dakika 400 x g&#39;de santrifüj. </li><li> Plazma ve atın aspire. </li><li> Temiz 50 ml küvetin içine opak arayüzü ve pipet aspiree. </li><li> PBS içinde% 0,02 EDTA, 20 ml ilave edilir. </li><li> 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 250 x g&#39;de santrifüj </li><li> Süpernatant atın. </li><li> PBS içinde% 0,02 EDTA, 10 ml ilave edilir. </li></ol></li><li> Şöyle hücreleri hesaplama: <ol><li> 10 sn için vorteks ile iyice karıştırın. </li><li> 200 ul hücre süspansiyonu + 300 ul PBS içinde% 0.02 EDTA + Tripan mavisi (200-500 cells/10 kareler, aksi seyreltme faktörü değiştirmek) 500 ul alın. </li></ol></li><li> Aşağıdaki gibi monosit olumsuz izolasyonu gerçekleştirin: <ol><li> 10 dakika, 120 x g için adım 3.10 &#39;da elde edilen hücreler santrifüj. Süpernatant atın. </li><li> 10 ml PBS +% 0.02 EDTA ve 10 dakika 120 x g&#39;de santrifüj eklenerek hücre pelletini 2x yıkayın. </li><li> 1 ml 10X PBS ekleyin, 3 saniye boyunca 9 ml steril su ekleyin. </li><li> PBS +% 0.02 EDTA ile bir kez daha yıkanır ve 10 dakika 120 x g&#39;de santrifüj edilir. </li><li> Santrifüj sırasında sayın. </li><li> 5 x 10 7 / ml &#39;de EasySep tamponu içinde seyreltilir. </li><li> 50 ml / ul monosit zenginleştirme horoz eklekuyruk. </li><li> 10 dakika 4 ° C&#39;de inkübe edin </li><li> 30 saniye vorteks boncuk. </li><li> 50 ul / ml &#39;boncuk ekleyin. </li><li> 5 dakika 4 ° C&#39;de inkübe edin </li><li> 2.5 ml&#39;lik bir hacme tamamlamak için EasySep tamponu ile doldurun. Çözüm şimdi kahverengimsi görünür. </li><li> Cazibe merkezi haline koymak. </li><li> Oda sıcaklığında 2.5 dakika bekleyin. Bu süre boyunca, manyetik boncuk bağlı olmayan monositik hücreler tüp duvarı taşımak ve orada yapışır. </li><li> Taze steril tüpe bağlayıcı olmayan monositler ile tampon dökün. Bu çözüm beyazımsı görünüyor. </li><li> PBS +% 0.02 EDTA ile bir kez yıkayın ve 10 dakika, 120 x g santrifüj. </li></ol></li><li> 0.5 x 10 6 / cm 2 lik bir yoğunlukta bir plastik çanak ya da çok katlı plaka plaka hücreleri. Kültür ortamı / 1 x 10 6 hücre 1 ml ilave edilir. </li><li> 6-14 gün için ilgi çekici koşullar altında kültürü hücreleri. </li><li> Taze medya (Ayrıntılar için bakınız Tablo 1) ile medyanın% 50 yerine 3 gün sonra medya değiştirin. </li><li>MRNA izolasyon, akım sitometri, Batı blot, vb için altı gün hasat hücreleri sonra. </li></ol>

<ol><li>Gordon, S., Taylor, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocyte+and+macrophage+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Monocyte and macrophage heterogeneity.</a> Nat. Rev. Immunol. 5, 953-964 (2005).</li>
<li>Gordon, S., Mantovani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+and+plasticity+of+mononuclear+phagocytes%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Diversity and plasticity of mononuclear phagocytes.</a> European Journal of Immunology. 41, 2470-2472 (2011).</li>
<li>Martinez, F. O., Sica, A., Mantovani, A., Locati, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+activation+and+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Biosci%22%5BJournal%5D)">Macrophage activation and polarization.</a> Front. Biosci. 13, 453-461 (2008).</li>
<li>Ingersoll, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+gene+expression+profiles+between+human+and+mouse+monocyte+subsets%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Comparison of gene expression profiles between human and mouse monocyte subsets.</a> Blood. 115, 10-19 (2010).</li>
<li>Gleissner, C. A., Sanders, J. M., Nadler, J., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Upregulation+of+aldose+reductase+during+foam+cell+formation+as+possible+link+among+diabetes%2C+hyperlipidemia%2C+and+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler.+Thromb.+Vasc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Upregulation of aldose reductase during foam cell formation as possible link among diabetes, hyperlipidemia, and atherosclerosis.</a> Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 28, 1137-1143 (2008).</li>
<li>Gleissner, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CXCL4+downregulates+the+atheroprotective+hemoglobin+receptor+CD163+in+human+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">CXCL4 downregulates the atheroprotective hemoglobin receptor CD163 in human macrophages.</a> Circ. Res. , (2009).</li>
<li>Gleissner, C. A., Shaked, I., Little, K. M., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CXC+chemokine+ligand+4+induces+a+unique+transcriptome+in+monocyte-derived+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">CXC chemokine ligand 4 induces a unique transcriptome in monocyte-derived macrophages.</a> J. Immunol. 184, 4810-4818 (2010).</li>
<li>Martinez, F. O., Gordon, S., Locati, M., Mantovani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+profiling+of+the+human+monocyte-to-macrophage+differentiation+and+polarization%3A+New+molecules+and+patterns+of+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Transcriptional profiling of the human monocyte-to-macrophage differentiation and polarization: New molecules and patterns of gene expression.</a> J. Immunol. 177, 7303-7311 (2006).</li>
<li>Verreck, F. A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+il-23-producing+type+1+macrophages+promote+but+il-10-producing+type+2+macrophages+subvert+immunity+to+%28myco%29bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Human il-23-producing type 1 macrophages promote but il-10-producing type 2 macrophages subvert immunity to (myco)bacteria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 4560-4565 (2004).</li>
<li>Rey-Giraud, F., Hafner, M., Ries, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+generation+of+monocyte-derived+macrophages+under+serum-free+conditions+improves+their+tumor+promoting+functions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">In vitro generation of monocyte-derived macrophages under serum-free conditions improves their tumor promoting functions.</a> PLoS One. 7, e42656(2012).</li>
<li>Boyle, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coronary+intraplaque+hemorrhage+evokes+a+novel+atheroprotective+macrophage+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Coronary intraplaque hemorrhage evokes a novel atheroprotective macrophage phenotype.</a> American Journal of Pathology. 174, 1097-1108 (2009).</li>
<li>Cho, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+dendritic+cell-like+phenotype+in+macrophages+during+foam+cell+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Genomics%22%5BJournal%5D)">Induction of dendritic cell-like phenotype in macrophages during foam cell formation.</a> Physiol Genomics. 29, 149-160 (2007).</li>
<li>Vogt, G., Nathan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+differentiation+of+human+macrophages+with+enhanced+antimycobacterial+activity%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">In vitro differentiation of human macrophages with enhanced antimycobacterial activity.</a> The Journal of Clinical Investigation. 121, 3889-3901 (2011).</li>
<li>Mikita, T., Porter, G., Lawn, R. M., Shiffman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidized+low+density+lipoprotein+exposure+alters+the+transcriptional+response+of+macrophages+to+inflammatory+stimulus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Oxidized low density lipoprotein exposure alters the transcriptional response of macrophages to inflammatory stimulus.</a> Journal of Biological Chemistry. 276, 45729-45739 (2001).</li>
<li>Qin, Z. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+THP-1+cells+as+a+model+for+mimicking+the+function+and+regulation+of+monocytes+and+macrophages+in+the+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Atherosclerosis%22%5BJournal%5D)">The use of THP-1 cells as a model for mimicking the function and regulation of monocytes and macrophages in the vasculature.</a> Atherosclerosis. 221, 2-11 (2012).</li>
<li>Daigneault, M., Preston, J. A., Marriott, H. M., Whyte, M. K. B., Dockrell, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+identification+of+markers+of+macrophage+differentiation+in+pma-stimulated+THP-1+cells+and+monocyte-derived+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The identification of markers of macrophage differentiation in pma-stimulated THP-1 cells and monocyte-derived macrophages.</a> PLoS One. 5, e8668(2010).</li>
<li>Wahl, L. M., Wahl, S. M., Smythies, L. E., Smith, P. D. Isolation of human monocyte populations. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWahl%2C+LM+%22Current+Protocols+in+Immunology%22">Current Protocols in Immunology</a>. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).</li>
<li>Waldo, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+of+human+macrophages+in+culture+and+in+atherosclerotic+plaques%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity of human macrophages in culture and in atherosclerotic plaques.</a> Am. J. Pathol. 172, 1112-1126 (2008).</li>
<li>Martín-Fuentes, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Individual+variation+of+scavenger+receptor+expression+in+human+macrophages+with+oxidized+low-density+lipoprotein+is+associated+with+a+differential+inflammatory+response%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Individual variation of scavenger receptor expression in human macrophages with oxidized low-density lipoprotein is associated with a differential inflammatory response.</a> The Journal of Immunology. 179, 3242-3248 (2007).</li>
</ol>

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması ifşa etmek zorunda değilsiniz.

Monosit türevli histiositlerinden doğuştan gelen bağışıklık sisteminin temel hücre tipini temsil etmektedir. Ateroskleroz veya kanser 2 de dahil olmak üzere, pek çok enflamasyonlu hastalıkların önemli bir rol oynamaktadır. Böylece, makrofaj biyoloji okuyan birçok hastalığın patofizyolojisi üzerinde bilgilerimizi artırmak için gerekli olan ve yeni tedavilerin geliştirilmesi izin vermek. Birçok çalışma, fare modelleri eksprese uygulamak veya ilgi bazı genlerin eksik. Monosit türevli...

Monosit türevli histiositlerinden doğuştan gelen bağışıklık sisteminin önemli bir hücresel bileşeni temsil etmektedir ve birçok akut veya kronik enflamatuar süreçleri 1 katkıda bulunur. Makrofajlar, ateroskleroz ya da kanser 2 gibi birçok enflamatuar hastalıklarda önemli bir rol oynamaktadır. Makrofajlar plastisite yüksek derecede göstermek ve yerel micromilieu 3 bağlı olarak farklı fenotipleri kabul edebiliyoruz. Böylece, makrofaj farklılaşma ve heterojen okuyan birçok hastalığın patofizyolojisi bilgimizi artırmak için gerekli olan ve yeni tedavi hedefleri ve yeni tedavilerin geliştirilmesi tespitine imkan vermek. Birçok durumda, kemirgen modelleri belirli hastalıkların patofizyolojisi araştırmak için kullanılır. Ancak, fare modelleri ile makrofaj biyoloji okuyan birçok eksiklikleri eşlik ediyor: (1) perip lökosit alt numaraları oranı (yani monosit ve granülosit)fare veya insanların Heral kan önemli ölçüde fare ve insan patofizyolojisinde monositlerin farklı roller düşündüren değişir. (2) sağlık ve hastalık 4 sırasında fonksiyonu önemli farklılıklar öne fare ve insan periferik kan monositler arasında gen önemli farklılıklar vardır. (3) insan duruma fare modellerinde bulguların transferi oldukça zor hale insan miyeloid hücrelerde yok fare monositler ve makrofajlar (F4/80, LYC, vb.) Tanımlamak için kullanılır işaretleri bir dizi. Bu nedenle, insan hastalıklarında makrofaj farklılaşması ve heterojen anlaşılması artırmak amacıyla, insan makrofaj çalışma modelleri kullanmak gerekir. Dolayısıyla, burada kullanımı kolay ve farklı makrofaj po ile sonuçlanan, çeşitli koşullar altında in vitro olarak insana ait monositlerden türetilmiş makrofaj çalışma sağlar insan birincil makrofaj nesil bir modeli tanımlamaklarization türleri. Çeşitli çalışmalarda, böylece makrofaj biyoloji ve 5-7 insan ateroskleroz için potansiyel alaka analiz etmek için monosit türevli primer insan makrofajlarda in vitro modeli kullandık. Olsa da tamamen ölüm sonrası elde edilen hayvan veya insan dokularıyla çapraz olmayan değiştirme deneyleri, burada açıklanan model hastalık mekanizmalarını ve çeşitli insan hastalıkları için son derece uygun olabilir terapötik hedeflerin tanımlanması ve doğrulamasını sağlar.

<table><tbody><tr><td>50 ml santrifüj tüpü (steril)</td><td>Fisher</td><td>055398</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS (1X), sıvı (kalsiyum veya magnezyum içermez)</td><td>Invitrogen</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>T9285</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A-8806</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EasySep İnsan Monosit Zenginleştirme Kiti</td><td>Kök Hücre Teknolojileri</td><td>19059</td><td></td></tr><tr><td>EasySep Mıknatıslı</td><td>Kök Hücre Teknolojileri</td><td>18000</td><td></td></tr><tr><td>FACS tüpleri</td><td>Fisher</td><td>352008</td><td></td></tr><tr><td>Makrofaj-SFM (1X)</td><td>İnvitrojen</td><td>12065-074</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin-streptomisin</td><td>Sigma</td><td>P-4458</td><td></td></tr><tr><td>Nutridoma-SP</td><td>Roche</td><td>11011375001</td><td></td></tr><tr><td>insan M-CSF 10 & mu; g</td><td>Peprotech</td><td>300-25</td><td></td></tr><tr><td>Hücre Kültürü Plakaları 6 kuyulu</td><td>Fisher</td><td>07-200-80</td><td></td></tr></tbody></table>

bir<em&gt; in vitro</emİnsan makrofaj farklılaşma ve polarizasyon heterojenliği eğitim için&gt; model

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Monosit türevli histiositlerinden doğuştan gelen bağışıklık sisteminin önemli bir hücre tipi temsil etmektedir. Makrofaj biyoloji okuyan fare modellerinde sıçangil ve insan monosit türevli histiositlerinden arasındaki fenotipik ve fonksiyonel farklılıklar muzdarip. Bu nedenle, burada primer insan makrofaj oluşturmak ve okumak için bir in vitro model tarif eder. Kısaca, bir kol damarından çekilerek periferik kan yoğunluk gradyan santrifüj işleminden sonra, monositler negatif manyetik boncuk ayırma kullanılarak periferik kan mononükleer hücreler izole edilmiştir. Bu monositler sonra makrofaj değişimi ya da polarizasyon farklı indüklemek için özel koşullar altında altı gün boyunca kültüre edilmiştir. Model kullanımı kolaydır ve fare ve insan arasında türe özgü farklılıklardan kaynaklanan sorunlar circumvents. Ayrıca, ölümsüzleştirilmiş hücre çizgilerinin kullanımı daha in vivo koşullarda daha yakındır. Sonuç olarak, burada açıklanan model macrophag incelemek için uygun bire biyoloji, hastalık mekanizmaları ve yeni tedavi hedefleri belirlemek. Olsa da tamamen ölüm sonrası elde edilen hayvan veya insan dokularıyla çapraz olmayan değiştirme deneyleri, burada açıklanan model hastalık mekanizmalarını ve çeşitli insan hastalıkları için son derece uygun olabilir terapötik hedeflerin tanımlanması ve doğrulamasını sağlar.

Yukarıda açıklanan protokolü kullanarak, rutin 25.1 x 10 6 ± 2.2 x 10 6 monocytes/100 ml kan (26 bağımsız deneylerden ortalama ± standart hata, Şekil 1A) edinin. CD14 için akış sitometrisi ile boyama ile saptandığı gibi monosit saflık rutin olarak% 95&#39;ten daha fazla (97.1 ± 0.4%, 3 bağımsız deney, Şekil 1B ortalama ± standart hata) &#39;dir. Tripan mavi boyama ile saptandığı haliyle taze izole edilmiş monositlerin, hücre canlılığını% 95 (veriler gösterilmemişti...

Monosit türevli histiositlerinden doğuştan gelen bağışıklık sisteminin önemli bir hücrelerdir. Burada, kullanımı kolay tarif<em&gt; In vitro</emBu hücreler üretmek için&gt; modeli. Gradyan santrifüj, negatif boncuk izolasyon ve belirli bir hücre kültürü koşulları kullanılarak, monosit türevli histiositlerinden fenotipik ve fonksiyonel çalışmalar için oluşturulabilir.

Bir<em&gt; In vitro</emİnsan Makrofaj Farklılaşma ve Polarizasyon heterojenliği Eğitim için&gt; Model

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the ...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, monositleri insan periferik kanından izole etmek ve bunları farklı makrofaj polarizasyon tiplerine doğru ayırt etmektir. Bu, ilk olarak insan periferik kan mononükleer hücrelerinin yoğunluk gradyanlı santrifüjleme ile izole edilmesiyle elde edilir. İkinci adım olarak, saf CD 14 pozitif monositler elde etmek için negatif boncuk izolasyonu yapılır.Daha sonraki monositler, spesifik olarak polarize makrofajları indüklemek için belirli koşullar altında kültürlenir. Sonuç olarak, makrofaj polarizasyon belirteçlerinin kültür koşullarına yanıt olarak diferansiyel ekspresyonu, kantitatif PCR ile belirlenebilir. Bu yöntem, makrofajların farklı polarizasyon tiplerine doğru farklılaşmasını incelemeye yardımcı olabilir.Ateroskleroz gibi iltihaplı hastalıklarda son derece önemli olan bir özellik. Bir gönüllüden önkol damarından 30 mililitre tam kan aldıktan sonra, kanı iki polistiren olmayan 50 mililitrelik konik tüpe eşit olarak bölün. Daha sonra her tüpteki kanı 10 mililitre PBS ile seyreltin.Daha sonra, her tüpteki 25 mililitre tam kan ve PBS'ye 25 mililitre histo paketi ekleyin, histo paketi ile kanın karışmamasına dikkat edin. Daha sonra tüpleri 30 dakika boyunca 400 Gs'de ve oda sıcaklığında ara vermeden santrifüjleyin. Döndürme işleminden sonra önce plazma katmanını aspire edin ve ardından opak arayüz katmanını 50 mililitrelik yeni bir tüpe aktarın.Hücreleri arayüzden 20 mililitre PBS artı CDTA'da 250 Gs ve dört santigrat derecede beş dakika boyunca yıkayın. Daha sonra süpernatan resüsü attıktan sonra, peleti 10 mililitre PBS artı CDTA içinde askıya alın ve hücreleri 10 saniye boyunca girdaplayarak iyice karıştırın. Şimdi 200 mikrolitre hücre süspansiyonunu 300 mikrolitre PBS artı EDTA ve 500 mikrolitre triam mavisi ile seyreltin.10 kare ve bir hemo sitometre başına yaklaşık 200 ila 500 hücre elde etmek için, hücreleri 120 Gs'de 10 dakika boyunca üç kez döndürerek negatif izolasyona başlayın İkinci yıkamadan sonra, peleti dokuz mililitre steril suda üç saniye boyunca askıya alıyoruz. Daha sonra, hücreleri bir kez daha yıkadıktan ve saydıktan sonra bir mililitre 10 XPBS ekleyin, mililitre başına yedi hücrenin 10'unun beş katı kadar kolay ayarlanmış tamponda seyreltin. Şimdi hücreleri, mililitre monosit zenginleştirme kokteyli başına 50 mikrolitre içinde dört santigrat derecede 10 dakika inkübe edin.İnkübasyonun son dakikasında, cept monosit zenginleştirme boncuklarını 30 saniye boyunca girdaplar. Daha sonra boncukların mililitresine 50 mikrolitre hücrelere ekleyin ve boncuğu hücre süspansiyonunda beş dakika daha inkübe edin. İkinci inkübasyondan sonra, hücre çözeltisi hacmini 2,5 mililitreye getirin.Daha fazla eep tamponu ile çözelti şimdi kahverengimsi bir renkte görünecektir. Ardından, tüpü oda sıcaklığında iki buçuk dakika boyunca bir eep mıknatısına yerleştirin. Boncuk bağlı hücreler yapışma şansı bulduktan sonra, bağlayıcı olmayan monositleri içeren tamponu taze bir steril tüpe dökün.Bağlanmamış hücreleri PBS artı EDTA ile bir kez yıkadıktan sonra çözelti şimdi beyazımsı bir renk görünecek, hücreleri çok kuyucuklu bir plakaya aktaracak, daha sonra kültür plakasına altı hücreye bir kez 10 kere bir mililitre kültür ortamı ekleyecektir. Son olarak, makrofaj farklılaşmasını indüklemek için hücreleri altı gün boyunca deneysel koşullar altında kültürleyin. Üç gün sonra ortamın yarısını altı gün sonra yeni ortamla değiştirin.İstenen deneysel analiz için hücreleri hasat edin. Yukarıda tarif edilen protokolü kullanarak, yaklaşık 25 kez, altı monositin 10'u rutin olarak 100 mililitre kandan elde edilir; CD 14 için akış sitometrik boyama ile belirlenen monosit saflığı, kültüre ilk eklendiğinde rutin olarak% 95'ten daha büyüktür. Monositler başlangıçta yuvarlak şekillidir ve birkaç saat içinde yüzer.Bununla birlikte, altı gün sonra onlara kızarmış yumurta veya iğ benzeri bir görünüm vererek yapışırlar. Tek başına MCSF ile kültürde veya son 24 saat boyunca oksitlenmiş LDL ilavesiyle veya oksitlenmiş LDL'ye maruz kalmayan hücrelerin kabaca %80'i propidyum iyodür ile belirlendiği gibi canlıdır. Öte yandan, oksitlenmiş LDL ile boyama tedavisi, altı günlük kültürden sonra yaklaşık% 70 hücre canlılığı ile sonuçlanır.MCSF akışı ile SİTOMETRİK analiz, hücrelerin lökosit markörü CD 45 ro'yu eksprese etmeye devam ederken, monosit markörü CD 14'ü aşağı regüle ettiklerini göstermektedir. Hücre kültürü sırasında makrofaj polarizasyonunu indükleyebilecek spesifik koşullara bağlı olarak, başarılı polarizasyonu garanti etmek için ek belirteçler gereklidir. Spesifik koşullar makrofaj polarizasyonuna neden olabilir.Örneğin, M1 polarize makrofajlar IL altı ve TNF alfa gibi tipik belirteçleri eksprese ederken, M iki polarize makrofaj CD 36 ve CD 2 0 6'yı eksprese ederken, makrofajlar fonksiyonel deneylerde daha fazla incelenebilir. Örneğin, oksitlenmiş LDL'nin alımı, floresan etiketli LDL kullanılarak incelenebilir. Bu deneyde, hücreler dört saat boyunca mililitre başına 10 mikrogram DII etiketli oksitlenmiş LDL'ye maruz bırakıldı ve çekirdekler dpi ile boyandı.Histogram, MCSF'nin neden olduğu makrofajlar tarafından DII oksitlenmiş LDL alımının akış sitometrik ölçümünü, tedavi edilmemiş kontrol hücrelerini temsil eden katı gri histogram ve siyah açık histogram ile gösterir. Oksitlenmiş LDL ile muamele edilmiş makrofajları temsil eder Gelişiminden sonra. Bu teknik, araştırmacıların insan makrofajlarının farklılaşmasını ve heterojenliğini incelemelerini sağlar.Böylece, yeni hastalık mekanizmalarını ve yeni terapötik hedefleri belirlemek için ateroskleroz gibi enflamatuar hastalıkları incelemelerine olanak tanır.

an-vitro-model-to-study-heterogeneity-human-macrophage

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bu video, birincil monositlerin makrofajlara hazırlanmasını göstermektedir. Birincil insan monositleri, granülosit-makrofaj koloni uyarıcı faktör (GM-CSF) kullanılarak M1 benzeri bir pro-inflamatuar fenotipe veya makrofaj koloni uyarıcı faktör (M-CSF) kullanılarak M2 benzeri bir anti-inflamatuar fenotipe izole edilebilir ve farklılaştırılabilir.

İn Vitro Kültür ve Primer Monositlerin Makrofajlara Farklılaşması

Bu videoda, periferik kandan türetilmiş monositlerin M1 veya M2 makrofajlarına farklılaşmasını ve polarizasyonunu indüklemek için bir prosedür gösteriyoruz. Granülosit-makrofaj koloni uyarıcı faktör, lipopolisakkarit ve interferon-gama ile inkübasyon, pro-inflamatuar M1 makrofajları verirken, makrofaj koloni uyarıcı faktör ve interlökin-4 ile inkübasyon, anti-inflamatuar M2 makrofaj üretimini indükler.

Monosit Kaynaklı Hücrelerin Makrofaj Benzeri Hücrelere Farklılaşması ve Polarizasyonu

Bu makale, kolayca kolay uyarlanabilir...

Kemik İliği Türetilmiş makrofajlar kullanarak Makrofaj Polarizasyon İncelenmesi

İnsan makrofaj üretimi için basit ve etkin bir protokol sunuyoruz. İnce beyaz kat çifte yoğunluk gradyanlı santrifugasyon sureti ile işlenir ve izole edilmiş monositlerin, sonra Teflon kaplı bir hücre kültürü torbalarda makrofajlara ayrılır. Bu makrofaj verim maksimize ve daha sonraki deneyler için hücre hasat kolaylaştırır.

İnsan Çift Gradient Santrifüj ile Monositlerinde ve teflon kaplı Hücre Kültürü Çantalar Makrofagların Onların Farklılaşma İzolasyonu

Burada mikroskopve floresan boyama kullanarak canlı hücre kültüründe makrofaj ekstrasellüler tuzak (MET) üretimini tespit etmek için bir protokol sunulmaktadır. Bu protokol, immünoresans boyama ile spesifik MET protein belirteçlerini incelemek için daha da genişletilebilir.

Diferansiye İnsan Monosit türevi Makrofajlarda Hücre Dışı Tuzak Salınımının İn Vitro Stimülasyon ve Görselleştirilmesi

Bu protokol, insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerden makrofajların sağlam nesil açıklar, ve sonraki karakterizasyonu için yöntemler. Hücre yüzeyi belirteç ekspresyonu, gen ekspresyonu ve fonksiyonel tahliller bu iPSC kaynaklı makrofajların fenotip ve fonksiyonunu değerlendirmek için kullanılır.

Pluripotent Kök Hücrelerden İnsan Makrofajlarının Üretimi ve Karakterizasyonu

Bu protokol, insan M1 veya M2 polarize makrofajlardaki Mycobacterium tuberculosis enfeksiyonunu, periferik-kan monositlerinin GFP etiketli virülan strain H37Rv ile enfekte olan makrofaj benzeri hücrelere farklılaşmasına dayanan ve seçilen M1/M2 belirteçlerinin ifadesini içeren 10 renkli bir panel kullanılarak akış sitometrisi ile analiz edilen bir yöntem sağlar.

M1 ve M2 İnsan Monosit Türevi Hücrelerin Polarizasyonu ve Mikobakteri Tüberküloz Enfeksiyonu Üzerine Akış Sitometrisi ile Analiz

M2 benzeri tümör ilişkili makrofajlar (TAM) tümör ilerlemesi ve kanserde zayıf prognoz ile ilişkilidir. Bu protokol, THP-1 monosit benzeri hücreleri 14 gün içinde M2 benzeri makrofajlara yeniden ayırt etmek ve polarize etmek için ayrıntılı bir kılavuz görevi görür. Bu model, TAM'ın tümör mikroçevriciliği içindeki antienflamatuar etkilerini araştırmak için temel oluşturur.

makrofaj Farklılaşması ve Polarizasyonu, İnsan Monosit Benzeri THP-1 Lösemi Hücre Hattı Kullanarak M2 Benzeri Bir Fenotipe Dönüştür

Burada, mevcut protokollerin güvenilirliğini ve tekrarlanabilirliğini iyileştirmeyi ve daha fazla araştırmayı teşvik etmeyi amaçlayan, in vitro implant yüzeylerinin immünomodülatör potansiyelini değerlendirmek için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Salgı sitokin profilleri, mRNA ekspresyonu ve hücre yüzey belirteçleri, titanyum üzerinde yetiştirilen makrofaj polarizasyonunu araştırmak için kan monositinden türetilmiş makrofajlar kullanılarak izlendi.

İmplant Yüzeylerinde M1 ve M2 İnsan Monosit Türevi Makrofajların Polarizasyonu ve Karakterizasyonu 

Monositler ve makrofajlar, sağlık ve hastalık için çok önemli olan çok plastik ve yeniden programlanabilir bağışıklık hücreleridir. Belirli farklılaşma programları ve fenotipleri benimseyerek çok çeşitli uyaranları algılar ve bunlara yanıt verirler. Makrofaj polarizasyonunu ve yeniden programlamayı incelemek için bir in-vitro modeli standartlaştırdık ve araştırma için değerli bir araç sağladık.

İnsan Monositinden Türetilmiş Makrofajların İn vitro Tahliller için Yeniden Programlanması

Öğrenin, yoğunluk gradyanı santrifüjasyonu ve negatif boncuk izolasyonu ile insan periferik kanından monositleri izole edip makrofajlara farklılaştırma yöntemini. Bu model, polarizasyon belirteçlerinin qPCR ile analizi için kullanılır.

Bir

Daha fazla video keşfet