Name: Erken evre Embriyolar verimli ve hızlı İzolasyon Arabidopsis thaliana Tohumlar (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: Öğrenin Arabidopsis thaliana tohumlarından erken evre embriyoları hızlı ve verimli bir şekilde izole etme yöntemini. Bu teknik transkriptom ve epigenom analizleri için araştırmacılara güçlü bir araç sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz embriyo izolasyon tavsiyeleri için Tal Nawy ve Martin Bayer teşekkür etmek istiyorum. MTR, VG, UG ve CB embriyo izolasyon ekipman geliştirmiştir. MTR, VG ve CB embriyo izolasyon protokolü geliştirdi. MTR, VG ve CB, protokol kurulan embriyolar izole ve oluşturulan embriyo cDNA, VG PCR, MTR GUS boyama, JJ FISH deneyler yaptı. MTR, VG, CG ve UG el yazması yazdı. Bu çalışma Zürih Üniversitesi, Roche Araştırma Vakfı (mtr) bir Bursu ve İsviçre Ulusal Vakfı (UG ve CB) hibe tarafından finanse edildi.

Bu prosedür, Şekil 1&#39;de gösterilen akış şeması özetlenmiştir. Mikrokapilerler ve etkili kurulum Şekil 2 ve Şekil 3&#39;te gösterilmiştir, ve embriyo izolasyon tipik aşamalar, Şekil 4 &#39;de gösterilmiştir. 1. Gereç ve Tampon Hazırlanması Cam mikrokapilerler 1.1 silikon kaplama <ol><li> Sigmacote (Sigma) ~ 5 ml, 15 ml Falcon tüp mikrokapilerler yerleştirin ve birkaç kez ters çevirin. </li><li> Çözüm çıkarın, 60 ° C de bir alüminyum folyo ile kılcal içeren Falcon tüp yerleştirin ve 3 saat için onları fırında Oda sıcaklığında saklayın. </li></ol> 1.2 ~ 50-100 mikron çaplı microcapillary ipuçları elde <ol><li> El ile bir Bunsen beki üzerinden veya ticari bir çektirmesi (dikey filament çektirmenin veya mikropipet çektirmenin) kullanarak ya 1 mm çaplı cam kılcal çekin. </li><li> Bir elmas kullanınuçlu kalem veya istediğiniz açılış oluşturmak için çekti kılcal ucu kesmek için bıçak. , Bir stereo mikroskop altında iyi şeklinde kılcal seçin. Açılış 50-100 mikron (Şekil 2) olması gerekmektedir. </li></ol> 1.3 Slayt hazırlanması <ol><li> 5 dakika boyunca Sigmacote (~ 1 ml / slayt) ile tüm kuyuları kaplayarak temiz slaytlar Siliconize, kaldırın. Alüminyum folyo ile fırında, 3 saat. Oda sıcaklığında saklayın. </li><li> % 10 SDS, nükleaz içermeyen su içinde 2 x 2 dakika (DEPC GKD 2 O otoklavlanmış),% 70 etanol içinde 2 dakika,% 100 etanol içinde 2 dakika, 10 dakika süreyle çok iyi bir cam mikroskop lamları yıkayın hava kurulayın. Tüm adımlar otoklavlanmış Coplin kavanoz içinde yapılır. Slaytlar her kullanımı arasında kapsamlı bir temizlik sağlayan birden çok kez yeniden kullanılabilir. </li><li> Hemen önce embriyo izolasyon yayılmasına ~ 10 0.5 ul mg / ml sığır serum albümin (BSA) her iyi ve hava-kuru tüm yüzey üzerinde bir pipet ile. </li></ol> 1.4 Mikroskop ve kılcal kurulum &lt;ol&gt; <li> 10x ve 20x büyütme hedefi ile ters bir mikroskop kullanın. Işık kontrast Optimize (embriyo oldukça şeffaf). </li><li> Mikroskop yanında kılcal cam tutmak için bir micromanipulator yerleştirin. Kılcal cam bir lastik tüp ile bir mikroenjektör (Şekil 3A) veya düzenli P-200 pipet bağlı (Şekil 3B, bu kurulum ayrıntılı bir açıklama için Tartışma bakınız). </li><li> Bir ~ 70 ° &#39;lik açıyla mikroskop lamı (Şekil 3) üzerinde kılcal yerleştirin ve görüş alanında açılması için konumunu ayarlamak. </li><li> Hemen önce embriyo izolasyon kadar sürebilir ve bırakın ~ 5-10 ul BSA (1 mg / ml) kat kılcal için. </li></ol> 1.5 Tamponlar Tablo 1, alt uygulamalara bağlı olarak izolasyon ve hedef tampon listeler. <ol><li> ~ Örnek başına 1 ml izolasyon tampon taze önce kullanmak ve buz üzerinde tutmak hazırlayın. </li><li> Buz (moleküler uygulamaları) ya da bir nemli odasında bir mikroskop lamı (sitolojik uygulamaları) bir 0.5 ml Eppendorf düşük bağlayıcı tüp hedef tampon hazırlayın. </li></ol> 2. Tohum Diseksiyon ve Embriyo Ekstraksiyon Tohum Geliştirme 2.1 Senkronizasyon <ol><li class="jove_content"> Çiçek erkekleştirmek ve diğer çiçeklerle maruz pistils temas kaçınarak onları iklim odasında 2 gün tutmak, sonra onları (örneğin 11) tozlaşmak. </li><li class="jove_content"> Temizlenir tohumların mikroskobik inceleme ile sizin büyüme koşullarında geliştirme aşamasında test edin. 4 DAP küresel vermiştir - büyüme koşullarına tohumları (DAP) tozlaşma sonra 2.5 gün toplanan (21 16 saat ışık ° C, 18 karanlık 8 saat ° C ve% 70 nem) özellikle 2-4 hücreli embriyo ve tohum 3,5 toplanan vermiştir embriyolar. </li></ol> 2.2 Tohum Diseksiyon ve Kopma <ol><li> S çıkarınforseps ve insülin iğneleri ile bir stereo mikroskop altında 10-15 meyvaları (~ 2.5 DAP) den eeds. </li><li> Buz üzerine yerleştirilir, 2 ml lik yuvarlak dipli Eppendorf tüp içinde 20 ul tampon içinde izolasyon tohum daldırın. </li><li> Yavaşça çekirdeği özütü bulutlu hale gelene kadar embriyo serbest bırakmak için bir plastik havaneli (DEPC GKD 2 O ile çalkalandı,% 10 SDS ile önceden temizlenmiş ve% 70 etanol ile yıkanmış) ile tohum kırmaktadır. Uygulamak için kuvvet deneme üzerine her kullanıcı tarafından belirlenecektir. </li><li> Havaneli yıkayın ve örnek sulandırmak için izolasyon tampon 300 ul ile havan eli durulayın. </li><li> Spin-aşağı 5 saniye için 5000 xg özü. Yavaşça yukarı ve aşağı 2-3 kez pipetleme pelet özü tekrar süspansiyon. </li><li> 30 mikron naylon örgü (PartecCelltricks gelen örneğin, tüp adaptörler monte) ile süzülür. Ek bir 200 ul izolasyon tamponu ile örgü durulayın. </li></ol> 3. Embriyo İzolasyon 3.1 Slayt hazırlanması <ol> &lt;li&gt; Yeri ters mikroskop sahnede temiz, BSA ile kaplanmış ve silikonlu çok iyi slayt, yukarı ve aşağı yavaşça pipetleme filtre çekirdeği ekstresi tekrar süspansiyon ve 1 veya 2 kuyulara 40-50 ul çekirdeği ekstresi 2 damlacıkları pipetle . Aynı anda sadece 1 veya 2 damla Eleme örnek buharlaşmasını önler. </li><li> Daha önce olduğu gibi hazırlanan farklı bir slayt iyi taze izolasyon tampon Sıra 50 ul (1. yıkama damla). Buharlaşmasını önlemek için üstü kapalı, nemli odasında bu slayt tutun. </li></ol> 3.2 Ekran, temiz, toplamak <ol><li> 10x büyütme amacı ile istenilen aşamada embriyo için çekirdeği ekstresinin damlacıkları ekran. Gerekirse, 20x büyütme ile sahne onaylayın. Embriyolar genellikle slayt dibine çöker. </li><li> Manuel bir tungsten iğne, bir insülin iğne veya benzeri ekipman ile embriyo etrafında pislikleri temizleyin. </li><li> Mikromanipülatör, t kullanarak embriyo yakın kılcal cam taşıyınmümkün olduğu kadar az çözüm olarak ile embriyo kadar AKE. </li><li> Birkaç embriyolar (örneğin tek bir damlacık) toplamak ve 1. yıkama damla (moleküler uygulama) veya hedef tamponu (sitolojik uygulamaları) bunları bırakın. Her toplama yuvarlak az hacmi (tüm toplama mermi toplam hacmi &lt;5 ul olmalıdır) toplanmalıdır 5-10 dakika ve embriyoların içinde tutulmalıdır. </li><li> Embriyoların istenilen miktarda (merkezi, mümkünse, hatırlama kolaylaştırmak için) 1. yıkama damla toplanan kadar tarama ve tahsilat tekrarlayın. </li><li> Yıkama damla (enkaz üzerinden yapılmaktadır eğer, hatırlama önce iğne ile bunları kaldırmak) için aynı anda tüm embriyolar hatırlamak. </li><li> 50 ul bir 2. yıkama damla içine embriyolar bırakın. 3.2.6 tekrarlayın. </li><li> Hedef tampon içinde embriyoların bırakın. Transfer kılcal ucu sadece bir kişi değil, daldırma, içermelidir. </li><li> Microcapil değiştirinBir sonraki örnek ları. </li></ol>

<ol><li>Gehring, M., Bubb, K. L., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensive+demethylation+of+repetitive+elements+during+seed+development+underlies+gene+imprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Extensive demethylation of repetitive elements during seed development underlies gene imprinting.</a> Science. 324, 1447-1451 (2009).</li>
<li>Muller, B., Sheen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokinin+and+auxin+interaction+in+root+stem-cell+specification+during+early+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cytokinin and auxin interaction in root stem-cell specification during early embryogenesis.</a> Nature. 453, 1094-1097 (2008).</li>
<li>Gehring, M., Missirian, V., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+analysis+of+parent-of-origin+allelic+expression+in+Arabidopsis+thaliana+seeds%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Genomic analysis of parent-of-origin allelic expression in Arabidopsis thaliana seeds.</a> PLoS One. 6, 23687-23 (2011).</li>
<li>NSF-Funded Seed Project of Goldberg & Harada Laboratories [Internet]. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://estdb.biology.ucla.edu/seed/">http://estdb.biology.ucla.edu/seed/</a> (2006).</li>
<li>Xiang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+reveals+gene+expression+and+metabolic+network+dynamics+during+embryo+development+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis reveals gene expression and metabolic network dynamics during embryo development in Arabidopsis.</a> Plant Physiol. 156, 346-356 (2011).</li>
<li>Nawy, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+GATA+factor+HANABA+TARANU+is+required+to+position+the+proembryo+boundary+in+the+early+Arabidopsis+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">The GATA factor HANABA TARANU is required to position the proembryo boundary in the early Arabidopsis embryo.</a> Dev Cell. 19, 103-113 (2010).</li>
<li>Baroux, C., Pecinka, A., Fuchs, J., Schubert, I., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+triploid+endosperm+genome+of+Arabidopsis+adopts+a+peculiar%2C+parental-dosage-dependent+chromatin+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">The triploid endosperm genome of Arabidopsis adopts a peculiar, parental-dosage-dependent chromatin organization.</a> Plant Cell. 19, 1782-1794 (2007).</li>
<li>Autran, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal+epigenetic+pathways+control+parental+contributions+to+Arabidopsis+early+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Maternal epigenetic pathways control parental contributions to Arabidopsis early embryogenesis.</a> Cell. 145, 707-719 (2011).</li>
<li>Wohrmann, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+DNA+methylation-independent+imprinting+control+region+at+the+Arabidopsis+MEDEA+locus%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Identification of a DNA methylation-independent imprinting control region at the Arabidopsis MEDEA locus.</a> Genes Dev. 26, 1837-1850 (2012).</li>
<li>Raissig, M. T., Baroux, C., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+and+Flexibility+of+Genomic+Imprinting+during+Seed+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Regulation and Flexibility of Genomic Imprinting during Seed Development.</a> Plant Cell. 23, 16-26 (2011).</li>
<li>Rea, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+DNA+methylation+of+imprinted+genes+in+Arabidopsis+endosperm%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Determination of DNA methylation of imprinted genes in Arabidopsis endosperm.</a> J. Vis Exp. 47 (47), e2327(2011).</li>
<li>SeedGenes Tutorial [Internet]. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.seedgenes.org/Tutorial.html#Nomarski_Optics">http://www.seedgenes.org/Tutorial.html#Nomarski_Optics</a> (2010).</li>
<li>Breuninger, H., Rikirsch, E., Hermann, M., Ueda, M., Laux, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression+of+WOX+genes+mediates+apical-basal+axis+formation+in+the+Arabidopsis+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Differential expression of WOX genes mediates apical-basal axis formation in the Arabidopsis embryo.</a> Dev Cell. 14, 867-876 (2008).</li>
<li>Kohler, C., Page, D. R., Gagliardini, V., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Arabidopsis+thaliana+MEDEA+Polycomb+group+protein+controls+expression+of+PHERES1+by+parental+imprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The Arabidopsis thaliana MEDEA Polycomb group protein controls expression of PHERES1 by parental imprinting.</a> Nature. 37, 28-30 (2005).</li>
<li>Epigenome NoE - protocol: Bisulfite sequencing of small DNA/cell samples [Internet]. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.epigenesys.eu/images/stories/protocols/pdf/20111026124522_p35.pdf">http://www.epigenesys.eu/images/stories/protocols/pdf/20111026124522_p35.pdf</a> (2007).</li>
<li>Fransz, P., De Jong, J. H., Lysak, M., Castiglione, M. R., Schubert, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interphase+chromosomes+in+Arabidopsis+are+organized+as+well+defined+chromocenters+from+which+euchromatin+loops+emanate%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Interphase chromosomes in Arabidopsis are organized as well defined chromocenters from which euchromatin loops emanate.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 14584-14589 (2002).</li>
<li>Morris, J., Singh, J. M., Eberwine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+analysis+of+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Transcriptome analysis of single cells.</a> J. Vis. Exp. (50), e2634(2011).</li>
<li>Nodine, M. D., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal+and+paternal+genomes+contribute+equally+to+the+transcriptome+of+early+plant+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Maternal and paternal genomes contribute equally to the transcriptome of early plant embryos.</a> Nature. 482 (7383), (2012).</li>
<li>Jefferson, R. A., Kavanagh, T. A., Bevan, M. W. G. U. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((fusions%3A+beta-glucuronidase+as+a+sensitive+and+versatile+gene+fusion+marker+in+higher+plants%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">fusions: beta-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants.</a> EMBO J. 6, 3901-3907 (1987).</li>
<li>Schmidt, A., Wöhrmann, H., Raissig, M. T., Arand, J., Gheyselinck, J., Gagliardini, V., Heichinger, C., Walter, J., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Polycomb+group+protein+MEDEA+and+the+DNA+methyltransferase+MET1+interact+in+Arabidopsis+to+repress+autonomous+endosperm+development%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">The Polycomb group protein MEDEA and the DNA methyltransferase MET1 interact in Arabidopsis to repress autonomous endosperm development.</a> Plant J. 73 (5), In Press (1111).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.

Biz etkili, hızlı bir embriyo izolasyon protokolü geliştirilmiş ve kolayca diğer laboratuarlara transfer edilebilir. Burada tanımlanan cihaz, bir ters mikroskop, bir mikromanipülatör, cam mikrokapilerler, dikey bir filaman çektirme ve mikroenjektör (Şekil 3A) oluşur. Kurulum transkriptomik analizleri 17 için tek bir hayvan hücre izolasyonu için tarif edilen yönteme benzerdir. Biz de başarıyla cam mikrokapilerler elle bir alev gerilir (ve bir elmas bıçak ile kesili...

Çiçekli bitkiler embriyo endosperm, ikinci bir gübreleme olay türetilen bir besleyici doku ile çevrilidir. Her ikisi de, embriyo ve endosperm çekirdek katının birkaç hücre tabakası ile çevrilidir. Toplu bu dokuların meyve içinde geliştirmek bir tohum, oluşturur. Böylece doku ve Arabidopsis embriyoların hücre spesifik analizleri güçlü bir şekilde erişilememesi nedeniyle bozulmaktadır. Bununla birlikte, geç-küresel ya da geç aşamalarında embriyo nispeten iyi stereomicroscope altında ince tungsten iğneler kullanarak manuel diseksiyon için uygun, ya da onları ayıklamak için forseps kullanarak tohum hafif baskı uygulayarak vardır. Bu tür teknikler, başarılı bir şekilde transkriptomunun veya mikrodizi hibridizasyon, bisülfit dizileme veya RNA sekansları (örneğin, 1-3) Epigenom profil analizleri için kullanıldı. Buna karşılık, erken küresel sahneye zigot de embriyoların çalışmalar teknik olarak zor kalır. Bugüne kadar, sadece birkaç çalışma temsilcisi varsabit tohum bölüm 4 veya ince araçlar 5 ile tohum içinde tek tek embriyo el çekiminden embriyonik dokuların ya lazer yakalama mikrodiseksiyon (LCM) kullanarak genç embriyolar üzerinde orted transcriptome analizleri. Ancak, LCM ekipman erken aşamalarında yaygın olarak bulunan ve manuel embriyo çıkarma değil zaman kolayca transfer edilemez mükemmel diseksiyonu becerileri tüketen ve gerektiren bir. Genom analizleri ek olarak, in situ gen ifade analizleri de Arabidopsis genç, tam monte edilen embriyoların gerçekleştirmek zordur. Bir dereceye kadar, genç embriyolar tohum hafif basınç ile mikroskop slaytlar yayınlanacak ve (örneğin 6,7 bakınız) immün tarafından bildirici gen deneylerinden veya protein tespiti için kullanılır. Bu teknik, ancak, bu nedenle kantitatif analizleri engelleyen, yüksek verimli embriyo izolasyon izin vermez. Bu nedenle, etkin ve hızlı bir protokol geliştirdi, kolay transfer, ve alt çeşitli uygulamalar için uygun kurmak için basit Arabidopsis tohum erken embriyo izolasyonu için. Uygun bir izolasyon tampon plastik bir havan tokmağı kullanılarak bir Eppendorf tüpü içinde genç meyvalarda gelen parçalanmış - temel ilkesi, yavaşça tohum ezmek için. Tohum ekstresi, çok oyuklu slayt damlalar halinde yerleştirilir ve bir ters mikroskop kullanılarak istenen aşamada serbest embriyoların varlığı için taranır. Embriyolar bir cam mikroenjektör veya standart laboratuvar pipet bağlı microcapillary kullanılarak toplanır. Moleküler uygulamalar için, embriyo az hacimde hedef tampon aktarmadan önce yeni izolasyon tampon damla içine tekrarlanan serbest iki kez yıkanır. Sitolojik uygulamaları (muhabiri deneyleri, immün, FISH) için, yıkama adımları atlanabilir. Bu yöntem çeşitli avantajlar sunmaktadır: (i) sitolojik uygulaması için ~ 45 dakika içinde 25-40 embriyolar üretirmoleküler uygulamaları (yıkama adımları dahil) Dokümanında veya 3-4 saat içinde, (ii) bu özel embriyonik aşamalarında izolasyonu, (iii) (iv), kolayca basit ayarları nedeniyle diğer kişi ve laboratuarlar için devredilemez sağlar , yükseltmeleri için uygun olan temel kurulum için uygun ekipman gerektirir, ve (v) başarıyla bu RNA sıralama 8, gen-spesifik DNA-metilasyon analizi 9, muhabiri testleri (10 ve Raissig ve ark. gibi çeşitli alt uygulamalar için kullanıldı olarak hazırlık.) ve FISH (J. Jaenisch, U. Grossniklaus, C. Baroux yayınlanmamış,) bkz. Şekil 5.

<table><tbody><tr><td colspan="4">REAGENTS</td></tr><tr><td>Sigmacote</td><td>SIGMA</td><td>SL2-100 ml</td><td></td></tr><tr><td>RNAse OUT</td><td>Invitrogen (yaşam teknolojileri)</td><td>10777-019</td><td></td></tr><tr><td>Birinci iplikli tampon</td><td>Invitrogen (yaşam teknolojileri)</td><td>18064-022</td><td>Superscript II paketinde bulunur</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Invitrogen (yaşam teknolojileri)</td><td>18064-022</td><td>Superscript II paketinde bulunan</td></tr><tr><td>Sığır serum albümini (BSA) 100x = 10 mg / ml </td><td>New England Biolabs, Inc.</td><td></td><td>Farklı tedarikçiler de çalışacak </td></tr><tr><td>İnce duvar Kılcal damarlar 1.0 mm</td><td>World Precision Instruments</td><td>TW100F-4</td><td></td></tr><tr><td>DNA LoBind tüpü 0.5 ml</td><td>Vaudaux-Eppendorf</td><td>0030108.035</td><td></td></tr><tr><td>CellTrics&#916; 30 &#956; m</td><td>PARTEC</td><td>04-0042-2316</td><td></td></tr><tr><td>5wells 10 mm çaplı kızaklar</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td>63421-10</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehit Çözeltisi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1635</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus slayt</td><td>Thermo Fisher</td><td>J1800AMNZ</td><td>Menzel-Gl&#228; ser</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Amaresco</td><td>0497</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Uygulaması</td><td>A2937</td><td></td></tr><tr><td>Glisin</td><td>Fluka</td><td>50050</td><td></td></tr><tr><td>SDS peletleri</td><td>Roth</td><td>CN30.3</td><td></td></tr><tr><td>Mikro Havaneli</td><td>VWR</td><td>431-0094</td><td></td></tr><tr><td>Mikro ince insülin şırıngaları</td><td>BD</td><td>U-100</td><td></td></tr><tr><td>DEPC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5758</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Schaurlau</td><td>ET00102500</td><td></td></tr><tr><td>Forseps N5</td><td>Dumont</td><td>0108-5</td><td></td></tr><tr><td>Biyoanalizör Pico Chip</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-1513</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">EQUIPMENT</td></tr><tr><td>Ters mikroskop</td><td>Nikon TMS (Japonya),</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipülatör</td><td>Leitz</td><td></td><td>Leica</td></tr><tr><td>Mikomanipülatör Direk montajlı LH1 probu</td><td>Leica mikrosistemler</td><td>39430101</td><td>Farklı marka da işi yapacak</td></tr><tr><td>Dikey filament çektirme Sutter</td><td>aleti</td><td>P-20 modeli</td><td>Diğer model de uygundur </td></tr><tr><td>Cell Tram vario</td><td>Vaudaux-Eppendorf</td><td>5176.000.033</td><td></td></tr><tr><td>Biyoanalizör</td><td>Agilent Technologies</td><td>2100</td><td></td></tr><tr><td>Qubit Fluorometer</td><td>Invitrogen (yaşam teknolojileri)</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

erken evre embriyolar verimli ve hızlı İzolasyon<em&gt; arabidopsis thaliana</em&gt; tohumlar

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

Endosperm - - anne tohum integuments (ya da tohum kabuğu) ile çevrili çiçekli bitkiler olarak, embriyo besleyici bir doku içinde gelişir. Sonuç olarak, erken dönemde (küresel sahneye 1 hücre) de bitki embriyoların izolasyonu teknik göreli erişilememesi nedeniyle zordur. Erken aşamalarında Verimli manuel diseksiyon güçlü genç Arabidopsis tohumların küçük boyutlu ve çevre dokulara embriyonun yapışma tarafından bozulur. Burada, biz aşağı uygulamaya bağlı olarak, 1 saat ile 4 saat içinde 40 embriyolar kadar verimli, genç Arabidopsis embriyoların verimli izolasyon sağlayan bir yöntem açıklanmaktadır. Embriyolar, hafif bir Eppendorf tüpü içinde plastik bir havan tokmağı ile 250-750 tohum ezilmesi izolasyon tampon salınır. Bir cam standart laboratuvar pipet ya bağlı microcapillary (bir lastik tüp ile) veya hidrolik kontrollü mikroenjektör damlacıkları yerden embriyo toplamak için kullanılırters ışık mikroskobu çok iyi slayt d. Gerekli teknik beceri basit ve kolay transfer edilebilir ve temel kurulum pahalı ekipman gerektirmez. Toplanan embriyolar gibi RT-PCR, RNA sekansları, DNA metilasyon analizleri, in situ hibridizasyon (FISH), floresan, immün ve haberci gen deneyleri gibi alt çeşitli uygulamalar için uygundur.

Moleküler yıkama uygulamaları için, örneğin, gerçekleştirilmesi durumunda eden embriyo izolasyon prosedürü (Şekil 1), 4 saat içinde 40 embriyo kadar izolasyonu sağlayan ya da bir saatten daha kısa bir süre içinde yıkama, ihmal sitolojik uygulamalar için, örneğin eğer. Gösterir Şekil 2, yüksek ve alçak kalite mikrokılcal uçlarına ve Şekil 3, embriyo izolasyon makinenin bir yapıyı göstermektedir. Şekil 4, bu tersine mikroskobunda embriyo...

Biz gelen geliştirmenin erken aşamalarında embriyo izole için etkili ve basit bir yöntem rapor<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Tohum. En fazla 40 embriyo alt uygulamaya bağlı olarak 1 saat ile 4 saat içinde izole edilebilir. Prosedür, DNA metilasyonu, muhabiri gen, immün ve floresan transcriptome için uygundur<em&gt; In situ</em&gt; Melezleme analizleri.

Erken evre Embriyolar verimli ve hızlı İzolasyon<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Tohumlar

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a ...

Bu prosedürün genel amacı genç bitki embriyolarını izole etmektir. Bu, önce tohumların parçalara ayrılmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, tohumları bir izolasyon tamponunda nazikçe ezmektir.Daha sonra embriyolar taranır ve daha sonra ters mikroskop altında mikro aspirasyon ile toplanır. Son aşama ise tüm embriyoların yıkandıktan sonra minimal hacimde tekrar toplanması ve hedef tampona aktarılmasıdır. Sonuç olarak, embriyolar, transkriptom veya epigenomu analiz etmek için RNA veya DNA ekstraksiyonu için kullanılabilir veya gen raportör tahlilleri veya floresan in situ hibridizasyon gibi sitolojik analizler için kullanılabilir.Bu tekniğin temel avantajı, bitki embriyolarını toplu halde ve belirli gelişim aşamalarında izole edebilmektir. Genel olarak, bu yönteme yeni başlayan bireyler, hızlı ve verimli bir şekilde uygulamak için herhangi bir sorun yaşamazlar. Başlamak için, daha önce silikonlaştırılmış, çekilmiş ve kesilmiş bir stereo mikroskop altında en iyi şekilli kılcal damarları seçin.Metin protokolünde açıklandığı gibi, açıklık düzgün ve yaklaşık 50 ila 100 mikron olmalıdır. Daha sonra, silikonlu çok kuyulu cam mikroskop slaytlarını deterjanla yıkamayı takiben coplin kavanozlarında %10 SDS'de 10 dakika yıkayın. Slaytları iki dakika boyunca iki kez yıkayın.Nükleaz içermez: suda,% 70 etanolde iki dakika,% 100 etanolde iki dakika ve sonra havayla kurutun. Daha sonra mililitre başına yaklaşık 0.5 mikrolitre 10 miligram, sığır serum albümini veya BSA'yı her bir kuyucuğun tüm yüzeyine bir pipetle yayın ve havayla kurutun. Ardından, embriyo izolasyon mikroskobunu hazırlayın.10 x ve 20 x büyütme objektifine sahip ters çevrilmiş bir mikroskop kullanın. Mikro kılcal damarı kaplamak için cam kılcal damarı bir mikro enjektöre bağlayın. Yaklaşık altı mikrolitre BSA alın ve bırakın.İstenilen gelişim aşamasında, ya haçları ya da kendi kendine döllenme tabanını takiben şıkları toplayın. Tozlaşmadan 2.5 gün sonra burada kullanılır ve iki ila dört hücreli embriyo içerir. Forseps ve insülin ile stereo mikroskop altında tohumları 10 ila 15 LIC'den çıkarın. Iğne.Tohumları 20 mikrolitre izolasyon tamponuna, buz üzerine yerleştirilmiş iki mililitrelik yuvarlak tabanlı bir tüpe daldırın. Tohum özü bulanıklaşana kadar embriyoları serbest bırakmak için metin protokolünde açıklandığı gibi önceden temizlenmiş plastik bir havaneli ile tohumları nazikçe ezin. Uygulanacak güç, deneme sırasında her kullanıcı tarafından belirlenecektir.Havaneli yıkamak ve numuneyi seyreltmek için havaneli 300 mikrolitre izolasyon tamponu ile durulayın. Santrifüjlemeyi takiben ekstraktı beş saniye boyunca 5.000 chi'de döndürün. Peletlenmiş özü iki ila üç kez yukarı ve aşağı pipetleyerek nazikçe yeniden süspanse edin.Ekstraktı, tüp adaptörlerine monte edilmiş 30 mikronluk bir naylon ağ ile filtreleyin ve tüpü sallayın. Ağı ek 200 mikrolitre izolasyon, tampon ve salınım ile durulayın. Yine. Embriyo izolasyonu için slaytlar hazırlamak için, ters çevrilmiş mikroskobun tablasına temiz bir BSA kaplı ve silikonlu çok kuyulu slayt yerleştirin.Kılcal damarı sürgünün üzerine yerleştirin ve açıklığın görüş alanında olması için konumu ayarlayın. Resus'tan sonra, süzülmüş tohum ekstraktını hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyerek 40 ila 50 mikrolitre tohum ekstraktından oluşan iki damlayı bir veya iki oyuğa pipetleyerek askıya alın. Bir seferde sadece bir veya iki damlanın taranması, numunenin buharlaşmasını önler ve 50 mikrolitre taze izolasyon tamponu daha önce olduğu gibi hazırlanmış farklı bir lam kuyusuna yerleştirilir.İlk yıkama damlası olarak hizmet etmek için. Buharlaşmayı önlemek için bu slaytı kapalı nemli bir odada saklayın. Gerekirse 10 x büyütme objektifi ile istenen aşamada embriyolar için tohum özü damlacıklarını tarayın.Sahneyi 20 x büyütme ile onaylayın. Embriyolar genellikle slaytın dibine batar. Bu prosedürün en önemli yönü, embriyoların minimum döküntü ile toplanmasıdır.Bu, bir tungsten iğnesi ile temizleyerek, potansiyel taşıma kalıntıları için yıkama damlasını dikkatlice kontrol ederek ve gerekirse wass'ı tekrarlayarak elde edilebilir. Embriyonun etrafındaki kalıntıları bir tungsten iğnesi, bir insülin iğnesi veya benzeri bir ekipmanla manuel olarak temizleyin. Mikro manipülatörü kullanarak cam kılcal damarı embriyonun yanına getirin ve embriyoyu mümkün olduğunca az çözelti ile alın.Birkaç embriyo toplayın ve ilk yıkamada serbest bırakın. Damla. Sitolojik uygulamalar için moleküler uygulamalar için, embriyolar doğrudan hedef tampona gidebilir. Her toplama turu beş ila 10 dakika içinde tutulmalı ve embriyolar minimum hacimde toplanmalıdır.İlk yıkama damlasında istenen miktarda embriyo toplanana kadar taramayı ve toplamayı tekrarlayın. Döküntüler yıkama damlasına taşınırsa, tüm embriyoları damladan bir kerede geri toplamadan önce bunları bir iğne ile çıkarın. Embriyoları 50 mikrolitrelik ikinci bir yıkama damlasına bırakın ve hatırlamayı tekrarlayın.Son olarak, embriyoları hedef tamponda serbest bırakın. Transfer, gösterilen kılcal ucun daldırılmasını değil, yalnızca bir teması içermelidir. İşte yıkamaları takip eden son damlada birkaç embriyo.İzole edilen bitki embriyoları artık embriyonik CD NA'yı kontrol etmek için çeşitli aşağı akış uygulamaları için kullanılabilir. Sıralamadan önceki kitaplıklar. Embriyo spesifik transkriptler amplifiye edildi. İşte CD NA'da PCR amplifikasyonunun sonuçları. İki ila dört hücreli embriyodan oluşan kütüphaneler bir kez yıkandı ve genomik DNA embriyo izolasyonunda, düşük embriyonik ekspresyonu olan raportör gen tahlillerinde çok yararlı olduğu kanıtlanmıştır ve burada gösterilen maternal tohum kabuğunun burada gösterilen algılamayı karıştırdığı durumlarda, Madea promotörü kontrolü altında bir GUS raportör genini eksprese eden bir embriyodur.Son olarak, C'de floresan, slaytlar üzerindeki akrilamid pedlere gömülü izole embriyolarda nükleer mimariyi incelemek için iki hibridizasyon uygulandı. Sentromer tekrarlarına ve nükleer alt düzenleyici bölgelere karşı probların kullanıldığı bir örnek burada gösterilmiştir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik, sitolojik uygulamalar için bir saatten daha kısa sürede, moleküler uygulamalar için üç saatten daha kısa sürede, tüm yıkama adımları dahil olmak üzere 30 embriyonun izolasyonuna izin verir.Aslında, bu teknik, bitki araştırma topluluğunun embriyogenezdeki genetik ve epigenetik mekanizmaları keşfetmesini sağlayacaktır.

efficient-rapid-isolation-early-stage-embryos-from-arabidopsis

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu video 14 günlük fide Arabidopsis dokuları bozulmadan protoplast izole etmek için bir prosedür gösterir. Izole protoplast en az 96h bozulmadan kalır ve bir aylık olgun bitkilerin yerine fide izole olduğunu göz önüne alındığında, bu yordamı sağlam protoplast gerektiren testleri hızlandırır.

14 gün eski Fideler Dokular protoplast izolasyonu Arabidopsis thaliana</em

Basma, bitki ve memeli üreme bir olgudur. DNA metilasyon, imprinting mekanizmaları önemli bir rol oynar. Endosperm Yalıtımlı ve baskılı genlerinin metilasyon durumunun...

Baskılı Genler DNA metilasyon Belirlenmesi Arabidopsis Endosperm

Biz Arabidopsis thaliana tohum tohum kat yatak tahlili (SCBA) monte prosedürü sunuyoruz. SCBA genetik ve in vitro keşfetmek için güçlü bir araç olduğu gösterilmiştir nasıl uyuyan tohum ve hafif uyaranlara yanıt olarak endosperm kontrolleri tohum çimlenme. SCBA endosperm embriyonik büyümeyi etkilemek için şüphelenilen her durumda altında uygulanabilir prensip olarak.

Genetiği keşfedin A Tohum Kabuğunun Yatak Deneyi<em&gt; In Vitro</em&gt; Nasıl Endosperminde Denetimler Çimlenme içinde<em&gt; Arabidopsis thaliana</em

Amaç, baklagil Medicago truncatula modelinin, baklagil olmayan Arabidopsis modelini tamamlamak için erken bitki embriyogenezinin düzenlenmesini araştırmak için kolayca kullanılabileceğini göstermektir. Pod morfolojisi, zigotik embriyogenez aşamaları ile bağlantılıdır ve doku kültürü kullanılarak embriyoların toplanması için bir protokol de sağlanır.

Model Baklagil Erken Embriyo Geliştirme Yönetmeliği incelenmesi için zigotik ve somatik embriyolar Elde protokolleri<em&gt; Medicago truncatula</em

Bu iletişim kuralı Arabidopsis içinde embriyogenez embriyo Desen oluşumu bir mikroskop altında incelenmesi ve ardından ovule izni ile gözlemlemek için bir yöntem özetliyor.

Embriyogenez Arabidopsis olarak karakterize bir yöntem

Arabidopsis çift döllenmede sperm nükleer morfolojisi temelinde epifloresan mikroskobu kullanılarak başarılı veya başarısız döllenmeyi belirlemek için bir yöntem gösterilmektedir.

Arabidopsis Çift Döllenmede Sperm Nükleer Morfolojisinin İzlenmesi ile Döllenme Durumunun Değerlendirilmesi

Arabidopsisthaliana (Arabidopsis) tohumlarının yüzey sterilizasyonu için yüksek verimli bir protokol sağlanır ve sıvı taşıma adımlarını vakum pompası ile inşa edilmiş basit bir emiş cihazı ile optimize eder. Bir günde yüzlerce tohum örneği yüzey sterilize edilebilir.

Arabidopsis Tohumlarının Yüzey Sterilizasyonu için Yüksek Verimli, Sağlam ve Son Derece Esnek Yöntem

Burada, Arabidopsis thaliana'da polen tüpü rehberliğini ve alımını gözlemlemek için ovüllerin alıcılığını artıran yarı in vitro (SIV) yöntemin geliştirilmesini açıklıyoruz. Yüksek verimli SIV cum septum yöntemi, dinamik döllenme sürecini izlemek için gametofit işaretleyici çizgileri ve genetik olarak kodlanmış biyosensörlerle birleştirilebilir.

Arabidopsis Polen Tüpü Alımı ve Çift Döllenmenin Semi-In Vitro Cum Septum Yöntemi Kullanılarak Canlı Görüntülenmesi

Arabidopsis thaliana'da polen hidrasyon profillerini ölçmek için geliştirilmiş bir yöntem burada açıklanmaktadır. Yeni yöntem daha yüksek çözünürlük sunar, invaziv değildir ve yüksek oranda tekrarlanabilir. Protokol, tozlaşmanın erken aşamalarını düzenleyen süreçlerin daha ince bir diseksiyonu için yeni bir aracı temsil etmektedir.

Arabidopsis thaliana için Yüksek Çözünürlüklü, Tek Taneli, In Vivo Polen Hidrasyon Biyotahlili

Bu protokol, Arabidopsis thaliana tohumlarında endosperm hücre tabakasının sağlam örneklerinin hazırlanmasını açıklar. Yöntem, yalnızca enjeksiyon iğnesi ve hassas forseps gibi yaygın laboratuvar ekipmanı gerektirir ve hem gelişmekte olan hem de olgun tohumlardaki endosperm hücrelerinin yüksek çözünürlüklü floresan canlı hücre görüntülemesini sağlar.

Gelişmekte Olan ve Olgun Arabidopsis Tohumlarında Endosperm Hücre Tabakasının Mikroskobik Analizi için Sağlam Dokunun Hazırlanması

Öğrenin Arabidopsis thaliana tohumlarından erken evre embriyoları hızlı ve verimli bir şekilde izole etme yöntemini. Bu teknik transkriptom ve epigenom analizleri için araştırmacılara güçlü bir araç sunar.

Erken evre Embriyolar verimli ve hızlı İzolasyon

Daha fazla video keşfet