Biyobozunur Plastik Malç Filmler Aşağı Breaking potansiyeli ile Yerli Toprak Mikroorganizmaların izolasyonu Tarımda Kullanılan
10 Mayıs 2013
Etiketli plastik film "biyolojik" malç olarak tarımsal kullanım için ticari olarak kullanılabilir. Toprak çekici bir bertaraf yöntemi temsil eder, ama saha şartlarında bozulma kötü anlaşılmaktadır. Bu çalışmanın amacı, alanında mezar sonra plastik malç filmleri kolonize yerli toprak mantar ve bakterileri izole etmek için yöntemler geliştirmektir.
Aşağıdaki deneyin genel amacı, biyolojik olarak parçalanabilen malç filmlerini kolonize eden ve bozan toprak mantarlarını ve bakterileri izole etmektir. Bu, ilk olarak, biyolojik olarak parçalanabilen malç filmlerinin, doğal toprak mikropları tarafından önemli ölçüde kolonizasyona izin verecek kadar uzun süre toprakta ağ torbalarda inkübe edilmesiyle elde edilir. İnkübasyonun ardından, malçlar ekstrakte edilir ve seyreltme ile kaplanır, bu da her kültürlenebilir yakından ilişkili mikrop türünün tek izole kolonilerini verir.
Daha sonra izole edilen mikroplar taze yüzeye, istila edilmiş, biyolojik olarak parçalanabilen malçlara ve ayrıca karbon kaynağı olan veya olmayan agar plakalarına yamalanır. Büyümeyi karşılaştırmak için, sonuçlar daha sonra sıvı ortamda doğrulanır. Sonuçlar, taramalı elektron mikroskobuna dayalı olarak belirli izolatlar tarafından kolonizasyon ve/veya bozunmayı gösterir ve jel geçirgenlik kromatografisi ile doğrulanabilir.
Tanımlanamayan mantar ve bakteri izolatları ile çalışmanın tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken eldiven giymek, kültür tüplerini ve tabaklarını kapatmak ve biyogüvenlik kabininde çalışmak gibi her zaman önlemler alınması gerektiğini unutmayın. Malç parçalarını toprakta inkübe ettikten ve metin protokolüne göre ortam ve reaktifleri hazırladıktan sonra, malç parçalarını dekontamine etmek için yeni malç parçalarını 4,25 santimetre kareler halinde kesin. Plastikten yapılanlar gibi otoklavlanamayan malç parçaları için değiştirmeyecek veya bozmayacaksa otoklavlayın.
Metin protokolüne göre bir biyogüvenlik kabini hazırladıktan sonra, malç parçalarını dekontamine edilmiş davlumbaza sıralar halinde yerleştirin ve malç parçalarını UV ışığı altında, temiz bir sterilize forseps kullanarak ve yeni dekontamine edilmiş yüzeylerin üzerine el ve kolları koymamak için ön sıradan başlayarak arkaya doğru çalışarak iki saat inkübe edin. Malç parçalarını ters çevirin, istila edilmiş tarafı aşağı bakacak şekilde temiz bir alana, UV ışığına maruz kalmış, ancak daha önce malçla temas etmemiş bir alana yerleştirin. Her iki tarafta iki saatlik UV tedavisinden sonra, tekrar önden arkaya doğru çalışın.
Malç parçalarını biyogüvenlik kabininden çıkarmak için steril forseps kullanın ve bunları folyo kaplı beherler gibi steril kuru kapaklı kaplara yerleştirin. Steril bir transfer başlığı altında oda sıcaklığında karanlıkta saklayın. Aseptik tekniği kullanarak, UV istilasına uğramış malç parçalarını agar plakalarının yüzeyine yerleştirin, önce bir köşeyi ve nazikçe yerleştirin ve kare rulonun geri kalanının agar ile temas etmesine izin verin.
Su geçirgen olmayan filmler için, hidrofobik plastiklerin ilk kolonizasyonu için bir su ve besin kaynağı sağlamak üzere malç parçalarının köşelerinin üzerine dört adet 10 mikrolitrelik erimiş yarı katı, minimal ortam damlası yerleştirin. Malç parçalarının yüzeyine dokunmayın. Pipet ucu ile damlalar boncuk boncuk sertleşecektir.
Katılaşması için kapalı plakaları gece boyunca oda sıcaklığında dik olarak inkübe edin. Daha sonra plakaları agar tarafı yukarı bakacak şekilde karanlıkta dört santigrat derecede saklayın. Biyo-tahliller için gerekli tüm malzemeler artık hazırlanmıştır ve toprağa gömülmüş malç parçalarından potansiyel malç bozunan mantarların izolasyonuna başlamaya hazırsınız.
Topraktan file torbaları kazın ve file torbalardan malç parçalarını çıkarın. Yüzeye yapışan toprağı rahatsız etmeden malçlardaki fazla toprağı nazikçe çıkarmak için steril bir spatula ve forseps kullanın. BDM filmini 0,5 gram malzeme geri kazanılana kadar bir santimetre karelik parçalar halinde kesin.
Her kopya numune transferi için, 0.5 gram malç parçası ve 25 mililitreye bağlı toprak. 9,5 mililitre PBS içeren kültür tüpleri, toprağa, yalnızca kontrol tüplerine veya malçın tamamen bozulduğu numunelere 0,5 gram toprak ekler, böylece herhangi bir biyofilmi parçalamak ve hücreleri malç parçalarından ayırmak gerekir. Tüpleri 30 saniye boyunca yüksek hızda girdaplayın, ardından 10 dakika boyunca bir su banyosunda sonikasyon yapın ve tekrar girdaplayın.
Bu, malç parçalarıyla ilişkili olan mikrobiyal hücrelerin homojen bir süspansiyonunu vermelidir. Numunelerin seri seyreltilmesi için. 4.5 mililitre steril PBS içeren bir kültür tüpü hazırlayın ve orijinal süspansiyon tüplerinden numune başına 450 mikrolitre PBS ile derin bir kuyu plakasının üç kuyusunu doldurun.
30 saniye boyunca yüksek hızda girdaplamadan sonra negatif üçüncü seyreltme için 5.0 çarpı 10 elde etmek için 4.5 mililitre steril PBS'ye 0.5 mililitre aktarın, 96 oyuklu plaka karışımında 450 mikrolitre PBS'ye 50 mikrolitre ekleyin. 5.0 çarpı 10 ila negatif altıya kadar seyreltmeler tamamlanana kadar tekrarlayın. Bakteri üremesini engellemek için kloramfenikol içeren PDA plakalarının agar yüzeyi boyunca seyreltmelerin her birinden 100 mikrolitreyi eşit şekilde yaymak için alevle sterilize edilmiş bükülmüş cam çubuklar kullanın. Sıvının emilmesi için plakaları 30 dakika dik olarak saklayın.
Ardından, tanımlanamayan izolatlardan kaçan sporları önlemek için plakaları paraform ile kapatın. Hem hızlı hem de yavaş büyüyen mantarların bir biyogüvenlik kabininde koloniler oluşturmasına izin vermek için ters çevrilmiş plakaları karanlıkta 20 santigrat derecede beş gün boyunca kuluçkaya yatırın. Tek bir steril kürdan kullanarak tek izole koloniler için seyreltme plakalarını inceleyin.
Bir koloniye nazikçe dokunun ve ardından plastik filmlerin üzerine agar boncuklarını aşılamak için mantar minimal ortamı, mantar minimal ortamı artı plastik ve glikoz minimal orta plakalarının agarına dokunun. Kürdanı agar noktasının yüzeyine nazikçe sürün ve ardından plastik film boyunca kaydırın. Dört tane olana kadar aynı kaynak koloniden aşılamayı tekrarlayın.
Plakaları beş gün boyunca karanlıkta 20 santigrat derecede inkübe ettikten sonra her plakadaki çizgileri çoğaltın. Malç parçaları üzerinde, agar dışında ilave karbon içermeyen minimum ortamda büyüdüklerinden daha iyi büyüyen izolatları belirlemek için plakaları karşılaştırın. Bunlar potansiyel malç bozunduruculardır.
GMM plakası, ortamın glikoz içerdiği pozitif bir kontrol plakası olduğu için en fazla büyümeyi içermelidir. Toprak izolatları bu noktada tamamen saf olmayabilir, bu nedenle mantardan aşılamayı kazımak için steril bir kürdan kullanın, malçları kolonize edin ve patates dekstroz agar üzerine izolasyon için çizin, ardından plakayı kapatın ve beş gün boyunca kuluçkaya yatırın. Beş günlük kuluçka döneminden sonra, tek izole koloniler ortaya çıkmış olacaktır.
Bu yeni saflaştırılmış kolonilerin, orijinal potansiyel olarak saf olmayan izolatlarla gözlemlenen, plaka biyo-tahlilinde buna benzer malç kolonizasyonu gösterdiğini onaylayın. Potansiyel malç bozundurucuları plaka biyotahlili ile tanımlandıktan sonra, bu son doğrulayıcı tahlilde sıvı bir biyo-tahlil kullanılarak doğrulanır, malç altında agar bile eksiktir. Parçalar, bir mikrobiyal izolatın her bir kopyası için başka herhangi bir ilave karbon içermeyen bir mantar ortamına yüzey olarak dezenfekte edilmiş bir malç parçasında tahlile başlamak için bu sıkı bir şekilde hazırlanmış ortamda mikrobiyal büyüme için gerçekten tek karbon kaynağıdır.
Aşılama için üç tüp hazırlayın. Birincisi, burada önceden belirlenmiş boyutta bir malç parçası içeren FMM etiketli beş mililitre minimal ortama sahip deneysel bir tüp. İki, karbon kaynağı olmayan beş mililitre minimum ortam ile negatif bir kontrol.
Ve üç, beş mililitre glikoz içeren sıvı ile pozitif bir kontrol. Burada GMM olarak etiketlendi. Ek olarak, test edilecek her bir malç içeren minimal ortamdan bir replika tüp hazırlayın, ancak aşılamayın.
Bu kontrol tüpü, taze sporları büyüttükten ve topladıktan sonra kontaminasyondan kaynaklanan herhangi bir mikrobiyal büyümeyi ortaya çıkaracaktır. Metin protokolüne göre, steril bir transfer başlığında önceden hazırlanmış kültür tüplerini bir milyon spor veya maya hücresi ile aşılayın, kapakları kapatın ve 20 santigrat derecede çalkalamadan karanlıkta inkübe edin. Büyüme için numuneleri haftalık olarak gözlemleyin.
Mantarların malç parçaları üzerindeki misel büyümesi, aşılamadan sonraki ilk hafta içinde, özellikle planktonik maya için malç parçalarının kenarlarında görülebilir, çünkü filamentli mantarların doğrudan malç parçalarına yapışması muhtemeldir, çünkü planktonik maya monitörü büyümesi 600 nanometredir. Büyümeyi gözle değerlendirin ve ışık mikroskobu ve/veya taramalı elektron mikroskobu ile sadece minimal ortam kontrollerinde onaylayın. Optik yoğunlukta bir değişiklik kaydetmek için çok küçük olan küçük beyaz esnekliği arayın.
Spektro fotometrik yöntemlerin kullanılması. Esnekliği aspire etmek için bir macun pipeti kullanın ve diferansiyel girişim kullanarak bunları gözlemleyin. Kontrast mikroskobu, plaka biyotahlilinde üç potansiyel malç bozunma izolatını hem yabani ot koruyucu adı verilen selülozik bir malçtan hem de pozitif kontrolümüz olan nişasta bazlı bir malçtan ve Biore adlı nişasta bazlı bir malçtan izole ettikten sonra.
68 gün boyunca sıvı biyotahlilde inkübe edildiler ve taramalı elektron mikroskobuna tabi tutulmadan önce hasat edildiler. Beklendiği gibi. Selüloz kontrol malçımızdaki izolatlar için çubuk şeklinde hücrelerin gözlendiği XX ve YY dışındaki tüm örneklerde mantar hijyeni gözlenmiştir.
FMM'de herhangi bir büyüme gözlenmedi, sadece burada BM aşılanmış kontrollerde gösterildiği gibi, yabani ot koruması artı bitki türevli liflerin malç kalıntı trakea elementleri, yalnızca bazı lifler üzerindeki sıralarda görülen hafif çukur işareti olarak tespit edilebildi, ancak selüloz kontrol malçımızın aşılanmış üç örneğinin hepsinde mantar hifi gözlendi. Trachey elemanları sadece SS örneklerinde açıkça görülebiliyordu, bu da selülozik materyalin sindiriminin, izolat SS'nin altındaki odunlaşmış trakea elementlerinin, nişasta bazlı plastik malç için sipariş gazlı içecekler içinde bir soda makinesi olarak 18 s ribozomal, DNA kullanılarak geçici olarak tanımlandığını ortaya çıkardığını düşündürüyor. İzolatlar, minimal ortamda önemli bir büyüme gözlenmedi, sadece izolatların kültür tüplerinde girdap oluştuğunda görülebilen tek beyaz özellikleri kontrol etti, VV ve ZZ, izole vv için diferansiyel girişim kontrast mikroskobu kullanılarak gözlendi.
Spesifikasyon, muhtemelen ilk aşılamadan kalan bir spor kütlesiydi. Zz'yi izole etmek için. Kütle, yaklaşık 0.2 milimetre çapında gevşek bir hifi ağından oluşuyordu, bu da orijinal spor aşısının filizlendiğini, ancak burada gösterilen kütlenin ötesine geçmediğini düşündürüyor.
Burada, nişasta bazlı plastik malç için BM aşılı kontrollerde görüldüğü gibi, engebeli bir doku gözlenir. Beyaz özelliklerin kimliği bilinmemektedir, ancak burada gösterilen izole VV tarafından kolonize edilmiş bir filmde yokturlar. Hem beyaz parçacıklar hem de yumrular, zz izolatı tarafından kolonize edilen bir filmde kaybolur.
Ek olarak, ikinci numune, BDM yüzey izolatları boyunca tek tip çatlaklar oluşumunu gösterdi. VV ve ZZ, hipo sırasına göre sırasıyla Penicillium ve ACE olarak s ribozomal DNA kullanılarak geçici olarak tanımlandı. Bu yöntem, tarım endüstrisi için plastik malçların biyolojik bozunması hakkında fikir verebilse de, çevrede biyolojik bozunması söz konusu olan diğer plastiklere de uygulanabilir.
Örneğin, deniz ortamına karışabilecek plastikler. Bunlar gıda endüstrisi için kullanılıyor mu? Ben.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu çalışma, yerli toprak mantarları ve bakterileri tarafından biyolojik olarak parçalanabilen malç filmlerinin kolonizasyonunu ve bozulmasını araştırmaktadır. Araştırma, saha koşullarında bu filmlerle mikrobiyal etkileşimlerin anlaşılmasını artırmayı amaçlamaktadır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Mikrobiyoloji
- Toprak Bilimi
- Tarımsal Uygulamalar
Arka Plan
- Tarımda biyolojik olarak parçalanabilen plastik filmler kullanılmaktadır.
- Toprak işleme gibi bertaraf yöntemleri daha fazla araştırılması gerekmektedir.
- Bu filmlerin mikrobiyal bozulması iyi anlaşılmamıştır.
- Mikrobiyal kolonizasyonun anlaşılması daha iyi tarımsal uygulamaları bilgilendirebilir.
Çalışmanın Amacı
- Biyolojik olarak parçalanabilen malç filmlerden yerli toprak mantarları ve bakterileri izole etmek.
- Bu mikroorganizmaların filmler üzerindeki kolonizasyon sürecini incelemek.
- İzole edilen mikropların bozulma yeteneklerini değerlendirmek.
Kullanılan Yöntemler
- Biyolojik olarak parçalanabilen malç filmlerinin toprakta örgü torbalarda inkübasyonu.
- Mikrobiyal kolonileri izole etmek için ekstraksiyon ve seyreltme plakası.
- İzole edilen mikropların taze biyolojik olarak parçalanabilen malçlara ve agar plakalara yama yapılması.
- Sonuçların taramalı elektron mikroskobu ve jel permeasyon kromatografisi kullanılarak doğrulanması.
Ana Sonuçlar
- Malç filmlerini kolonize eden toprak mikroplarının başarılı izole edilmesi.
- Mikroskop ile gözlemlenen mikrobiyal bozulma kanıtı.
- Sıvı ortamda yapılan karşılaştırma ile izolatların büyümesi doğrulandı.
- Sonuçlar, belirli izolatların kolonizasyona ve bozulmaya katkıda bulunduğunu göstermektedir.
Sonuçlar
- Yerli toprak mikropları, biyolojik olarak parçalanabilen malç filmlerin bozulmasında önemli bir rol oynamaktadır.
- Bu etkileşimlerin anlaşılması tarımsal uygulamaları iyileştirebilir.
- Bu mikropların tam potansiyelini keşfetmek için daha fazla araştırma gerekmektedir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
This method enables biopharma R&D teams to isolate and evaluate native microorganisms capable of degrading complex polymeric materials under environmentally relevant conditions. By using intact biodegradable films as the sole carbon source, the approach supports target validation for enzymatic activity and mechanistic de-risking in sustainable material development. It provides a disease-relevant system for assessing microbial contributions to polymer breakdown, informing lead identification and predictive confidence in biodegradability assays.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of microbial enzymatic capabilities for polymer degradation without requiring purified plastic feedstocks.
- Operational Value: Supports functional target validation by linking microbial growth to utilization of complex, additive-containing polymer films.
- Predictive Value: Facilitates mechanistic de-risking by identifying native isolates with intrinsic depolymerization activity under controlled conditions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative growth data on defined media where polymeric films are the exclusive carbon source, enabling comparative screening.
- Operational Value: Standardizes inoculum preparation and biofilm disruption protocols to improve reproducibility across microbial isolates.
- Platform Reuse: Adaptable to bacterial and fungal screening workflows by substituting media formulations, supporting cross-kingdom enzymatic discovery.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Uses scanning electron microscopy to visualize colonization and surface erosion, providing morphological evidence of polymer interaction.
- Operational Value: Enables longitudinal assessment of degradation over approximately ten weeks, supporting time-dependent efficacy profiling.
- Translational Continuity: Connects environmental isolate screening to downstream applications in waste management and sustainable material design.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the early discovery continuum, supporting hypothesis testing for microbial enzymatic function and enabling progression from environmental sampling to mechanistic characterization of polymer-degrading activities.
- Discovery Biology: Tests the hypothesis that native soil microbes can utilize complex polymeric films as a carbon source, clarifying functional pathways involved in degradation.
- Screening: Produces reproducible, quantitative growth readouts in liquid medium where films are the sole added carbon, supporting hit-to-lead progression.
- Analytics: Employs scanning electron microscopy and gel permeation chromatography to generate structural and molecular weight data for degradation assessment.
- Translational Research: Links environmental isolation to potential applications in agricultural waste reduction and circular material systems.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized platform for evaluating microbial degradation of diverse polymeric materials, reducing redundant assay development.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in microbial degradation capabilities by using environmentally relevant, intact polymer substrates.
- Operational Value: Enhances standardization through defined media, controlled inoculation, and standardized incubation conditions.
- Strategic Value: Reduces late-stage failure risk in biodegradable material development by enabling early-stage biological de-risking.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted prioritization of microbial leads based on demonstrated colonization and degradation potential.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microbiological isolation techniques, aseptic handling, and microscopic analysis.
- Dependent on access to biosafety cabinets, incubators, and microscopy equipment for colonization and degradation assessment.
- Necessitates cross-team standardization of soil extraction, dilution plating, and biofilm disruption protocols.
- Adaptation considerations include media optimization for bacterial versus fungal isolates and polymer-specific surface pretreatment.
- Practical limitation: The method does not provide quantitative rate comparisons for BDM degradation, limiting direct kinetic modeling.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:28
Preparation of Bioassay Materials: Surface Decontamination of Biodegradable Mulch Films
2:48
Plate Bioassay Setup
3:41
Isolation of Fungi
6:20
Initial Selection of Plastic-degrading Fungi
7:58
Stringent Confirmation of Plastic Utilization via Liquid Bioassay
10:21
Representative Biofilm Degradation Results
13:07
Conclusion
