Ortak Liquid Handling Robotlar TruTip Teknoloji kullanarak Klinik Örneklerden DNA ve RNA yüksek verimlilik, Otomatik Ekstraksiyon

Aşağıdaki deneyin genel amacı, Hamilton Star sıvı işleme istasyonu ve true tip ekstraksiyon teknolojisini kullanarak tam kandan insan genomik DNA'sı izole etmektir. Bunu başarmak için, kan örneği lizis tamponu, proteinaz K ve etanolden oluşan çözelti içindeki hücreler, true tip'ler aracılığıyla defalarca aspire edilir ve dağıtılır; böylece DNA, true tip matriksine bağlanır. Ardından, bağlı nükleik asitlerden kalıntı proteinleri, lizis tamponunu ve diğer kontaminantları uzaklaştırmak için true tip'lerden iki ayrı yıkama tamponu geçirilir.

Üçüncü adımda, gerçek uç ucun (true tip) bağlama matrisi, son adımda kalan yıkama tamponunu buharlaştırmak için havayı defalarca aspire edip dağıtarak kurutulur; ardından DNA'yı matristen ayırmak için bağlama matrisi üzerinden ileri geri illüzyon tamponu akıtılır. True tip teknolojisi kullanılarak, kontaminasyondan arındırılmış yüksek moleküler ağırlıklı genomik DNA ekstrakte edilir ve bu işlem UV-vis absorbansı, jel elektroforezi ve kantitatif PCR veya sekanslama ile doğrulanabilir. True tip'in, spin kolonlara veya manyetik partiküllere dayalı diğer numune hazırlama yöntemlerine göre avantajı, Tru Tip'in kolayca otomatikleştirilebilir olmasıdır.

Santrifüjler ve manyetik çubuklar içeren maliyetli sistemler gerektirmez ve basit iş akışı değerli platform alanından tasarruf sağlar. Bugün tam kana odaklanacak olsak da Tru Tip; diğer genomik DNA örnek uygulamalarının yanı sıra, birkaç örnek vermek gerekirse, klinik sürüntü örneklerinden viral RNA elde edilmesine veya plazmadan hücre dışı DNA izolasyonuna da uygulanabilir. Prosedürü, Hamilton Sıvı İşleme İstasyonu üzerindeki Truet tip ekstraksiyon prosedürünün geliştirilmesinde önemli rol oynayan laboratuvarımızdan otomasyon mühendisi Dane Brady tanıtacak.

Bu protokolde, bir Hamilton Star sıvı taşıma robotu, tam kanın 96 kuyucuğundan eş zamanlı olarak DNA ekstraksiyonu gerçekleştirir. Hamilton Star, güverte üzerinde opsiyonel bir ısıtıcılı çalkalayıcı üniteye sahiptir; bu ünite, tam kan gibi belirli klinik matrislerin enzimatik sindirimi için önemlidir. Sistemin 96 kanallı bir pipet başlığı ile donatılabilmesi nedeniyle, gerçek uç adımlarının ve reaktiflerin her biri için özel bir 96 kuyucuklu plaka bulunur.

Öncelikle Hamilton Star robotuna bağlı ekipmanları ve bilgisayarı açın. Yazılım üzerinden Hamilton Run Control yazılımını başlatın. ACON tarafından 96 örnek için sağlanan çalışma dosyasını açın.

Şimdi diyagramı takip ederek star deck düzenini kurun. Bir ile işaretlenmiş tüm konumlara 1 mL filtreli uçlar yerleştirin; iki numaralı konuma filtreiz 1 mL uçlar yerleştirin; üç numaralı konuma bir adet Conni Hamilton 1 mL LPT 2 mm true tip yerleştirin. Gerekli laboratuvar malzemeleriyle 5'ten 12'ye kadar olan geri kalan konumları doldurmak için tabloyu referans almaya devam edin, ancak örnekleri henüz yüklemeyin.

Şimdi 75 mililitre lizis ve bağlama tamponu reaktiflerini dağıtın. F, beş numaralı oluk konumuna yüklenmelidir. Alternatif olarak, kurulumu hızlandırmak ve platform düzenini basitleştirmek için tamponlarla önceden doldurulmuş plakalar da kullanılabilir.

Robotun yüklemesine uygun şekilde devam edin. Son olarak, kan tüplerinin kapaklarını çıkarın ve tüpleri numune taşıyıcı raflara veya güverte pozisyon dörde yerleştirin. Birinci numuneyi en soldaki taşıyıcının arka kısmına yerleştirin ve her bir taşıyıcı boyunca sırayla ilerleyerek 96. numuneyi ön sağ pozisyonda olacak şekilde yerleştirin.

Tüm örnekler yüklendikten sonra, oda sıcaklığına dengelenmeleri için bekleyin. Protokol tamamen otomatik olduğu için operatör hatası olasılığı oldukça düşüktür. Örneklerin rafa doğru sırayla yerleştirilmesi gerekir, ancak uygun örnek takibini sağlamak için barkodlama uygulanabilir.

Otomatik bir betiği başlatmak için, çalıştırma dosyası penceresinin sol üst köşesindeki oynat düğmesini seçin ve işlenen örnek sayısını girin. Betik tarafından yürütülen ilk adım, ısıtıcı çalkalayıcı modülündeki 14 numaralı pozisyonda bulunan inkübasyon plakasına 80 µL proteinaz K transfer etmektir. Ardından betik, sekiz kanallı kolu kullanarak inkübasyon plakasının her bir örnek kuyucuğuna 200 µL örnek dağıtır.

Ardından, 96 kanallı kol kullanılarak inkübasyon plakasının her bir kuyucuğuna 600 µL lizis tamponu F dağıtılır. Daha sonra betik, çözeltiyi 10 döngü boyunca karıştırır ve derin kuyucuklu plakada 70 °C sıcaklıkta ve 500 RPM'de 20 dakika boyunca inkübe eder; sıcaklık, proteinaz K aktivite aralığında olan 60 °C'dir. Numuneler inkübe olurken sıvı taşıma sistemi, dökme reaktif teknelerindeki ekstraksiyon ve elüsyon reaktiflerini karşılık gelen 96 kuyucuklu plakalara dağıtarak çalışmaya devam eder ve derin kuyucuklu plakanın her bir kuyucuğuna 100 µL Elucian tamponu A eklenir.

13. pozisyonda, derin kuyucuklu plakanın her bir kuyucuğuna 800 microliters etanol eklenir. 10. pozisyonda, 12. pozisyondaki derin kuyucuklu plakanın her bir kuyucuğuna 1.6 milliliters yıkama tamponu K; 11. pozisyondaki derin kuyucuklu plakanın her bir kuyucuğuna ise 1.6 milliliters yıkama tamponu J eklenir. 20 dakikalık inkübasyonun ardından, örnek karışımı inkübasyon plakasından 10. pozisyonda bulunan etanol içerikli derin kuyucuklu plakaya aktarılır ve burada 12 pipetleme döngüsü ile karıştırılır.

Süreç boyunca, reaktif uçları gerektiği şekilde atık haznesine atılır. Program, önce güverte pozisyon üçten 96 adet gerçek uç yükleyerek lizis işleminden DNA ekstraksiyonuna geçer. Bir sonraki adım, nükleik asitlerin gerçek uç monolitine bağlanmasını sağlamak için pozisyon 10'daki örneklerin 10 döngü boyunca aspire edilmesi ve dağıtılmasıdır.

Ardından, gerçek uçlar 11. konuma geçer ve burada kalıntı lizis, tampon ve örnek matrisini uzaklaştırmak için Yıkama Tamponu J monolit üzerinden beş kez dolaştırılır. Daha sonra gerçek uçlar, bağlı nükleik asitlerden proteinleri ve diğer kontaminantları uzaklaştırmak için Yıkama Tamponu K'nın beş kez dolaştırıldığı 12. konuma geçer. Son olarak gerçek uçlar, yıkama plakasının üzerinde yüksek hızda 80 kez döngü yaparak havada kurutulur.

Şimdi, gerçek uçlar 13. pozisyona geçer ve elüsyon tamponu DNA'yı derin kuyucuklu plakaya salmak için beş kez iki döngü boyunca içlerinden geçer. Gerçek uçlar şimdi atık kutusuna atılır. Böylece program tamamlanmış olur.

Elüsyon plağını cihazdan çıkarın ve ekstrakte edilen örnekleri saklama veya sonraki uygulamalar için uygun tüplere aktarın. Program, final örneklerini sadece bir saat içinde seçilen istenen tüpe veya plağa otomatik olarak aktaracak şekilde de özelleştirilebilir. Otomatik sistem, robotu kullanarak 96 kan örneğinden genomik DNA ekstrakte etmiştir.

45 pozitif kan örneğinin absorbans profilleri, 45 reaktif kör örneği ile eş zamanlı olarak işlenmiştir. Ortalama 260/280 absorbans oranı 1,96 ve ortalama 260/230 oranı 1,93 olarak belirlenmiş olup, bu değerler %1'lik agaroz jel üzerindeki örneklerin saf olduğunu göstermektedir. Rastgele seçilen örnekler, minimum fragmantasyon ile yüksek moleküler ağırlıkta seyretmiştir.

Ortalama verim, 200 µL tam kan başına yaklaşık beş µg DNA olmuştur. Otomatik true tip protokolü optimize edilirken, kuyucuklar arasında çapraz kontaminasyon olmadığından emin olmak için özel bir özen gösterilir. Gerçek zamanlı PCR, burada gösterildiği gibi pozitifler ve negatifler arasında temiz bir ayrım olduğunu göstermektedir.

RNA ekstraksiyonları için, 96 örneğin tamamının ekstraksiyonu, minimum manuel işlem süresiyle bir saatten kısa sürede tamamlanabilir. Bu videoyu izledikten sonra, Hamilton Star Sıvı Taşıma İş İstasyonu üzerindeki TRU Technology Otomasyonu kullanılarak tam kandan insan genomik DNA'sının nasıl izole edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.