Name: Rekombinant çekirdek histon nükleozomal Diziler ve Nükleozom Konumlandırma DNA Meclisi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-10T17:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 40 s
Description: Öğrenin rekombinant çekirdek histonlar ve nükleozom konumlandırma DNA kullanarak nükleozomal dizi montajı. Bu biyokimya yöntemi kromatin yapısı ve gen düzenlemesi araştırmalarında temel bilgiler sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma NIH hibe GM45916 ve GM66834 Hi&#39;de ve bu işi Ak Uluslararası Rett Sendromu Vakfı bir burs ile desteklenmiştir da NIH GM088409 ve Howard Hughes Tıp Enstitüsü KL katkıları hibe tarafından desteklenen

1.. Octamers içine Rekombinant çekirdek histon Meclisi Gerekçe: nucleosomal dizi sulandırma içinde ilk adım Liyofilize rekombinant çekirdek histon adlı doğal çekirdek histon octamers hazırlamaktır. Histon proteinler eşit molar miktarlarda bir araya getirilmiş ve tekrar katlama tampon maddesi içine bir denatüre edici tampon üzerinden örnekleri diyaliz ile histon octamers içine monte edilir. <ol><li> Arındırmak ve 13, tarif edildiği gibi (H2A, H2B, H3, H4) yeniden birleştirici çekirdek histon liyofilize edilir. </li><li> Açılımı tamponu (6 M guanidinyum HCI, 20 mM Tris pH 7.5, 5 mM DTT) içinde, 3 ml, her liyofilize çekirdek histon yaklaşık olarak 5 mg çözülür. Her eş pay, en az bir saat boyunca eritmek için izin verin. Herhangi bir protein, kabın iki kalmasını sağlayın. </li><li> Bir referans olarak açılımı tamponu kullanılarak 276 nm&#39;de her bir histon absorbansı ölçülür. </li><li> Bunların yok olma katsayıları kullanılarak her bir histon molaritesini hesaplayın (bakınız Tablo 1 </stRong&gt; Xenopus histon sönme katsayıları için). Proteininin büyük bir kısmı çözülür ise, liyofilize kuru ağırlığı ve tahmine histonun absorbans belirlenmiştir konsantrasyonu karşılaştır. </li><li> Bu tüm histonlanm mol sınırlayıcı sayısı olacak gibi, sen az mol sahip olan histon belirleyin. </li><li> Eşit molar miktarlarda histonları birleştirin ve 1 mg / ml &#39;lik nihai bir konsantrasyona kadar tampon açılımı ile seyreltin. </li><li> 6-8 kDa MWCO diyaliz tüp içine örneği yerleştir. Boru Seal ve soğuk katlama tamponu, 2 L içine koyun (2 M NaCl, 10 mM Tris pH 7.5, 1 mM EDTA, 5 mM β-merkaptoetanol). </li><li> Karıştırılarak 4 ° C&#39;de 18 saat için örnek Dialyze. Emin diyaliz boru serbestçe ve şiddetle dönebilir, ya da başka histon hızlandırabilir. </li><li> Iki kere 18 saatlik bir süre (örneğin, her tamamlanan kadar 6 saat ilgili katlama tampon değiştirme) &#39;de diyaliz tampon değiştirin. Çökelti meydana bile atmak yokverim azaltılabilir rağmen, numune, bir oktamer geri kazanılabilir. </li></ol> Not: Bir sonraki gün için sütun dengeye hazırlamak için adım 2.1-2.2 bakın. 2. Boyut Dışlama Kromatografisi ile Histone Octamers saflaştırılması Gerekçe: Bölüm 1 ile tamamladıktan sonra, numuneler histon octamers yanı sıra, agrega, H3/H4 tetramerleri ve H2A/H2B dimerler gibi histon kompleksleri içerir. Histon octamers uzak boyut dışlama kromatografisi (SEC) ile bu komplekslerden arıtıldı olacaktır. <ol><li> Bir Hiload bir FPLC sistemi 16/60 Superdex-200 16/60 (S200) kolonu bağlayın. Hava kabarcıkları sisteme girmeyin emin olun. </li><li> 0.2 um filtre edildi, su ile S200 sütunu temizleyin. 0.3 ml / dk &#39;lık bir akış hızı kullanarak, 0.5 MPa bir geri basınç sınırını belirler. Eğer yeterli su sağlanması ve sütun gecede temizlemek için izin. </li><li> F S200 kolon ve örnek döngü dengelePLC yeniden katlama tamponu kullanılarak. 0.2 um filtre edildi tekrar katlama tampon maddesi 1 L kullanın. 1 ml / dk &#39;lik bir oranda ve yaklaşık 2 saat boyunca 0.5 MPa bir azami basınçla kolonundan katlama tampon akış. </li><li> Yeniden katlama tamponu içinde 1 ml bir Vivaspin santrifüj konsantratör (50 kDa MWCO) dengelenmesi. Diyaliz tüpünden alınan numuneyi çıkarın ve çökeltileri uzaklaştırmak üzere, 4 ° C de bir örnek santrifüj. Konsantratör içine örnek süpernatant pipetle. Yaklaşık 500 ul&#39;lik bir hacme kadar konsantre örneği. </li><li> Yeni bir kaba üzere, konsantre oktamer numuneyi çıkarın ve 1 ml tampon ile tekrar katlama konsantratör yıkayın. 500 ul durulama aşağı Konsantre ve oktamer örnek ekleyin. Bu durum, bir deriştirme aygıtı içinde kalan oktameri kurtarmak için yardımcı olur. </li><li> 4 ° C&#39;de 10,000 rpm&#39;de 5 dakika boyunca bir 1.5 ml mikrofüj tüpüne örnek Spin Süpernatan toplamak ve yeni bir tüpe aktarılır. Bu, FPL ile ilgili örnek yüklemeden önce herhangi bir çökeltiyi uzaklaştırmak için yardımcı olurC. </li><li> S200 kolonuna örnek yükleyin. Tek bir saflaştırma 1.5 ml toplam hacmi veya 15 mg oktamer maksimum yükleyin. </li><li> Taze yapılmış yeniden katlama tamponu kullanılarak örnek Zehir. 1 ml / dk &#39;lık bir akış hızı ve 0.5 MPa arasında bir geri basınç sınırı kullanın. Yeniden katlama tamponu, iki kolon hacmi (400 mi) kullanarak ve 2 ml fraksiyonlar toplar. Elüsyon süresince, 280 nm&#39;de absorbansı izleyin. Farklı türlerin boyutunu azalan Zehir olacaktır. Histon agrega genellikle yaklaşık 84 ml (Şekil 1) en az yaklaşık 45 ml, yaklaşık 65 ml oktamer de ve dimer elute. </li><li> Bir 18-20% SDS-PAGE üzerinde örnekleri çalıştırarak ilgi tepelerinden elüsyon fraksiyonları analiz edin. Saflaştırılmış octamers ihtiva eden fraksiyonlar dört çekirdek histon proteinleri eşit molar miktarda (Şekil 1) sahip olmalıdır. </li><li> Saflaştırılmış octamers içeren kesirler havuzu ve bir Vivaspin santrifüj filtre ile 15 mg / ml ≤ için konsantre. Sulandırmak bırakılırsa, octamers kesmek olabilir iNto H2A/H2B dimerleri ve H3/H4 tetramerler. </li><li> 280 nm&#39;de absorbansı ölçerek oktamer konsantrasyonunu belirleyin ve Tablo 1 sönüm katsayısı kullanarak hesaplar. </li><li> Histon octamers 4 ° C&#39;de tekrar katlama tampon maddesi içinde kısa süreli tutulabilir Uzun süreli depolamada halinde, octamers -20 ° C&#39;de ve bir% 50 gliserol çözeltisi içinde daha kararlı olacaktır. Gliserol içinde depolanmıştır Octamers absorbans ölçümleri yapılmadan önce taze yeniden katlama tamponuna karşı dializ edilmiş ve nükleozomal dizi reconstitutions olarak kullanmak gerekir. </li></ol> 3. DNA dizileri ve nükleozomal Saflaştırılmış Octamers Sulandırılması Gerekçe: nükleozomal dizilerin Sulandırma histon octamers ve şablon DNA spesifik mol oranlarında bir araya gerektirir. 2 M NaCI içinde DNA ve histon octamers karışımları iyonik mukavemeti azalan tampon içine dialize adımdır. Düşük tuz kademeli değişim Uygun nucleosome oluşumunu sağlar. N eldeşablon DNA histon oktamer doygunluk istenen düzeyde ucleosomal diziler büyük ölçekli bir hazırlayıcı yeniden oluşturulması, ardından küçük ölçekli bir test reconstitutions gerektirir. Küçük ölçekli reconstitutions tarafından tanımlanan uygun koşullar hazırlayıcı yeniden oluşturma yönlendirmek için kullanılır. <ol><li> 4,12 anlatıldığı gibi tandem tekrar nükleozom konumlandırma DNA arındırın. Kısaca, bir Qiagen GigaPrep kiti ya da benzeri bir ürün kullanılarak plazmid DNA izole eder. Set-up bir kısıtlama enzim şablon DNA&#39;yı serbest bırakmak ve daha küçük boyutlarda (≤ 700 bp) için plazmid DNA sindirmek için sindirmek. Şablon DNA daha sonra uzak boyut dışlama kromatografisi (SEC) kullanılarak küçük bir plazmid DNA kalıntılarından saflaştırılabilir. A ağırlık Sephacryl S-1000 boncuklarla doludur yaklaşık 115 cm&#39;lik bir yüksekliğe sahip bir sütun beslenen 207bp 601 x 12 mer DNA saflaştırılması için yeterlidir. </li></ol> Notlar: plazmid DNA azalma pahasına arınma ancak artan eff içinort, bir E. plasmid DNA izole etmek için fenol / kloroform DNA saflaştırma ile alkalin liziz kullanabilir coli 23,24. Plazmid DNA şablon DNA&#39;nın ayrılması için Stratejiler şablon DNA boyut değişiklikleri ile farklılık gösterebilir. SEC için bu kısıtlama enzimi şablonu ve plasmid DNA arasındaki büyüklüğü farkı maksimuma bir şekilde, sindirimi kurmak için önemlidir. <ol start="2"><li> Molar oranları (r) reconstitutions için hangi belirler. R DNA tekrarının mol oktamer mol oranına eşittir. Niyet doymuş nucleosomal diziler elde etmek ise ilk küçük ölçekli araştırmalar için, 0.9, 1, 1.1 ve r değerleri uygundur. </li><li> Test edilecek her bir mol oranı için yaklaşık olarak 18 ug DNA eklemek için oktamer miktarının hesaplanması ile küçük çaplı numune hazırlayın. DNA ve histon octamers karıştırın. Örnekteki NaCI nihai konsantrasyon 2 M ≥ ve D nihai konsantrasyonu olmalıdırNA yaklaşık 0,3 mg / ml olmalıdır. Son numune tamponu koşulları da 10 mM Tris, pH 7.8 ve 1 mM EDTA içermelidir. </li><li> Numuneler artık diyaliz için hazırız. 12k-14k MWCO diyaliz tüp içine örnekleri yükleyin. Aşağıdaki gibi iyonik mukavemetini azaltır tampon 2L karşı örnekleri Dialyze. </li></ol> 10 mM Tris pH 7.8, 1 mM EDTA: Bütün tamponlar içerisinde Bileşenleri. Tampon 1 5-6 saat boyunca (1 M NaCl, 1 mM DTT ekleyin). Tampon 2, gece boyunca (0.75 M NaCl, 1 mM DTT ekleyin). Tampon 3 saat boyunca, 5-6 (2.5 mM NaCI, 1 mM DTT ekleyin). Tampon 4 gece boyunca (2.5 mM NaCI, 0.1 mM PMSF ekleniyor). <ol start="5"><li> Diyaliz borudan örnekleri çıkarın ve bölümlere 4-6 geçin. Küçük ölçekli örnekler istenen sonuçları ise, büyük ölçekte bölümler 3-6 adımları tekrarlayın. </li></ol> Not: bilgi muhafaza etmek için, küçük ölçekli örnekler alt tarama deneyleri için yeterli için gerekli olan minimum hacme sahip olmalıdır. E sahip amacıylanough 0.3 mg / ml DNA da burada listelenen çökelme hızı ve AFM deneyler, 50 ul örnekler için örnek uygundur. Büyük ölçekli büyüklüğü, hazırlayıcı örnekler amaçlanan kullanıma bağlıdır. Büyük ölçekli bir numunesi, küçük ölçekli örneklerle aynı şekilde hazırlanmalıdır. 4. Sulandırılmış nucleosomal Dizilerin sedimantasyon hızı analizi Gerekçe: çözelti içinde moleküllerin büyüklüğü ve şekli ile ilgili en Beckman XL-A / I Analitik ultrasantrifüj verim bilgilerde sedimantasyon hızının deneyleri. Düşük tuz koşulları altında, sedimantasyon hızının deneyler yeniden dizileri nükleozom doymuş hangi ölçüde belirlemek için kullanılır. <ol><li> TEN tamponu (10 mM Tris pH 7.8, 1 mM EDTA, 2.5 mM NaCl) kullanılarak, 260 nm&#39;de 0.5 bir soğurma için örnek seyreltin. Bir tarafta ve numune referen ile, iki sektör merkez ile bir hücreye örnek 400 ul yükDiğer 25 ce (TEN tampon). (Yani 420 ul referans çözümü eklemek) numune menisküsün daha yüksek referans menisküs tutun. </li><li> Rotor içine hücreleri yükleyin ve düzgün hücre ve rotorun 25 alt kısmında karma işaretleri kullanarak hücreleri hizalayın. Yavaşça basınçlı hava ile hücrelerin lensler toz. </li><li> , XL-A/XL-I santrifüj açmak rotor takın ve eklemek ve kılavuzunda anlatıldığı gibi optik sabitleyin. Yeni: Proteom Lab yazılımı seçin ve dosyayı açın. </li><li> 3,000 rpm ve 25 ° C sıcaklıkta, tek bir tarama çalıştırmak kurmak Seçenekleri altında seçin son taramadan sonra durma ve çalışma radyal kalibrasyon (rotor EAA kullanılan son rotor ise radyal kalibrasyon gerekli değildir). </li><li> Her bir hücre için, numune adı bir dalga boyu (260 nm) seçin, absorbans seçin ve bilgisayarınıza bir dosyayı kaydetmek konumu seçin. Tek bir tarama çalıştırmak başlayın. </li><li> Uygun ra belirlemek için tek tarama kullanınTarama uzunluğu (Şekil 2A) çevirin. Taranır hücrenin uzunluğunun azaltılması kullanım süresini azaltır. Ancak örnek menisküs içerir ve çok yakın ya da hücrenin altındaki doğru uzanır ve emin olun. </li></ol> Not: Tek taramalar ölçüm alanı sadece örnek menisküs (Şekil 2A) önce başlayarak ölçümler kısaltılmış izin verir. AUC çalışması sırasında üretilen taramasından en menisküs gibi istikrarlı platolar (Şekil 2B) geçen sınır fraksiyonlar olmalıdır. EAA hücreleri üzerinde kirli lensler büyük sivri taramalar üretebilir, bu verilerin analizini etkileyebilir. UltraScan yazılım analitik ultrasantrifügasyon verilerin 26 analizi ile ilgili bilgi için büyük bir kaynaktır bir kılavuzu içerir. <ol start="7"><li> XL-A/XL-I kontrol panelini kullanarak, bir 0 hız ve basın başlangıç ​​girin. Bu, bir vakum ve çekmek için santrifüj haznesi isteyecektirow odasının sıcaklığı dengelenmeye. Bir çalışma başlamadan önce sıcaklık dengesini sağlamak için 1 saat bekleyin. </li><li> İstenilen hız ve tarama sayısı için çalışma yukarı ayarlamak için yazılımını kullanın. Daha yüksek hızlar çözünürlüğünü artırabilir, ancak numune hücresinin alt tortulaşmış önce bir adet en azından 20 taramalar (tercihen daha fazlası) toplamalıdır. Bu çalıştırmak ilerlemeyi izlemek ve bu sızıntı hücreleri gibi olası sorunları kontrol etmek için (seçenekler menüsünden gerçekleştirilir) son birkaç taramaları kaplanması uygundur. Düzgün çalışmasını sağlamak için taramalar ilk çift izleyin. </li></ol> 5. Sedimentasyon Hızı Veri düzenleme ve Analizi Gerekçe: Ham sedimantasyon hızı verileri, difüzyon-düzeltilmiş sedimantasyon katsayısı dağılımını veren bir program tarafından analiz edilmelidir. Sırayla Bu bilgi, belirli bir doygunluk düzeyini içeren bir yeniden numunenin kısmını gösterir, örn </em&gt; 12-mer DNA şablonu kullanarak eğer 10, 11, 12 ve nükleozom / DNA yeniden sahip dizilerin fraksiyonunu belirlemek mümkün olacaktır. <ol><li> Verileri 26 düzenlemek için bu tür UltraScan gibi AUC veri analiz yazılımı kullanın. Tarama verilerinin düzenleme her bir hücre için yapılır ve sonraki analiz için bir veri kümesi oluşturur gerekir. Taramaları doğru düzenleme, örnek menisküs tanımlayan ilgi bölgeye verileri azaltarak ve taban çizgisini yanı sıra yayla bölgeleri (Şekil 2) tanımlamayı kapsar. İstenmeyen taramaları da bu noktada belirlenen verilerden çıkarılabilir. Bu analiz sırasında istenmeyen taramalar kaldırmak mümkündür Bununla birlikte, bu tarama, tüm bu noktada tutulması önerilir. </li><li> Önemle gelişmiş van Holde-Weischet yöntemi veriler 27 analiz etmek için kullanılır öneririz. Bu analiz yöntemi çalıştırmak boyunca difüzyon etkileri için düzeltir ve sedimentasyon katsayıları tamamlayıcı dağılımı elde edilir. Özellikle, Gelişmiş van Holde-Weischet yöntemi (UltraScan uygulandığı gibi) kararlı yaylaları eksikliği, ya da analiz 28 menisküs temizlenmiş değil sınır kesirler içerdiğini taramalarının dahil edilmesine izin verir. </li><li> Monte diziler için sedimantasyon katsayılarının dağılımını belirlemek. 601-12 (207bp, 12-mer) nükleozomal diziler için Örnek sonuçlar Şekil 3&#39;te gösterilmiştir. </li><li> Küçük ölçekli örneklerinden biri sedimantasyon katsayıları arzu edilen dizi dizileri içeriyorsa, o zaman bölümü 3 başlayarak artan bir ölçekte işlemini tekrarlayın. Küçük ölçekli örneklerin hiçbiri sedimantasyon katsayılarının uygun dağılımına sahip ise 3. bölümde başlayan yeni bir r dizi küçük ölçekli testleri tekrarlayın. </li></ol> 6. Atomik Kuvvet Mikroskobu kullanarak nucleosomal Dizileri görselleştirme (AFM) Gerekçe: AFM sağlar: nucleosoma doyma seviyesinin görselleştirmel diziler. Bu teknik, bir kalite kontrol deneyi olarak AUC ve sınır enzimi sindirimi ile sedimantasyon hızını tamamlar. <ol><li> Yukarıda tarif edilen yöntemler kullanılarak, ve doygun nükleozom dizisi (Şekil 5A) elde edilmiştir. </li><li> Hazırlama APTES yerleştirerek mika slaytlar ~ 30 ul muamele edilmiş, 30 dakika için 0.22 um filtre nanopure su içinde ticari (Sigma-Aldrich (3-Aminopropil)-trietoksisilan A3648 100 mi) içinde 1:1000 seyreltme. </li><li> 30 dakika sonra filtre edildi, su ile APTES durulayın ve yavaşça azot gazı akışı içinde kurutun. </li><li> Slayt üzerinde uygun şekilde seyreltilmiş nükleozom dizisi örneği (~ 1.5 ng / ml) yerleştirin ve 15 dakika için oda sıcaklığında kapalı inkübe edin. </li><li> Süzüldü, numune tamponu ile kapalı gibi örnek önce kurumasını ve AFM (bu durumda bir Sığınma Araştırma MFP-3D Atomik Kuvvet Mikroskobu) ve sahnede yer slayt durulayın. </li><li> 512 tarama hattı ile 2 x 2 mikron taramaları görüntüleme başlayın. Sa seviyesini tespit etmek nükleozomlann sayısınıturation (Şekil 5B). </li><li> İdeal gerektiği de ayrı nucleosome dizilerle slaytta görüntü alanları. </li><li> Daha yüksek çözünürlüklü görüntüler, 500 x 500 nm tarama (Şekil 5C) elde edilebilir. </li><li> Görüntüler basık ve İltica tarafından sağlanan MFP-3D yazılımı kullanılarak analiz edilebilir. </li><li> Her görüntü dört parçaya bölünür ve nükleozomlann (Şekil 5C, sağ panel-yükseklik izleme için elde edilen diziler ve yükseklik profilleri üzerinden çizilebilir iyi ayrılmış diziler ve çoklu serbest el çizgileri net bir görünüm elde etmek için dijital zoomlanabilir ve 5D). </li><li> Birkaç tür görüntüler nükleozomlann yüzlerce kapsayan dizinin her bir türü için analiz edilmelidir. Yükseklik profilleri, kaydedilmiş kategorize ve MS Excel çizilmiştir. </li></ol>

<ol><li>Luger, K., Mader, A., Richmond, R., Crystal Sargent, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((structure+of+the+nucleosome+core+particle+at+2.8+A+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution.</a> Nature. 7, (1997).</li>
<li>Hansen, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+dynamics+of+the+chromatin+fiber+in+solution%3A+determinants%2C+mechanisms%2C+and+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biophysics+and+Biomolecular+Structure%22%5BJournal%5D)">Conformational dynamics of the chromatin fiber in solution: determinants, mechanisms, and functions.</a> Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 31, 361-392 (2002).</li>
<li>McBryant, S., Adams, V., Hansen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+architectural+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosome+Research%22%5BJournal%5D)">Chromatin architectural proteins.</a> Chromosome Research. 14 (1), 39-51 (2006).</li>
<li>Hansen, J. C., Ausio, J., Stanik, V. H., van Holde, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homogeneous+reconstituted+oligonucleosomes%2C+evidence+for+salt-dependent+folding+in+the+absence+of+histone+H1%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Homogeneous reconstituted oligonucleosomes, evidence for salt-dependent folding in the absence of histone H1.</a> Biochemistry. 28 (23), 9129-9136 (1989).</li>
<li>Szerlong, H. J., Prenni, J. E., Nyborg, J. K., Hansen, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activator-dependent+p300+acetylation+of+chromatin+in+vitro%3A+enhancement+of+transcription+by+disruption+of+repressive+nucleosome-nucleosome+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Activator-dependent p300 acetylation of chromatin in vitro: enhancement of transcription by disruption of repressive nucleosome-nucleosome interactions.</a> The Journal of Biological Chemistry. 285 (42), 31954-31964 (2010).</li>
<li>Cirillo, L. A., Lin, F. R., Cuesta, I., Friedman, D., Jarnik, M., Zaret, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opening+of+compacted+chromatin+by+early+developmental+transcription+factors+HNF3+%28FoxA%29+and+GATA-4%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Opening of compacted chromatin by early developmental transcription factors HNF3 (FoxA) and GATA-4.</a> Molecular Cell. 9 (2), 279-289 (2002).</li>
<li>Nguyen, C., Gonzales, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((chromatin+structure+associated+with+methylation-induced+gene+silencing+in+cancer+cells%3A+correlation+of+accessibility%2C+methylation%2C+MeCP2+binding+and+acetylation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">chromatin structure associated with methylation-induced gene silencing in cancer cells: correlation of accessibility, methylation, MeCP2 binding and acetylation.</a> Nucleic Acids Research. 29 (22), 4598-4606 (2001).</li>
<li>Cuesta, I., Zaret, K. S., Santisteban, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+forkhead+factor+FoxE1+binds+to+the+thyroperoxidase+promoter+during+thyroid+cell+differentiation+and+modifies+compacted+chromatin+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">The forkhead factor FoxE1 binds to the thyroperoxidase promoter during thyroid cell differentiation and modifies compacted chromatin structure.</a> Molecular and Cellular Biology. 27 (20), 7302-7314 (2007).</li>
<li>Simpson, R. T., Stafford, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+features+of+a+phased+nucleosome+core+particle%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Structural features of a phased nucleosome core particle.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 80 (1), 51-55 (1983).</li>
<li>Lowary, P. T., Widom, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+DNA+sequence+rules+for+high+affinity+binding+to+histone+octamer+and+sequence-directed+nucleosome+positioning%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">New DNA sequence rules for high affinity binding to histone octamer and sequence-directed nucleosome positioning.</a> Journal of Molecular Biology. 276 (1), 19-42 (1998).</li>
<li>Lowary, P., Widlund, H., Cao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+motifs+and+free+energies+of+selected+natural+and+non-natural+nucleosome+positioning+DNA+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Sequence motifs and free energies of selected natural and non-natural nucleosome positioning DNA sequences.</a> Journal of Molecular Biology. 288, 213-229 (1999).</li>
<li>Gordon, F., Luger, K., Hansen, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Core+Histone+N-terminal+Tail+Domains+Function+Independently+and+Additively+during+Salt-dependent+Oligomerization+of+Nucleosomal+Arrays+%2A%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The Core Histone N-terminal Tail Domains Function Independently and Additively during Salt-dependent Oligomerization of Nucleosomal Arrays *.</a> The Journal of Biological Chemistry. 280 (40), 33701-33706 (2005).</li>
<li>Luger, K., Rechsteiner, T. J., Richmond, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+purification+of+recombinant+histones+and+nucleosome+reconstitution%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology+%28Clifton%2C+N.J.%29%22%5BJournal%5D)">Expression and purification of recombinant histones and nucleosome reconstitution.</a> Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 119 (4), 1-16 (1999).</li>
<li>McBryant, S. J., Klonoski, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determinants+of+histone+H4+N-terminal+domain+function+during+nucleosomal+array+oligomerization%3A+roles+of+amino+acid+sequence%2C+domain+length%2C+and+charge+density%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Determinants of histone H4 N-terminal domain function during nucleosomal array oligomerization: roles of amino acid sequence, domain length, and charge density.</a> The Journal of Biological Chemistry. 284 (25), 16716-16722 (2009).</li>
<li>Ma Shogren-Knaak,, Fry, C. J., Peterson, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+native+peptide+ligation+strategy+for+deciphering+nucleosomal+histone+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A native peptide ligation strategy for deciphering nucleosomal histone modifications.</a> The Journal of Biological Chemistry. 278 (18), 15744-158 (2003).</li>
<li>Lu, X., Simon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+H3K79+dimethylation+and+H4K20+trimethylation+on+nucleosome+and+chromatin+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The effect of H3K79 dimethylation and H4K20 trimethylation on nucleosome and chromatin structure.</a> Nat Struct Mol Biol. 15 (10), 1122-1124 (2008).</li>
<li>Ausio, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analytical+Ultracentrifugation+for+the+Analysis+of+Chromatin+Structure%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Analytical Ultracentrifugation for the Analysis of Chromatin Structure.</a> Biophysical Chemistry. 86 (2-3), 141-153 (2000).</li>
<li>Hansen, J., Kreider, J., Demeler, B., Fletcher, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analytical+ultracentrifugation+and+agarose+gel+electrophoresis+as+tools+for+studying+chromatin+folding+in+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Analytical ultracentrifugation and agarose gel electrophoresis as tools for studying chromatin folding in solution.</a> Methods. 12 (1), 62-72 (1997).</li>
<li>Montel, F., Menoni, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamics+of+individual+nucleosomes+controls+the+chromatin+condensation+pathway%3A+direct+atomic+force+microscopy+visualization+of+variant+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">The dynamics of individual nucleosomes controls the chromatin condensation pathway: direct atomic force microscopy visualization of variant chromatin.</a> Biophysical Journal. 97 (2), 544-5453 (2009).</li>
<li>Muthurajan, U. M., McBryant, S. J., Lu, X., Hansen, J. C., Luger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+linker+region+of+macroH2A+promotes+self-association+of+nucleosomal+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The linker region of macroH2A promotes self-association of nucleosomal arrays.</a> The Journal of Biological Chemistry. 286 (27), 23852-23864 (2011).</li>
<li>Shlyakhtenko, L. S., Lushnikov, A. Y., Lyubchenko, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+nucleosomes+revealed+by+time-lapse+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Dynamics of nucleosomes revealed by time-lapse atomic force microscopy.</a> Biochemistry. 48 (33), 7842-7848 (2009).</li>
<li>Lohr, D., Bash, R., Wang, H., Yodh, J., Lindsay, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+atomic+force+microscopy+to+study+chromatin+structure+and+nucleosome+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+%28San+Diego%2C+Calif%29%22%5BJournal%5D)">Using atomic force microscopy to study chromatin structure and nucleosome remodeling.</a> Methods (San Diego, Calif). 41 (3), 333-341 (2007).</li>
<li>Dyer, P. N., Edayathumangalam, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+nucleosome+core+particles+from+recombinant+histones+and+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of nucleosome core particles from recombinant histones and DNA.</a> Methods in Enzymology. 375, 23-44 (2004).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+cloning%3A+a+laboratory+manual%22">Molecular cloning: a laboratory manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2001).</li>
<li>Balbo, A., Zhao, H., Brown, P. H., Schuck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly%2C+loading%2C+and+alignment+of+an+analytical+ultracentrifuge+sample+cell%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Assembly, loading, and alignment of an analytical ultracentrifuge sample cell.</a> J. Vis. Exp. (33), e1530(2009).</li>
<li>Demeler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UltraScan%3A+a+comprehensive+data+analysis+software+package+for+analytical+ultracentrifugation+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Modern+Analytical+Ultracentrifugation%3A+Techniques%22%5BJournal%5D)">UltraScan: a comprehensive data analysis software package for analytical ultracentrifugation experiments.</a> Modern Analytical Ultracentrifugation: Techniques. , 210-230 (2005).</li>
<li>Holde, K. V., Weischet, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Boundary+analysis+of+sedimentation+velocity+experiments+with+monodisperse+and+paucidisperse+solutes%5BTitle%5D)+AND+%22Biopolymers%22%5BJournal%5D)">Boundary analysis of sedimentation velocity experiments with monodisperse and paucidisperse solutes.</a> Biopolymers. 17 (6), 1387-1403 (1978).</li>
<li>Demeler, B., van Holde, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sedimentation+velocity+analysis+of+highly+heterogeneous+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Sedimentation velocity analysis of highly heterogeneous systems.</a> Analytical Biochemistry. 335, 279-288 (2004).</li>
<li>Hansen, J., Lohr, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+and+structural+properties+of+subsaturated+chromatin+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Assembly and structural properties of subsaturated chromatin arrays.</a> Journal of Biological Chemistry. 8, 5840-5848 (1993).</li>
<li>Routh, A., Sandin, S., Rhodes, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleosome+repeat+length+and+linker+histone+stoichiometry+determine+chromatin+fiber+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Nucleosome repeat length and linker histone stoichiometry determine chromatin fiber structure.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 105 (26), 8872-8877 (2008).</li>
<li>Zhou, J., Fan, J. Y., Rangasamy, D., Tremethick, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nucleosome+surface+regulates+chromatin+compaction+and+couples+it+with+transcriptional+repression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The nucleosome surface regulates chromatin compaction and couples it with transcriptional repression.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 14 (11), 1070-1076 (2007).</li>
<li>Dorigo, B., Schalch, T., Kulangara, A., Duda, S., Schroeder, R. R., Richmond, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleosome+arrays+reveal+the+two-start+organization+of+the+chromatin+fiber%5BTitle%5D)+AND+%22Science+%28New+York%2C+N.Y.%29%22%5BJournal%5D)">Nucleosome arrays reveal the two-start organization of the chromatin fiber.</a> Science (New York, N.Y.). 306 (5701), 1571-1573 (2004).</li>
<li>Correll, S. J., Schubert, M. H., Grigoryev, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+Short+nucleosome+repeats+impose+rotational+modulations+on+chromatin+fibre+folding%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">a Short nucleosome repeats impose rotational modulations on chromatin fibre folding.</a> The EMBO Journal. 31 (10), 2416-2426 (2012).</li>
<li>Mcbryant, S. J., Krause, C., Woodcock, C. L., Hansen, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Silent+Information+Regulator+3+Protein+%2C+SIR3p+%2C+Binds+to+Chromatin+Fibers+and+Assembles+a+Hypercondensed+Chromatin+Architecture+in+the+Presence+of+Salt%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">The Silent Information Regulator 3 Protein , SIR3p , Binds to Chromatin Fibers and Assembles a Hypercondensed Chromatin Architecture in the Presence of Salt.</a> Molecular and Cellular Biology. 28 (11), 3563-3572 (2008).</li>
<li>Schalch, T., Duda, S., Sargent, D. F., Richmond, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-ray+structure+of+a+tetranucleosome+and+its+implications+for+the+chromatin+fibre%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">X-ray structure of a tetranucleosome and its implications for the chromatin fibre.</a> Nature. 436 (7047), 138-1341 (2005).</li>
<li>Fan, J. Y., Gordon, F., Luger, K., Hansen, J. C., Tremethick, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+essential+histone+variant+H2A.Z+regulates+the+equilibrium+between+different+chromatin+conformational+states%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">The essential histone variant H2A.Z regulates the equilibrium between different chromatin conformational states.</a> Nature Structural Biology. 9 (3), 172-176 (2002).</li>
<li>Carruthers, L. M., Bednar, J., Woodcock, C. L., Hansen, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linker+histones+stabilize+the+intrinsic+salt-dependent+folding+of+nucleosomal+arrays%3A+mechanistic+ramifications+for+higher-order+chromatin+folding%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Linker histones stabilize the intrinsic salt-dependent folding of nucleosomal arrays: mechanistic ramifications for higher-order chromatin folding.</a> Biochemistry. 37 (42), 14776-14787 (1998).</li>
<li>Huynh, V. A. T., Robinson, P. J. J., Rhodes, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Method+for+the+In+Vitro+Reconstitution+of+a+Defined+%26%2334%3B30+nm%26%2334%3B+Chromatin+Fibre+Containing+Stoichiometric+Amounts+of+the+Linker+Histone%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">A Method for the In Vitro Reconstitution of a Defined &#34;30 nm&#34; Chromatin Fibre Containing Stoichiometric Amounts of the Linker Histone.</a> Journal of Molecular Biology. 345 (5), 957-968 (2005).</li>
<li>Dorigo, B., Schalch, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+fiber+folding%3A+requirement+for+the+histone+H4+N-terminal+tail%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Chromatin fiber folding: requirement for the histone H4 N-terminal tail.</a> J. Mol. Biol. 2836 (03), 85-96 (2003).</li>
<li>Qian, R. L., Liu, Z. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+chromatin+folding+patterns+in+chicken+erythrocytes+by+atomic+force+microscopy+%28AFM%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Visualization of chromatin folding patterns in chicken erythrocytes by atomic force microscopy (AFM.</a> Cell Research. 7 (2), 143-150 (1997).</li>
</ol>

Yazarlar çıkar çatışmaları var.

Model nucleosomal diziler kromatin yapısı ve fonksiyonu in vitro çalışma için çok yararlı bir araçtır. Örneğin, yaygın olarak çözelti 30-34 kromatin fiber yoğuşma mekanizmasını incelemek için kullanılan ve mümkün bir tetranucleosome 35 bir x-ışını yapı elde etmek için yapılmıştır. Daha yakın zamanlarda bu, belirli çekirdek histon varyantları, mutantlan ve posttranslasyonel modifikasyonlar 14-16,36 yapısal etkileri çözmekte yararlı olduğu kanıtlanmıştır. Burada nucleosome konumla...

Ökaryotik genomları gibi çıplak DNA yoktur, ama yerine sıkıştırılmış ve bağlı proteinler tarafından organize edilir. DNA ve protein Bu kompleksler, kromatin olarak bilinir. Kromatinlerin temel tekrarlanan ünite nucleosome olduğunu. Bir nucleosome histon oktamer ve yaklaşık 1,6 kat 1 oktamer histona sarılı DNA 146 baz çiftinden oluşmuştur. Histon oktamer iki kopya çekirdek histon H2A, H2B, H3 ve H4 her oluşmaktadır. Burada tekrar tekrar bir DNA molekülü boyunca aralıklı olan Çekirdek histon octamers nükleozomal dizileri olarak adlandırılır. Nükleozomal dizilerinin yapısı, uzatılmış bir yapı &quot;ipe dizili boncuklar&quot; 10 nm ya da lif olarak adlandırılır ve düşük tuz koşulları altında 2, in vitro olarak mevcut olmuştur. 10 nm fiber içi dizi sıkıştırma ve / veya arası dizi oligomerizasyonu 2 vasıtasıyla daha yüksek düzeyde yapılar içine yoğunlaştırma yeteneğine sahip olduğunu. Bu yüksek sıralanmaları, tuzların mevcudiyetinde indüklenebilirveya nükleozomal dizi 3,4 kromatin mimari proteinlerin bağlanma yoluyla etkilenebilir. Kromatin sıkıştırma düzeyleri ters vivo 5,6 transkripsiyon oranı ile ilişkilidir. Son araştırmalar, farklılaşma, kanser gelişimi ve diğerleri 7,8 gibi süreçlerde Genomların yapısal kuruluşun önemini vurgulamaktadır. Kromatin yapısını ve işlevini incelemek için nucleosomal dizilerin kullanımı yaygın hale gelmiştir. Burada rekombinant çekirdek histon ve nucleosome konumlandırma DNA&#39;dan nucleosomal dizilerin montajı için bir yöntem açıklanmaktadır. Nükleozom konumlandırma dizilerin tandem tekrarı ile rekombinant DNA kullanarak düzenli olarak aralıklı nükleozom içeren dizilerin yeniden oluşturulması için izin verir. Daha popüler konumlandırma dizilerin iki 5S rRNA gen sekansı ve &quot;601&quot; sekans 9,10 bulunmaktadır. 601 dizisi SELEX deneyler ve mor elde edildie güçlü 5S dizisi 11 daha nükleozom konumlandırır. Sonuç olarak, 601 dizilerinin, bağlayıcı DNA uzunluğu daha homojendir. Tandem tekrar nükleozom konumlandırma DNA jel filtrasyonu 4,12 ile elde edilir. Rekombinant E. histonlar saflaştınlır denatüre edici koşullar altında 13 coli. Rekombinant histonların kullanımı bir dikkatle nucleosomal dizilerin histon kompozisyonunu kontrol etmenizi sağlar. Örneğin, çekirdek 15,16 yabani tip çekirdek histon ikame edilebilir spesifik mutasyonlar 14 ya da post-translasyonel modifikasyonlar taşıyan histonlar. Çökeltme hız deneyleri uygulanan santrifüj kuvveti altında 17 çözeltisi içinde makromoleküllerin sedimantasyon hızını izler. Bu, bir numunede makromoleküllerin büyüklüğü ve şekli hakkında bilgi verir. Sedimantasyon hızı deneyleri böylece kromatin lif çözüm durum değişiklikleri incelemek için uygun bir araçtırkromatin yoğunlaşması 18 yapısı nedeniyle. Önemlisi, nucleosomal dizi sulandırma bir kalite kontrol adım olarak sedimantasyon hızı deneyleri kullanmak için ilk gerekli olan. DNA ve nükleozom uygun mol oranında birleştirilir değilseniz, diziler altında veya aşırı doymuş bir çekirdek histon sahip olabilir. Böylece, sedimantasyon hızının deneylerden elde edilen bilgiler, DNA uygun bir şekilde nükleozom ile doymuş olduğunu sağlamak için kullanılır. Bu, daha önce karakterize edilmemiş DNA şablonu ile çalışan, özellikle nükleozom ile DNA&#39;nın doygunluk tahmin etmek için alternatif yöntemler kullanmak önemlidir. Bu nedenle, daha da atomik kuvvet mikroskopisi (AFM) ile nükleozomal dizilerin analizi için bir yöntem tarif eder. AFM sağlayan güçlü bir tekniktir bu doyma seviyesi, histon varyantlarının varlığı etkisi ya da MgCI2 19,20 etkileri gibi parametreler, bir dizi etkilerinin görselleştirilmesi. AFM da başvurunun olmuştured zaman atlamalı görüntüleme 21 kullanılarak nucleosome dinamiklerini incelemek için. In vitro onlar AFM görüntüleme 22 için doğru boyut aralığındaki ait çünkü nucleosomal 12-mer diziler AFM çalışmalara özellikle yatkındır toplandı. Bu çalışmada, bir kalite kontrol gibi (&quot;Görmek inanmaktır&quot;) AUC verileri onaylayan bir aracı olarak nucleosomal dizilerin AFM kullandık. Basit bir görselleştirme ek olarak, AFM ek bir ölçüt olarak numune yüksekliği profilleri ölçülmesini sağlar.

<table><tbody><tr><td>(3-Aminopropil) trietoksisilan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3648-100ML</td><td></td></tr><tr><td>6-8 kDa MWCO Diyaliz Tüpü</td><td>Fisher</td><td>21-152-5</td><td></td></tr><tr><td>HiLoad Superdex 200 16/60 Sütun</td><td>GE</td><td>17-1069-01</td><td></td></tr><tr><td>Vivaspin 50 kDa MWCO Santrifüj Konsantratörü</td><td>Sartorius</td><td>VS2031</td><td></td></tr><tr><td>12-14 kDa MWCO Diyaliz Tüpü</td><td>Fisher</td><td>08-667A</td><td></td></tr><tr><td>Illustra Sephacryl S-1000 Süper İnce</td><td>GE</td><td>17-0476-01</td><td></td></tr><tr><td>XL-A/I Analitik Ultrasantrifüj</td><td>Beckman-Coulter</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

rekombinant çekirdek histon nükleozomal diziler ve nükleozom konumlandırma dna meclisi

Assembly of Nucleosomal Arrays from Recombinant Core Histones and Nucleosome Positioning DNA

Burada tekrar tekrar bir DNA molekülü boyunca aralıklı olan Çekirdek histon octamers nükleozomal dizileri olarak adlandırılır. Nükleozomal diziler iki yoldan birinde elde edilmiştir: in vivo kaynaklardan saflaştırılması, yeniden birleştirici ya da çekirdek histon in vitro olarak yeniden oluşum ve tandem tekrar nükleozom konumlandırma DNA. Bu ikinci yöntem daha bileşim bakımından düzenli montajı ve kesin bir konuma sahip nükleozomal dizisi için izin verme avantajına sahiptir. Bu santrifüj kuvveti altında çözelti içinden geçiş hızını analiz ederek makro moleküllerin büyüklüğü ve şekli ile ilgili analitik ultrasantrifüj verim bilgilerde sedimantasyon hızının deneyleri. Bu teknik, atomik kuvvet mikroskopisi ile birlikte, DNA şablonları çoğunluğu sulandırıldıktan sonra nükleozom doymuş olmasının sağlanması, kalite kontrol için kullanılabilir. Burada uzunluğu miligram miktarları yeniden yapılandırmak için gerekli ve bileşim açısından tarif d protokollerikromatin yapısı ve fonksiyonu biyokimyasal ve biyofiziksel çalışmalar için uygun efined nucleosomal diziler.

Protokolünü göstermek için biz 12 tandem 601 konumlandırma dizisine (601 207 x 12) 207 bp tekrarlarını kapsayan yeniden birleştirici Xenopus çekirdek histon ve DNA dizileri, nükleozomal yeniden. İlk liyofilize çekirdek histon ikinci yerel octamers monte edilmiş ve daha sonra bir S200 sütunu (Şekil 1A) kullanılarak FPLC ile octamers arıtıldı. Daha büyük kompleksler S200 kolonundan önce elüte. Histonlar genellikle bu sırayla Zehir: non-spesifik histon agrega, histon oktamer, H3/H4 tetr...

Bir yöntem olup, yeniden birleştirici çekirdek histon ikinci modeli nükleozomal dizilerin sulandırma ve tandem tekrar nükleozom konumlandırma DNA için sunulmuştur. Biz de analitik ultrasantrifüjdeki sedimantasyon hızı deneyleri, ve atomik kuvvet mikroskobu (AFM) hazırlandıktan sonra nucleosomal dizi doygunluk düzeyini izlemek için nasıl kullanıldığını açıklar.

Rekombinant çekirdek histon nükleozomal Diziler ve Nükleozom Konumlandırma DNA Meclisi

Core histone octamers that are repetitively spaced along a DNA molecule  are called nucleosomal arrays. Nucleosomal arrays are obtained in one of two  ...

Bu deney, eşit sayıda nükleozom ile birlikte tandem olarak tekrarlanan bir dizi nükleozom konumlandırma DNA dizileri içeren nükleozomal diziler oluşturmayı amaçlamaktadır; öncelikle çekirdek histonların denatüre edici tampondan diyaliz yoluyla uzaklaştırılmasıyla histon kompleksleri yeniden katlanır. Ardından, bir boyut dışlama kolonu kullanılarak histon ER ayrıştırılır. Sonrasında, histon ER farklı molar oranlarda kalıp DNA ile birleştirilir ve yüksekten düşüğe tuz konsantrasyonuna doğru kademeli diyaliz ile DNA üzerine nükleozomlar olarak yerleştirilir.Ardından, istenen doygunluk seviyesi için uygun molar oranı belirlemek amacıyla örnekleri sedimentasyon hızıyla test edin. Sonuçlar, nükleozomal dizilerin santrifüj kuvveti altında çözelti içindeki göçlerine veya bir atomik kuvvet mikroskobu ile oluşturulan görüntüye dayanarak doygunluk seviyelerini gösterebilir. Nükleozomal dizilerin tekil nükleozomlara göre temel avantajı, nükleozomların linker DNA ile birbirine bağlı olması ve böylece ek bir yapısal kısıtlama getirmesidir.Bu yöntem kromatin yapısı hakkında bilgiler sağlayabilse de, kromatin şablonları üzerinde in vitro transkripsiyon çalışmaları gibi diğer sistemlere de uygulanabilir. Ryan ve Anna şimdi, nükleozom konumlandırma DNA'sında rekombinant çekirdek histonlarından nükleozomal dizilerin birleştirilmesini gösterecekler. Purifiye edilmiş liyofilize rekombinant çekirdek histon proteinleri H2A, H2B, H3 ve H4 ile başlayın; her birinden yaklaşık beş miligramı üç mililitre açma (unfolding) tamponunda çözün ve oda sıcaklığında, ajitasyonla birlikte en az bir saat inkübe edin.Şimdi, açma tamponunu referans olarak kullanarak her bir histon çözeltisinin 276 nanometredeki absorbansını ölçün. Ardından, sönümleme katsayılarını kullanarak her bir histonun molaritesini hesaplayın. Absorbans ile belirlenen histon konsantrasyonunu liyofilize kuru ağırlıkla karşılaştırın ve proteinin büyük kısmının çözünüp çözünmediğini tahmin edin.Tüm histonlar için sınırlayıcı mol sayısını belirlemek amacıyla, en az mol içeren histon örneğini tespit edin. Ardından histonları eşit molar miktarlarda birleştirin. Histon karışımını, unfolding tamponu ile mililitrede bir miligram nihai konsantrasyona gelecek şekilde seyreltin.Şimdi örneği diyaliz tüpüne aktarın. Tüpü mühürleyin ve iki litre soğuk yeniden katlanma tamponu içerisine yerleştirin. Örneği dört santigrat derecede, karıştırarak 18 saat boyunca diyalize edin.Hızlı ve serbestçe dönebildiğinden emin olunarak diyaliz tüpünün taş çökelmesini önlemesi sağlanır. Diyaliz tamponunu her altı saatte bir değiştirin; bir çökelek oluşsa bile örneği atmayın, verim azalacak olsa da bazı okti geri kazanılabilir. Hava kabarcıklarının sisteme girmediğinden emin olarak S 200 kolonunu bir FPLC sistemine bağlayın.S 200 kolonunu, 0.3 milliliters per minute akış hızı ve 0.5 megapascals karşı basınç limiti kullanarak 0.2 micrometer filtrelenmiş su ile gece boyunca temizleyin; ardından sistemi yaklaşık iki saat boyunca bir litre 0.2 micrometer filtrelenmiş yeniden katlanma tamponu ile dengeleyin. Ayrıca bir santrifüj konsantratörünü bir milliliter yeniden katlanma tamponu ile dengeleyin. Şimdi örneği diyaliz tüpünden çıkarın.Herhangi bir çökelmeyi gidermek için örneği 4 °C'de santrifüjleyin. Örnek süpernatantını pipetle konsantratöre aktarın. Örneği yaklaşık 500 µL hacme gelene kadar konsantre edin.Konsantre edilmiş Optimus örneğini yeni bir kaba aktarın. Konsantratörü bir mililitre Refolding tamponu ile durulayın. Durulama sıvısını 500 microliters hacme kadar konsantre edin ve ER örneğine ekleyin.Numuneyi 1,5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpünde, 4 °C'de 10.000 RPM'de beş dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatantı yeni bir tüpe aktarın. Ardından numuneyi S 200 kolonuna yükleyin.Numuneyi 400 mililitre taze hazırlanmış yeniden katlanma tamponu ile elüe edin ve iki mililitrelik fraksiyonlar toplayın. Elüsyon sırasında 280 nanometredeki absorbansı izleyin. His-tag agregatları genellikle yaklaşık 45 mililitrede, EMR ise yaklaşık 65 mililitrede ve timer elüe olur.Yaklaşık 84 mililitrede. İlgilenilen piklerden elde edilen elüasyon fraksiyonlarını, örnekleri %18 ila %20'lik SDS-PAGE üzerinde çalıştırarak analiz edin. Saflaştırılmış emu içeren fraksiyonlar, dört temel histon proteininin eşit molar miktarlarına sahip olmalıdır.Şimdi saflaştırılmış OCR'leri içeren fraksiyonları birleştirin ve nihai octr konsantrasyonunu belirlemek için santrifüj filtresi ile konsantre edin. 280 nm'deki absorbansı ölçün. Ardından ekstinksiyon katsayısını kullanarak konsantrasyonu hesaplayın.Protokol metninde ayrıntılı olarak belirtildiği üzere, DNA ve saflaştırılmış ER'lerden nukleozomal diziler yeniden oluşturun. Ardından örneği, 260 nanometrede 0,5 absorbansa ulaşacak şekilde seyreltin. Bir tarafında örneğin, diğer tarafında ise referans 10 tamponunun bulunduğu iki sektörlü bir merkez parçasına sahip hücreye 400 microliter örnek yükleyin.Her iki sektördeki sıvı seviyesi birbirine yakın olmalıdır. Referans menisküsünü numune menisküsünden daha yüksek tutun. Hücreleri rotora yerleştirin ve hücreleri uygun şekilde hizalayın.Rotor üzerindeki hücrelerin alt kısmında bulunan işaretleri kullanarak, hücre lenslerini basınçlı hava ile nazikçe tozdan arındırın. X-L-A-X-L-I santrifüjü çalıştırın. Rotoru yerleştirin ve kılavuzda açıklandığı şekilde optikleri takıp sabitleyin.Proteom laboratuvar yazılımını açın ve "yeni dosya" seçeneğini belirleyin. 25 °C sıcaklıkta ve 3000 RPM'de tekli bir tarama çalışması ayarlayın. Her hücre için örneklere isim verin, bir dalga boyu seçin, absorbansı belirleyin ve bilgisayarınızda bir dosya kayıt konumu seçin.Seçenekler altından durdurmayı seçin. Son taramadan sonra radyal kalibrasyonu gerçekleştirin ve tekli tarama işlemini başlatın. Uygun radyal tarama uzunluğunu belirlemek için tekli taramayı kullanın.X-L-A-X-L-I kontrol panelini kullanarak hızı sıfıra getirin ve hazneyi dengelemek için yıldız düğmesine basın. Yazılımı kullanarak istenen hızı ve tarama sayısını ayarlayın.Daha yüksek santrifüj hızları, sedimentasyon katsayısının çözünürlüğünü artırır. Ancak, örneğin tamamı hücrenin dibine çökelmeden önce en az 20 tarama toplanmalıdır. Sistemin düzgün çalıştığından emin olmak için ilk birkaç taramayı izleyin.Çalışmanın ilerleyişini izlemek ve sızdıran hücreler gibi potansiyel sorunları kontrol etmek için son birkaç taramayı üst üste getirin. Sedimentasyon hızı sonuçlarının analizi ve atomik kuvvet mikroskobisi kullanarak dizilerin görselleştirilmesine yönelik bir protokol, protokol metninde ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Bu deneyde.Liyofilize xenopus çekirdek histonları, S 200 kolonunda FPLC ile saflaştırılmış okta-merlerde yeniden yapılandırılmıştır. Spesifik olmayan histon agregat çözeltisini takiben histon okta-merleri, H3, H4 tetramerleri ve H2A-H2B dimerleri elde edilmiştir. Saflaştırılmış okta-mer fraksiyonlarının SDS-PAGE analizi, dört histon proteininin ekimolar miktarlarda olduğunu göstermektedir. Xenopus H2A ve H2B'nin moleküler ağırlıklarının yalnızca yaklaşık 200 dalton fark olduğunu ve bu nedenle SDS jellerinde genellikle tek bir bant olarak göründüklerini unutmayın.64 ile 67 arasındaki fraksiyonlar birleştirildi ve nükleozomal dizi rekonstitüsyonu için saklandı. UC hücre taraması için ölçüm aralığını belirlemek amacıyla, 3000 RPM'de alınan tek bir taramanın proteom laboratuvar yazılımı ekran görüntüsü kullanıldı. Ardından, sedimentasyon katsayılarının dağılımını görüntülemek için kullanılan iki farklı yöntemi temsil eden kırmızı ve yeşil çizgilerden oluşan bir veri seti oluşturmak üzere bir dizi sedimentasyon hızı taraması düzenlendi.UltraScan'de. Kırmızı çizgi, kromatin organizasyonu çalışmasında sedimentasyon katsayılarının integral dağılımını, yeşil çizgi ise türevini göstermektedir. İn vitro atomik kuvvet mikroskobu, rekonstitüsyon sonrası şablon doygunluk derecesini belirlemek için analitik ultrasentrifügasyonu tamamlamaktadır.Burada, görüntülemede kullanılan 27 SRA'nın çoğunluğu 10 ila 11 nükleozom içeriyordu. Bu 500 by 500 nanometrelik tarama, linker.DNA ile birlikte nükleozomal dizileri net bir şekilde göstermektedir. Ayrıca genlik izi, faz izi ve nükleozomların yükseklik profilini belirlemek için nükleozomlar üzerinden serbest el ile çizilmiş bir çizginin bulunduğu aynı yükseklik izi de gösterilmiştir. Uzmanlaşıldığında, bu teknik uygun şekilde yürütüldüğü takdirde üç ila dört gün içinde tamamlanabilir.Bu prosedürü uygularken, reaktiflerinizin konsantrasyonlarını ölçerken çok hassas olmanız gerektiğini hatırlamanız oldukça önemlidir. Bu prosedürün ardından, nükleozomal dizilerin doygunluk seviyelerini atomik kuvvet mikroskobu gibi teknikler kullanarak test edebilirsiniz. Geliştirilmesinin ardından bu teknik, kromatin alanındaki araştırmacıların kromatin yapısını ve kromatin kompaksiyonunu incelemelerinin önünü açmıştır.

assembly-nucleosomal-arrays-from-recombinant-core-histones-nucleosome

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu videoda, nükleozom komplekslerinin dinamiklerini incelemek için yüksek hızlı hızlandırılmış atomik kuvvet mikroskobu, AFM, görüntüleme tekniklerini gösteriyoruz. AFM ucu nükleozomun yüzeyini tararken, nükleozom yüksekliğindeki değişiklikleri tespit eder ve zaman içinde DNA'nın açılmasını kaydeder.

Nükleozom dinamiklerini yakalamak için yüksek hızlı hızlandırılmış atomik kuvvet mikroskobu

Bu protokol farklı şekilde izotop işaretli kardeş histon içeren nükleozom sulandırılması açıklar. Aynı zamanda, asimetrik translasyon sonrası modifiye edilmiş nükleozom bir premodified histon kopya kullandıktan sonra oluşturulabilir. Bu preparatlar kolaylıkla yüksek çözünürlüklü NMR spektroskopisi kullanarak, her iki kız kardeş histonlar üzerinde eş zamanlı olarak, değişiklik çapraz-karışma mekanizmaları incelemek için kullanılabilir.

Farklı Olarak izotopla işaretli Kardeş histonlarla nükleozomlann Sulandırma

Burada, nucleosome parçacıklar, statik ve hızlandırılmış atomik kuvvet mikroskobu (AFM) görüntüleme teknikleri kullanılarak tek molekül düzeyinde karakterize etmek için bir iletişim kuralı mevcut. Yakalama yapısı ve dinamik oluşturarlar içinde olan yüzey functionalization yöntemi sağlar nano, yüksek çözünürlüklü.

Atomik kuvvet mikroskobu Imaging'i kullanma oluşturarlar dinamikleri ve yapısını sondalama

Burada, genetik kod genişlemesini kullanarak asetillenmiş histone proteinlerini ifade etmek ve yeniden inşa edilmiş nükleozomları in vitro olarak birleştirmek için bir yöntem sunuyoruz.

Escherichia coli'de Genetik Kod Genişlemesi Kullanılarak Nükleozom Rekonses için Histonların Siteye Özgü Lizin Asetilasyonu

Bu protokol, TEM ızgaralarının dondurulması için iki numune hazırlama yöntemi kullanılarak nükleozomal komplekslerin hazırlanmasını ayrıntılı olarak özetlemektedir.

Kriyo-Elektron Mikroskobu Yapısal Tayini için DNA Onarım Faktörleri ile Komplekslenmiş Nükleozom Çekirdek Parçacıklarının Hazırlanması

Bu makale, tek moleküllü korelasyon kuvveti ve floresan mikroskobu için nükleozom içeren DNA bağlarının yeniden yapılandırılması için ayrıntılı bir deneysel prosedür sunmaktadır. Ayrıca, kromatin ile etkileşime giren proteinlerin bağlanma davranışını görselleştirmek ve nükleozomların fiziksel özelliklerindeki değişiklikleri analiz etmek için yapılabilecek birkaç aşağı akış deneyini açıklar.

Tek moleküllü korelasyon kuvveti ve floresan mikroskobu için yerinde nükleozom düzeneği

Kişinin kaş yapılan özel bir diseksiyon aracı - Bu video kaş bıçak kullanımı da dahil olmak üzere Xenopus laevis embriyolar, ajanda ve hayvan kutup eksplantlar hazırlanması için kullanılan tekniği göstermektedir. Yapışma tahlil montaj için protokol de önemli adezyon moleküllerinin varlığı için problar yüzey düzenleyen veya uygun şekilde gelişimi için kritik olan hayvan kutup hücreleri mevcut verilir.

Organizatör ve Hayvan Kutbu eksplantlar Xenopus laevis Embriyolar ve Hücre Yapışma Testi Meclisi diseksiyonu

Fare Tails Genomik DNA izolasyonu

Biz gelecekteki nükleik asit temelli tedaviler için daha iyi kontrol ve sentez üniforma ve özelleştirilebilir polyplexes sağlaması bekleniyor polielektrolit polyplexes oluşumunu araştırmak için yeni ve güçlü bir entegrasyon sahipliği yapacaktır (QD-FRET) ve Mikroakiskan sunuyoruz.

Birleştiren QD FRET Mikroakiskan Real-Time DNA Nanocomplex Self-Meclis Monitör

Analitik ultrasantrifüjdeki (EAA) örnek hücre örnek ve referans tampon ve deneyler sırasında tutar ve yüksek vakum ve 60.000 rpm rotor hızlarına maruz kalmaktadır. Bu video EAA bir deney bu çok önemli bir bileşeni montaj, yükleme ve uyum için gerekli ayrıntısına kadar titiz bir dikkat gösterecektir.

Kurul, Yükleme ve Analitik ultrasantrifüjdeki Örnek Hücre Hizalama

Öğrenin rekombinant çekirdek histonlar ve nükleozom konumlandırma DNA kullanarak nükleozomal dizi montajı. Bu biyokimya yöntemi kromatin yapısı ve gen düzenlemesi araştırmalarında temel bilgiler sağlar.

Rekombinant çekirdek histon nükleozomal Diziler ve Nükleozom Konumlandırma DNA Meclisi

Daha fazla video keşfet