Endophytes olarak Mantar Entomopatojenlerin Kurulması: Endofitik Biyolojik Kontrol Doğru

Hi.My adı Ush Parsa ve ben Uluslararası Tropikal Tarım Merkezi'nde SEA'da bir entomologum. Ben ViiV Artiz, aynı zamanda Uluslararası Tropikal Tarım Merkezi'ndenim ve ben Amerika Birleşik Devletleri Tarım Bakanlığı'ndan Fernando Vega. Bu videonun genel amacı, bir mantarın patojen haline gelmesinin nasıl kolaylaştırılacağını ve doğrulanacağını göstermektir.

Bir endofit olarak, doğada patojenik bir mantarla enfekte olmuş bir böcek veya akar bulmak yaygındır ve bu mantar ando patojenlerini biyolojik pestisit olarak kullanmanın uzun bir geçmişi vardır. Daha yakın zamanlarda, mantar ando patojenlerinin zaman zaman bitkileri enfekte ettiği bulunmuştur, ancak varlıklarına dair herhangi bir belirgin belirti üretmeden. Bu keşif, tarımsal zararlılara karşı koruyucu endofitler olarak potansiyel kullanımlarına işaret ediyor.

Bu potansiyeli keşfetmek için, öncelikle bir hedef üründe bir mantar patojenini bir endofit olarak güvenilir bir şekilde oluşturan bir aşılama yöntemi geliştirmek esastır. B Bassiana, en iyi çalışılmış mantar patojenlerinden biridir ve bir pestisit tarafından ticari olarak kolayca temin edilebilir. Bu mantar, muz, kahve ve topuz dahil olmak üzere birçok bitki türünde bir endofit olarak tespit edilmiştir.

B bassiana'da öne sürülen son kanıtlar, bitkileri sadece eklembacaklı zararlılardan değil, aynı zamanda bazı bitki patojenlerinden de koruma potansiyeline sahiptir. Bu geniş spektrumlu korumayı açıklayan mekanizmalar tam olarak anlaşılamamıştır. Hala tik valf alanında, bir zararlıya veya patojene karşı genetik direnci olmayan mahsuller için umut vaat edebilir, ancak tipik olarak birden fazla düşmanın eşzamanlı saldırısından muzdarip mahsuller için, ortak olan fas vulgaris en iyi örnektir.

400'den fazla haşere ve 200 patojenden etkilenebilir ve bunların saldırısının bölgeler arasında en sınırlayıcı fasulye üretim faktörü olduğu düşünülmektedir. Bu nedenle, Endo bbar'ın korunan potansiyelini incelemek için ortak olanın iyi bir aday ürün olabileceğini düşünüyoruz. Bu yöndeki ilk adım olarak Arvid, Bana'yı bir endofit olarak kurmak için aşılama yöntemleri olarak yaprak spreylerinin ve toprak ıslatmalarının etkinliğini göstermektedir.

Yaygın fasulyede, TOMA adı verilen fasulyeden elde edilen tohumlar, %0.5 sodyum hipoklorit içine iki dakika daldırılarak yüzey sterilize edilir, ardından %70 etanole iki dakika daldırılır ve teorik başarı için steril damıtılmış suda üç durulama yapılır. Durulama suyunun yüz mikrolitrelik bir numunesi, PDA ortamı ile 100 milimetrelik bir Petri plakasına kaplanır ve karanlıkta 25 santigrat derecede 10 gün boyunca inkübe edilir. Bu kontrollerde büyüme görülürse deney iptal edilmeli ve yeniden başlatılmalıdır.

Tohumlar, 11,5 santimetre genişliğinde, ikiye bir oranında buharla sterilize edilmiş toprak ve kum karışımı içeren saksılarda üçlü gruplar halinde dikilir. Bitkiler, çimlenmeden sonra haftada 9.200 lux ışık yoğunluğu ile 25 santigrat derece,% 50 bağıl nem ve 12 saatlik bir fotoğraf periyodunda kontrollü koşullar altında yetiştirilir. Bitkiler, canlılığı sağlamak ve rekabeti ortadan kaldırmak için saksı başına bir taneye kadar incedir.

Her iki ila üç günde bir gerektiği gibi sulanırlar ve ekimden 10 ila 20 gün sonra litre başına altı bin su NPK gübre çözeltisi ile gübrelenirler. Mantarlarımızın genetik homojenliğini sağlamak için, izolatlar tek Kanada kültürlerinden yetiştirilmelidir. Mantarın kaynağı mikozlu bir böcek ise, numuneyi laminer akış başlığına alıyoruz ve küçük bir DYS sporlu mantar örneğini PDA ortamına aktarmak için bir aşılama halkası kullanıyoruz.

Hedef mantar büyüyüp temiz bir kültüre girdiğinde kirleticileri uzaklaştırmak için yeni ortam plakalarına müteakip transferler gerekli olabilir. Triton X 100 ve girdaplı tritton Exus'un %0.1'lik bir su çözeltisinin bir mililitresinde süspanse edilen küçük edia numunesi, su yüzey gerilimini azaltan ve kedia'nın dağılmasına izin veren yüzey aktif maddedir. Bu süspansiyonun 100 mikrolitrelik bir alikotu, kedia'nın stereoskoplarında görselleştirilmesine izin verecek olan% 2.5 asil dönümlük ince bir tabaka içeren 100 milimetrelik bir Petri plakasına yayılır.

Plaka, karanlıkta 24 saat boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir, daha sonra tek bir çimlenme kalemi ortamı PDA ile medya plakasına aktarılır ve tüm medya plakasını kaplayana kadar üç ila dört hafta büyümesine izin verilir. Bu yöntem, sonraki deneyler için saf bir mantar kültürü sağlar. Bu gösteri için, ticari ürün Microt'tan elde edilen bir GH HA türü olan saf bir Bavaria Bassiana kültürü kullanıyoruz.

Aşı steril koşullar altında hazırlanır. Laminer akış başlığında, ortamın yüzeyinden yaklaşık bir gram mantar büyümesini kazımak için steril bir spatula kullanıyoruz ve 10 mililitre steril% 0.1 Triton X içinde süspanse ediyoruz. Bu adım, aşılar için mililitre başına 10 ila sekiz kedia'lık bir nihai konsantrasyona ayarlanması gereken sıkışmış bir süspansiyon verir.

İlk olarak, stokun konsantrasyonu, kedia saymayı kolaylaştıran bir seri seyreltmede tahmin edilir. Bir Hema Sitometrede, stokun 100 mikrolitresi 900 mikrolitre% 0.1 Triton X ve girdapta seyreltilir ve 10'da bir seyreltme ile sonuçlanır. Prosedür, 10.000'de bir seyreltme elde etmek için üç kez daha seri olarak tekrarlanır.

Kedia, ilk seyreltmede son derece yüksek sayılarda ve son seyreltmede kolayca sayılabilecek kadar düşük sayılarda bulunacaktır. Hema sitometresinin iki odasının her biri, 10.000'de bir seyreltmenin 10 mikrolitresi ile yüklenir ve kedia'yı saymak için mikroskop altına yerleştirilir. Hema Sitometresinin yönetilen alanı, her biri 100 nanolitre veya buna göre 0.0001 mililitre tutan dokuz büyük kareden oluşur.

Numunedeki ED konsantrasyonunu tahmin etmek için, her odanın dört büyük köşe karesindeki ED'yi sayar ve ortalamasını alırız ve bu ortalamayı 0.0001'e böleriz. Bu konsantrasyonu seyreltme faktörümüz 10.000 ile çarpmak, bir stokun ayarlanması gereken nihai hacmi hesaplamak için şimdi stokun konsantrasyonunu verir. Mililitre inokülum başına 10 38 edia elde etmek için formülü uyguluyoruz.

Nihai hacim, stok hacmi çarpı nihai konsantrasyon üzerindeki stok konsantrasyonuna eşittir. Gösterimizde, istediğimiz konsantrasyonu elde etmek için stokun 195,5 mililitrelik nihai hacme ayarlanması gerekiyor. İnsürumu kullanmadan önce, kanal canlılığını değerlendiren bir çimlenme testi yapmak önemlidir.

Bu test için, 10.000'de bir seyreltmenin 100 mikrolitresini% 2.5 asil yumurta veya besiyeri ile 100 milimetrelik bir Petri plakasına yerleştiriyoruz. Numune, steril bir cam çubukla orta yüzeye yayılır ve karanlıkta 25 santigrat derecede 24 saat inkübe edilir. Mikroskop altında değerlendirilen canlılık, büyüyen germ tüpü ile kedia yüzdesi tahmin edilerek değerlendirildi.

100 Kanadalıdan oluşan üç rastgele numune için, Kanada süspansiyonu yalnızca ortalama çimlenme %90'ın üzerindeyse aşılamalar için kullanılabilirBu gösteride, ortalama %97'lik bir çimlenme buluyoruz, her ikisi de bitkiler ilk gerçek yaprak aşamasına ulaştığında uygulanan yaprak spreyleri ve toprak ıslatmaları. Dikimden yaklaşık 14 gün sonra, yaprak püskürtme yöntemi, cial süspansiyonu doymaya kadar yaprakların al veya üst yüzeyine yönlendiren manuel bir atomizer ile gerçekleştirilir. Her bir saksının üstü, toprağa konal akışını önlemek için alüminyum folyo ile kaplanmıştır İlaçlamadan sonra, mantar istilasını kolaylaştıran yüksek nem seviyelerini korumak için her bitki 24 saat boyunca plastik bir torba ile kaplanır.

Toprak ıslatma aşılama yöntemi, toprak su kapasitesinde gerçekleştirilir. Bitkileri toprak doygunluğuna kadar suladıktan yaklaşık 24 saat sonra, toprağın yüzeyine 10 mililitre bir cial süspansiyon uygulanır. Kontrol edilen bitkinin tabanında, karşılık gelen işlemlerde olduğu gibi uygulanan% 0.1'lik steril bir Tritton X alır.

Bitkiler büyüme odalarına geri gönderilir ve tedavi başına üç kopya ile randomize tam blok tasarımında düzenlenir. Aşılamalardan iki hafta sonra kuruluşu her seferinde bir blok olarak değerlendirdik. Bitkiler özenle hasat edilir ve her bitkiden akan musluk suyunda ayrı ayrı yıkanır.

Bitkinin ilk gerçek yaprağından rastgele seçilen iki yaprakçık, iki parça kök ve iki parça kök yaprakçık örnekliyoruz ve kare gövdeye budanıyor. Yaklaşık üç santimetre uzunluğundaki numuneler bitkinin ortasından ve toprak yüzeyine yakın yerlerden elde edilir. Benzer uzunlukta musluk kökü örnekleri, kökün ortasından ve kök ucunun bir santimetre gerisinden elde edilir.

Her numune, iki dakika boyunca% 0.5 sodyum hipoklorit içinde steril bir başlıkta ayrı ayrı yüzey sterilize edilir, ardından iki dakika boyunca% 70 etanol uygulanır ve kurumaya bırakmadan önce steril damıtılmış su ile üç kez durulanır. Steril havlu kağıdında, sterilize edilmiş numune daha sonra dezenfektan karıncalarla temas nedeniyle endofitlerin elimine edilmiş olabileceği dış kenarını atmak için dikkatlice incelenir. Kırpma numunesi daha sonra yapraklar için ortalama altı ila altı milimetre ve gövdeler ve kökler için altı milimetre uzunluğunda daha küçük bölümler halinde kesilir.

Bölümler, her biri litre başına iki miligram olan streptomisin ve penisilin gibi antibiyotikler tetrasiklin ile desteklenmiş PDA içeren 60 milimetrelik Petri plakaları üzerine kaplanmıştır. Son olarak, plakalar parafin ile kapatılır ve karanlıkta 25 santigrat derecede inkübe edilir. Durulama suyu, her blok işlendikten sonra değiştirilir, ancak 100 mikrolitrelik bir numune, 100 milimetrelik bir Petri plakası, PDA ortamı üzerine kaplanmadan ve serileştirmenin başarılı olup olmadığını belirlemek için 25 santigrat derecede 10 gün boyunca inkübe edilmeden önce değiştirilir.

Bu kontrolde herhangi bir büyüme görülürse, blok atılır ve analiz için dikkate alınmaz. Plakalar, mantar büyümesini gözlemlemek ve kaydetmek için 20 gün boyunca her iki ila üç günde bir kontrol edilir. Kolonize bitki bölümleri eksize edilir ve komşu bölümlerin kirlenmesini önlemek için ayrı ayrı yeni ortam plakalarına aktarılır.

B bassiana büyümesi, karakteristik beyaz yoğun miselin kenarda kremden soluk sarıya dönüşmesine dayalı olarak kaydedilir. Şüpheye düşüldüğünde, numune mikroskop ışığında bir damla suya monte edilir ve aynı gün kolonizasyonun değerlendirildiği gün türün küresel scania ve zikzak şekli kedia kuvveti açısından incelenir. Ayrıca işlemlerimizin bitki büyümesi üzerindeki etkisini de tahmin ediyoruz.

Öncelikle bitkinin tabanından büyüme noktasının tepesine kadar bitki boyunu ölçüyoruz. Daha sonra bitkileri dikkatlice söküp musluk suyunda yıkıyoruz ve kuru ağırlıklarını ölçmek için üç gün boyunca 45 santigrat derecede kurumaya bırakıyoruz. Bu gösteri için, temsili sonuçlar elde etmek için tam deneyi iki kez gerçekleştirdik.

Her iki aşılama yöntemi de arıtılmış bitkilerin %80'inden fazlasında Bana tarafından fizikselleştirme ile sonuçlandı. Bununla birlikte, kolonizasyonun derecesi, değerlendirilen bitki kısmına ve kullanılan aşılama yöntemine bağlıdır. Müşteri adayları en iyi yanıtı verdi.

Sprey aşılama kökleri ise sadece sırılsıklam aşılara cevap verdi. Son olarak, saplar her iki aşılama yöntemine de benzer şekilde yanıt verdi. Bana, değerlendirilen bitki bölümlerinin %15'inden gruplandırılan Bana dışındaki tedavi endofitlerinden bağımsız olarak kontrol edilen bitki bölümlerinin hiçbirinde tespit edilmedi, ancak komşu bölümleri istila etmeden ve sonuçlarımızı etkilemeden önce ortam plakalarından diseke edildi.

Tedavi ve kontrol tesisleri, aşılamadan iki hafta sonra gözle görülür şekilde ayırt edilemez hale geldi ve kuru ağırlıklarında ve boylarında önemli bir fark tespit edilmedi. Birçok faktör, bir deneyin belirli bir sonucunu, endo patojeni bir son etki olarak belirlemek için etkileyebilir. Bu videonun gösterdiği gibi, aşılama yöntemi bunlardan biridir deney yapılacak biyolojik faktörler arasında seçilen mahsul türleri veya çeşitler bulunur ve OMA patojen türlerinin seçimi veya manipüle etmeyi düşünmek için diğer faktörleri izole etmek arasında aşılamanın konsantrasyonu, aşılama sırasında bitkinin yaşı ve bitkinin büyüme koşulları yer alır.

Bu deneyler için nihai hedef, INE veya hastalığa karşı dayanıklı sistemik direnç sağlayan etkili bir tedavi geliştirmek olmalıdır. Endof dövüş aracılı direnci test etmeye hazır olduğunuzda, Journal of Visualized Experiments'da da yayınlanan Bitkisel Direnç Mekanizmalarını karakterize eden bir video izlemenizi öneririz. Lütfen, endofitlerin bitkilerde çok yaygın olduğunu ve bir endo savaşı olarak patojene hedef bir mantarı kalıcı olarak oluşturma ve tespit etme yeteneğinizi etkileme ihtimalinin yüksek olduğunu unutmayın.

Umarız bu gösterimi faydalı bulmuşuzdur. Deneylerinizde iyi şanslar.