Fonksiyonel Motifler ve Bağlama Ortaklar peptid bazlı Kimlik

Bu video, fonksiyonel HIV bir NPH protein motiflerini tanımlamak ve peptit bazlı inhibitörler geliştirmek için kullanılan dört deneyden oluşan bir set sunmaktadır. Tam uzunluktaki proteinlerde bulunan motiflerden türetilen spesifik kısa peptitler, hem biyolojik işlevlerini korur hem de apoptotik motifleri tanımlamak için tam uzunluktaki proteinin işlevini rekabetçi bir şekilde inhibe eder. HIV'de, bir NEF kedi hücresi NEF tarama peptitlerine maruz bırakılır ve apoptozu indükleyen peptitleri tanımlamak için bir tünel apoptotik test yapılır.

Bir NEF salgılama motifi üzerinde varyasyonlar içeren ikinci bir peptit seti. Sekresyon modifikasyon bölgesi veya SMR, nph sekresyonunun azalması ile gösterilen rekabetçi inhibisyona bağlı NPH GFP fonksiyon kaybı ile birlikte hücrelere transfekte edilir. GFP, nef'in sekresyon modifikasyon bölgesi veya SMR'si ile etkileşime giren hücresel faktörleri tanımlamak için florometri ile değerlendirilir.

Ülke yağışları, yem olarak SMR vahşi tip NPH kullanılarak gerçekleştirilir. Son olarak, bu etkileşimlerin sekresyona etki edip etmediğini test etmek için, tanımlanmış bağlanma ortaklarına karşı antikorlar hücrelere transfekte edilir. NF motif sekresyonunu antagonize edip etmediklerini değerlendirmek için, elde edilen sonuçlar NEF'te iki fonksiyonel apoptotik motif ve fonksiyonel bir NEF sekresyon motifini ve ayrıca sekresyon için gerekli hücresel bağlanma ortaklarını antagonize eden bir inhibitör peptit tanımlar.

Bu dört deney setinin genel amacı, hedef proteinlerdeki fonksiyonel motiflerin tanımlanmasını hızlandırmak ve daha sonra bu verileri bu fonksiyonel motiflerin peptit baz inhibitörlerini geliştirmek için kullanmaktır. Bu protokoller seti, neph güdümlü sekresyonun patogenezdeki rolünü anlamak ve neff'in ekzozomal kaçakçılık yolunu manipüle etme yeteneğinin altında yatan mekanizmaları deşifre etmek gibi HIV patogenezi ile ilgili temel soruları yanıtlamamıza yardımcı olması açısından grubumuz için yararlı olmuştur. Bugün prosedürleri gösteren, laboratuvarımda araştırma eğitmeni olan Dr.Ming Bo Huang olacak.

Bu prosedüre, bu deney için ilgilenilen bölgeyi tarayan bir dizi peptit ile başlayın. Tüm HIV bir NPH proteinini kapsayan 10 amino asit örtüşmesine sahip 20 mer peptit, AIDS reaktif programından elde edildi. NPH apoptotik motiflerini tanımlamak için, NEF tarama peptitlerini aşağıdaki gibi ayrı ayrı kullanarak bir apoptoz testi yapın, 35 milimetrelik şapka plakası başına mililitre peptit başına 10 nanogram içeren bir mililitre kültür ortamı ekleyin, hücre kültürleri ve kültürleri 37 santigrat derecede 24 saat inkübe edin.

İnkübasyonun ardından, apoptozu değerlendirmek için bir terminal deoksi nükleotid transferaz aracılı DUTP, biyotin nick ve etiketleme veya tünel testi yapın. Bunu yapmak için önce hücreleri PBS ile yıkayın, daha sonra PBS'yi aspire edin ve PBS'ye %4 Paraform aldehit ekleyin, hücreleri sabitlemek için oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin, hücreleri sabitledikten sonra PBS ile yıkayın ve Triton X 100 ekleyin, oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. Hücreler sabitlendikten ve geçirgen hale getirildikten sonra, tünel reaktifi ekleyin ve geçirgenliği takiben hücreleri 37 santigrat derecede bir saat inkübe edin.

Hücreleri PBS ile iki kez durulayın. Daha sonra bilgisayar kontrollü bir mikroskopi sisteminde epi floresan ile lekeli hücrelerin yüzdesini belirleyin. Ekteki belgede tarif edildiği gibi savaş arabası protein dağıtım reaktif kiti kullanılarak jca hücrelerini NPH, GFP plazmidi ve SMR peptidinin farklı varyasyonları ile kestikten sonra, floresan mikroskobu ile transfeksiyon verimliliğini belirlemek için ortamı hasat edin.

Floresan ve parlak alan görüntüleri yakalayın ve hücrelerin yüzdesini belirleyin. Daha sonra NPH GFP sekresyonunun inhibisyonunu değerlendirmek için transfekte edildi, hücre içermeyen şartlandırılmış ortamın 100 mikrolitresini 96 kuyulu siyah mikrotitre plakasının ayrı kuyucuklarına aktarın. Ortamdaki GFP floresansını bağıl floresan birimlerinde ölçmek için uyarma dalga boyu 485 nanometre ve emisyon dalga boyu 515 nanometre olan bir florimetre kullanın.

Okuma tamamlandıktan sonra verileri bir bilgisayara aktarın. Kontrol ortamındaki GFP floresan seviyesini %100 olarak ayarlayınArdından, NPH GFP sekresyonundaki değişiklikleri belirlemek için bunu, çeşitli SMR peptitleri ile birlikte transfekte edilen hücrelerden alınan ortamdaki GFP floresan seviyesiyle karşılaştırın. Motif bağlama ortaklarını izole etmek için ortak IP zor bir adımdır.

İnkübasyonlar sırasında boncukların uygun şekilde çalkalandığından ve her yıkama Adımı sırasında boncuklardan mümkün olduğunca fazla sıvının çıkarıldığından emin olun. Dört santigrat derecede 20 dakika boyunca 1000 kez G'de santrifüjleme yoluyla bir T 75 doku kültürü şişesi pelet hücresinde 37 santigrat derecede% 10 FBS içeren RPMI 1640 ortamında şapka hücrelerini büyütün. Hücre peletini bir mililitre PBS'de yeniden süspanse edin ve 1.5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne aktarın.

Bir dakika boyunca 1000 kez G'de döndürün. Ardından peleti bir mililitre Anti-Flag lizisi içinde yeniden süspanse edin. Diferansiyel mikro santrifüjle nazikçe pipetleme ile tamponlayın.

Beş dakika boyunca 2000 kez G'de ve 10 dakika boyunca 13.000 kez G'de süspansiyonlar. Peletlemek için hücre kalıntısı ve DNA, sırasıyla süpernatanı toplayın, bundan sonra lizat olarak anılacaktır. Protein konsantrasyonunu belirledikten sonra, 20 mikrolitre Anti-Flag M iki afinite jeline bir miligram lizat proteini ve bir mikrogram SMR vahşi tip veya SMR mutant peptit ekleyin.

Bu afinite jeli bundan sonra reçine olarak anılır ve karışımı co IP tamponunda bir mililitrelik nihai hacme getirir. Ayrıca, her iki peptidin yokluğunda lizatın reçine ile birleştirildiği negatif bir kontrol hazırlayın. Karışımları gece boyunca dört santigrat derecede uçtan uca dönerek inkübe edin.

Ertesi gün reçineyi 30 saniye boyunca 5.000 ila 8.000 kez G'de mikro santrifüjleme ile peletleyin. Döndürme işleminden sonra, reçinenin tüpe yerleşmesini sağlamak için numuneleri tutmadan önce bir ila iki dakika bekleyin. Herhangi bir reçine aktarmamaya dikkat ederek süpernatanı dar uçlu bir pipet ucu veya bir Hamilton şırınga ile çıkarın.

Reçineyi dört kez resüsle yıkayın, 500 mikrolitre yıkama tamponunda süspanse edin, ardından mikro santrifüjleme yapın. Bağlı hücresel proteinleri elüte etmek için. 50 mikrolitre yıkama tamponunda tüpe 15 mikrogram fazla üç x bayrak peptit ekleyin ve 30 saniye boyunca 5.000 ila 8.000 kez G'de inkübasyon santrifüjünden sonra oda sıcaklığında 30 dakika boyunca bir rocker çalkalayıcı üzerinde inkübe edin.

Tüplerin iki dakika oturmasına izin verdikten sonra, atılan proteinleri içeren süpernatanı toplayın ve saklayın. EIT'leri aseton çökeltme ile konsantre ettikten sonra, numuneleri laly numune tamponunda kaynatın. Daha sonra proteinleri SDS sayfasına göre %40 ila 20 oranında ayırın, HCL kriteri prekast jel jeli kumasi brilliant blue R two 50 ile boyayın.

Ekteki belgede açıklandığı gibi savaş arabası protein dağıtım reaktif kitini kullanarak NGFP ve Antifa tubulin veya anti mortalite antikoru ile antikor inhibisyonu manşon transfect JCA hücrelerini değerlendirmek için, hasat edilen hücrelerden hücresiz şartlandırılmış ortamı toplayın. 100 mikrolitreyi 96 kuyulu siyah mikrotitre plakasının ayrı kuyucuklarına aktarın. Ardından, bağıl floresan birimlerinde uyarma dalga boyu 485 nanometre ve emisyon dalga boyu 515 nanometre olan bir florimetre kullanarak ortamdaki GFP floresansını ölçün.

Plakayı okuduktan sonra, verileri bir PC'ye aktarın ve anti-yağ tübülin kontrolündeki GFP floresan seviyesini %100'e ayarlayın Bunu, NEF GFP sekresyonundaki değişiklikleri belirlemek için anti mortalite antikoru ile transfekte edilen hücre karyolasından alınan ortamdaki GFP floresan seviyesiyle karşılaştırın HIV'in apoptotik motiflerini haritalamak için bu videoda anlatıldığı gibi bir NPH proteini peptit tarama analizi yapıldı. Y ekseni, tünel işaretli hücrelerin yüzdesini gösterir ve x ekseni, burada gösterildiği gibi tedavi durumunu gösterir, apoptozu indükleyen iki ayrı HIV bölgesi ve bir NEF tanımlanmıştır. Bunlar, neph peptitlerine maruz kalan hücrelerin artan tünel etiketlemesi ile gösterilir.

Apoptozun zirveleri, SMR vahşi tip peptitler, bir NPH GFP klonu ile kesilen sarsıntılı CAT T hücrelerinden kültür ortamı tarafından neph sekresyonunun rekabetçi inhibisyonunu değerlendirmek için motif bir ve motif iki ile gösterilir ve çeşitli SMR peptitleri, bir veya daha fazla vahşi tip NPH SMR dizisi motifi içeren ortam peptitlerinde GFP floresansı ile gösterildiği gibi ekzo omal NPH sekresyonu için test edildi, ekzo omal NEF sekresyonunu inhibe etti Bu bölgedeki herhangi bir amino asidin alanin replasmanı, peptitlerin etkinliğini büyük ölçüde azaltmıştır. Bu, SM R vahşi tip peptidin, neff'in apoptotik motifinin 11 amino asitle karıştırılmış bir versiyonu olan ekzo omal nph'yi inhibe ettiğini göstermektedir. Daha önce tarif edilen ve Sigma Genesis'ten elde edilen bir SM, negatif kontrol olarak kullanıldı ve ekzozomal NEP sekresyonu üzerinde hiçbir etkisi olmadı.

Kumasi lekeli SDS sayfa jelinin bu görüntüsü, 60, 65, 75 ve 250 kilodalton boyutlarında SMR vahşi tip peptit tarafından dört proteinin birlikte immünopresipitasyonunu göstermektedir. Negatif kontrol SMR mutant peptidi bu proteinleri yakalamadı ve bu proteinler afinite reçinesi ile spesifik olmayan bir şekilde etkileşime girmedi. SMR vahşi tip peptidin yokluğunda, bu sonuçlar, ülke çökeltilmiş proteinlerin, SMR vahşi tip peptidin SMR motifleri ile spesifik olarak etkileşime girdiğini göstermektedir.

Plaka okuyucu testi, anti mortal antikorun neph ekspresyonu plazmidi ile manyola transfeksiyonunun ekzoomal NPH sekresyonunu tamamen ortadan kaldırdığını göstermektedir. İlişkisiz antikorun ekzoomal ne sekresyonu üzerinde hiçbir etkisi yoktu. Bu sonuçlar, ekzoomal neph sekresyonu için sağlam bir NM yetenek etkileşiminin gerekli olduğunu göstermektedir.

Sonuç olarak, bu videoyu izledikten sonra, hedef proteinlerdeki fonksiyonel motifleri tanımlamak için tanımlama tekniklerinin nasıl kullanılacağı ve bu verilerin bu fonksiyonel motiflerin peptit baz inhibitörlerini geliştirmek için nasıl kullanılacağı konusunda iyi bir anlayış geliştirmiş olmalısınız. Co IP prosedürünü denerken, inkübasyon yıkamalarını gerçekleştirirken dikkatli bir şekilde dikkat etmeyi, inkübasyonlar sırasında boncukların uygun şekilde çalkalandığından ve her yıkama adımında boncuklardan mümkün olduğunca fazla sıvının çıkarıldığından emin olmayı unutmamak çok önemli olacaktır. Ayrıca hücre ve lizat sırasında reçine yıkamaları her zaman santrifüjlemeyi takiben reçinenin çökelmesine izin verir.

Dar uçlu pipet uçlarını kullanın ve arka planı kabul edilebilir seviyelere yeterince düşürmek için dört yıkama yapın.