Bir

Aşağıdaki deneyin genel amacı, monositleri insan periferik kanından izole etmek ve bunları farklı makrofaj polarizasyon tiplerine doğru ayırt etmektir. Bu, ilk olarak insan periferik kan mononükleer hücrelerinin yoğunluk gradyanlı santrifüjleme ile izole edilmesiyle elde edilir. İkinci adım olarak, saf CD 14 pozitif monositler elde etmek için negatif boncuk izolasyonu yapılır.

Daha sonraki monositler, spesifik olarak polarize makrofajları indüklemek için belirli koşullar altında kültürlenir. Sonuç olarak, makrofaj polarizasyon belirteçlerinin kültür koşullarına yanıt olarak diferansiyel ekspresyonu, kantitatif PCR ile belirlenebilir. Bu yöntem, makrofajların farklı polarizasyon tiplerine doğru farklılaşmasını incelemeye yardımcı olabilir.

Ateroskleroz gibi iltihaplı hastalıklarda son derece önemli olan bir özellik. Bir gönüllüden önkol damarından 30 mililitre tam kan aldıktan sonra, kanı iki polistiren olmayan 50 mililitrelik konik tüpe eşit olarak bölün. Daha sonra her tüpteki kanı 10 mililitre PBS ile seyreltin.

Daha sonra, her tüpteki 25 mililitre tam kan ve PBS'ye 25 mililitre histo paketi ekleyin, histo paketi ile kanın karışmamasına dikkat edin. Daha sonra tüpleri 30 dakika boyunca 400 Gs'de ve oda sıcaklığında ara vermeden santrifüjleyin. Döndürme işleminden sonra önce plazma katmanını aspire edin ve ardından opak arayüz katmanını 50 mililitrelik yeni bir tüpe aktarın.

Hücreleri arayüzden 20 mililitre PBS artı CDTA'da 250 Gs ve dört santigrat derecede beş dakika boyunca yıkayın. Daha sonra süpernatan resüsü attıktan sonra, peleti 10 mililitre PBS artı CDTA içinde askıya alın ve hücreleri 10 saniye boyunca girdaplayarak iyice karıştırın. Şimdi 200 mikrolitre hücre süspansiyonunu 300 mikrolitre PBS artı EDTA ve 500 mikrolitre triam mavisi ile seyreltin.

10 kare ve bir hemo sitometre başına yaklaşık 200 ila 500 hücre elde etmek için, hücreleri 120 Gs'de 10 dakika boyunca üç kez döndürerek negatif izolasyona başlayın İkinci yıkamadan sonra, peleti dokuz mililitre steril suda üç saniye boyunca askıya alıyoruz. Daha sonra, hücreleri bir kez daha yıkadıktan ve saydıktan sonra bir mililitre 10 XPBS ekleyin, mililitre başına yedi hücrenin 10'unun beş katı kadar kolay ayarlanmış tamponda seyreltin. Şimdi hücreleri, mililitre monosit zenginleştirme kokteyli başına 50 mikrolitre içinde dört santigrat derecede 10 dakika inkübe edin.

İnkübasyonun son dakikasında, cept monosit zenginleştirme boncuklarını 30 saniye boyunca girdaplar. Daha sonra boncukların mililitresine 50 mikrolitre hücrelere ekleyin ve boncuğu hücre süspansiyonunda beş dakika daha inkübe edin. İkinci inkübasyondan sonra, hücre çözeltisi hacmini 2,5 mililitreye getirin.

Daha fazla eep tamponu ile çözelti şimdi kahverengimsi bir renkte görünecektir. Ardından, tüpü oda sıcaklığında iki buçuk dakika boyunca bir eep mıknatısına yerleştirin. Boncuk bağlı hücreler yapışma şansı bulduktan sonra, bağlayıcı olmayan monositleri içeren tamponu taze bir steril tüpe dökün.

Bağlanmamış hücreleri PBS artı EDTA ile bir kez yıkadıktan sonra çözelti şimdi beyazımsı bir renk görünecek, hücreleri çok kuyucuklu bir plakaya aktaracak, daha sonra kültür plakasına altı hücreye bir kez 10 kere bir mililitre kültür ortamı ekleyecektir. Son olarak, makrofaj farklılaşmasını indüklemek için hücreleri altı gün boyunca deneysel koşullar altında kültürleyin. Üç gün sonra ortamın yarısını altı gün sonra yeni ortamla değiştirin.

İstenen deneysel analiz için hücreleri hasat edin. Yukarıda tarif edilen protokolü kullanarak, yaklaşık 25 kez, altı monositin 10'u rutin olarak 100 mililitre kandan elde edilir; CD 14 için akış sitometrik boyama ile belirlenen monosit saflığı, kültüre ilk eklendiğinde rutin olarak% 95'ten daha büyüktür. Monositler başlangıçta yuvarlak şekillidir ve birkaç saat içinde yüzer.

Bununla birlikte, altı gün sonra onlara kızarmış yumurta veya iğ benzeri bir görünüm vererek yapışırlar. Tek başına MCSF ile kültürde veya son 24 saat boyunca oksitlenmiş LDL ilavesiyle veya oksitlenmiş LDL'ye maruz kalmayan hücrelerin kabaca %80'i propidyum iyodür ile belirlendiği gibi canlıdır. Öte yandan, oksitlenmiş LDL ile boyama tedavisi, altı günlük kültürden sonra yaklaşık% 70 hücre canlılığı ile sonuçlanır.

MCSF akışı ile SİTOMETRİK analiz, hücrelerin lökosit markörü CD 45 ro'yu eksprese etmeye devam ederken, monosit markörü CD 14'ü aşağı regüle ettiklerini göstermektedir. Hücre kültürü sırasında makrofaj polarizasyonunu indükleyebilecek spesifik koşullara bağlı olarak, başarılı polarizasyonu garanti etmek için ek belirteçler gereklidir. Spesifik koşullar makrofaj polarizasyonuna neden olabilir.

Örneğin, M1 polarize makrofajlar IL altı ve TNF alfa gibi tipik belirteçleri eksprese ederken, M iki polarize makrofaj CD 36 ve CD 2 0 6'yı eksprese ederken, makrofajlar fonksiyonel deneylerde daha fazla incelenebilir. Örneğin, oksitlenmiş LDL'nin alımı, floresan etiketli LDL kullanılarak incelenebilir. Bu deneyde, hücreler dört saat boyunca mililitre başına 10 mikrogram DII etiketli oksitlenmiş LDL'ye maruz bırakıldı ve çekirdekler dpi ile boyandı.

Histogram, MCSF'nin neden olduğu makrofajlar tarafından DII oksitlenmiş LDL alımının akış sitometrik ölçümünü, tedavi edilmemiş kontrol hücrelerini temsil eden katı gri histogram ve siyah açık histogram ile gösterir. Oksitlenmiş LDL ile muamele edilmiş makrofajları temsil eder Gelişiminden sonra. Bu teknik, araştırmacıların insan makrofajlarının farklılaşmasını ve heterojenliğini incelemelerini sağlar.

Böylece, yeni hastalık mekanizmalarını ve yeni terapötik hedefleri belirlemek için ateroskleroz gibi enflamatuar hastalıkları incelemelerine olanak tanır.