Fare Pankreas Adacık İzolasyonu ve hücre içi cAMP Belirlenmesi için Bir Yöntem

Bu prosedürün genel amacı, çeşitli deneysel işlemlere yanıt olarak siklik A MP üretimindeki farklılıkları ölçmek için sağlıklı adalarcıkları izole etmektir. Bu işlem, önce pankreasın şişirilmesi ve ardından ikinci adımda pankreasın çıkarılmasıyla gerçekleştirilir. Sağlıklı adalarcıklar, bir dizi santrifüjleme ve yıkama işlemiyle izole edilir.

Ardından, canlı gözcuklar taze adacık kültür ortamına alınır ve gece boyunca inkübe edilmeye bırakılır. Son adımda, gözcuklar istenen deneysel işlemlere maruz bırakılır ve bir siklik A MP analizi gerçekleştirilir. Nihayetinde, gözcuklara uygulanan farklı işlemlere yanıt olarak siklik A MP üretimindeki değişimleri ölçmek için bir enzim immünosorbant analizi kullanılır.

Genellikle, bu yöntemde yeni olan kişiler, pankreasın tam olarak şişirilmesini sağlamak için çok fazla pratik gerektiğinden zorlanacaklardır. İlk olarak, bir şırıngayı ve kanülü beş mililitre kollajenaz çözeltisi ile önceden doldurun. Kanülün ucuna küt uçlu 30 gauge bir iğne takın ve şırınga ile kanül düzeneğini buz üzerine yerleştirin.

İnce bağırsağı farenin sağ tarafına kaydırdıktan sonra, ana safra kanalının sonunda yer alan ve ince bağırsağa açılarak beyaz bir üçgen oluşturan Odd sfinkterini bulun. Sfinkter konumlandırıldıktan sonra, bir çift 5 numara Dumont penseti alarak ucunu ana safra kanalının altına, ince bağırsağa mümkün olduğunca yakın şekilde kaydırın. Kanalı delmemeye dikkat edin.

İnce bağırsak ve bağ dokusunu deldikten sonra, dumont pensinin ucuyla sütürü kavrayın ve ana safra kanalının altına çekin. Sızıntıyı önlemek için düğümün sıkı olduğundan emin olarak, ana safra kanalını sphincter of OD'ye mümkün olduğunca yakın bir noktadan bağlayın. Ardından, ana safra kanalına bir miktar gerginlik uygulamak için sütürün her iki ucunu kavrayın ve kuyruk kısmına doğru çekin.

Ardından boşta kalan elinizle, ortak safra kanalının karaciğere giden son çatallanmasının hemen üzerinden, ortak safra kanalını gergin tutacak şekilde ipin iki ucunu tutarak mikro makasla küçük bir insizyon yapın. Şırıngayı ve kanülü buz kovasından çıkarın. Şırıngayı kenara koyun ve hazırlanan küt uçlu 30 gauge iğneyi kesi yerine yerleştirin.

Ana safra kanalı. Kanal duvarını delmemeye dikkat edilmelidir. Pankreasın tam olarak şişirilmesini sağlamak en zor kısımdır.

İyi sızdırmazlık sağlayan bir iğne kullanıyoruz. Eğer ilk iğne iyi bir sızdırmazlık sağlamazsa, 27 gauge iğne gibi daha büyük bir iğne kullanın. Şimdi, pankreasın ilk kısmı şişene kadar, şırınganın pistonunu yavaşça bastırarak basıncı pulsatif bir şekilde tahliye edin.

Pankreas artık şişmeyene kadar hafif ve sabit bir basınç uygulamaya devam edin. Başarılı bir şişirmede, eksokrin doku eşit şekilde dağılmış olacak ve pankreasın mide üzerindeki kısmı şişmiş olacaktır. Pankreası çıkarmak için, bir elinizdeki forsepsle ince bağırsağı sphincter of Oddi noktasından kavrayın.

Diğer elinizle, pankreasın bir kısmını ince bağırsaktan ayırmak için kavisli bir makasın kapalı ucunu yerleştirin. Makasın ucunu ince bağırsak boyunca pembe bağ dokusuna doğru hareket ettirin. Ardından, ince bağırsağı mideye bağlandığı yere yakın bir noktadan kaldırın ve pankreası ince bağırsağın geri kalanından kesin.

Pankreasın mümkün olduğunca büyük bir kısmını kavrayın ve nazikçe kaldırın. Kavisli makas yardımıyla, pankreas ile göğüs boşluğu arasındaki kalan bağlantıları kesin.

Pankreası tamamen çıkarmak için, çıkarılan her bir pankreası yaklaşık 2,5 mililitre kollajenaz çözeltisi içinde saklayın. Pankreasları yıkamak için buz üzerinde münferit 50 mililitre konik tüpler kullanın. İlk olarak, her bir pankreası 25 mililitre kollajenaz içeren yeni bir 50 mililitre konik tüpe aktarın.

Ardından, pankreasın bulunduğu 50 mililitrelik konik tüpleri, çalkalayıcısı kapalı haldeyken 220 ila 250 RPM arasında osilasyon yapabilen 37 degrees Celsius sıcaklığındaki bir çalkalamalı su banyosuna dik olarak yerleştirin. Şimdi, her bir 50 mililitrelik konik tüpü beş dakika boyunca %95 oxygen ve %5 carbon dioxide ile gazlayın.

Bir pastör pipeti yardımıyla her tüpün kapağını sıkıca kapatın ve tüpleri sallamalı su banyosuna, su yüzeyinin altında kalacak şekilde yan olarak yerleştirin. Altıncı dakikadan başlayarak, 16 dakikaya kadar her iki dakikada bir 20 saniye boyunca tüpleri 220 ila 250 RPM hızda sallayın. Sallama işleminden sonra, tüpleri oda sıcaklığında 400 ila 500 Gs hızda döndürün ve santrifüj tam hıza ulaştığında cihazı hemen kapatın.

Ardından, peleti rahatsız etmeden, bir vakum tuzağı kullanarak her tüpten yaklaşık 22.5 mililitre kollagenaz solüsyonunu aspire edin. Daha sonra peletleri 12.5 mililitre HBSS içinde yeniden süspande edin ve peletleri dağıtmak için tüpleri hafifçe vorteksleyin. Hücreleri yıkadıktan ve daha fazla HBSS ile vorteksledikten sonra, her bir hücre süspansiyonunu 1000 mikronluk bir süzgeçten geçirerek yeni, ayrı 50 mililitrelik konik tüplere aktarın.

Ardından hücre süspansiyonlarını tekrar santrifüjledikten sonra, bir vakum tuzağı kullanarak pelete zarar vermeden tüm HBSS'yi dikkatlice aspire edin. Tüm HBSS uzaklaştırıldıktan sonra, her tüpe 4,8 ml %25'lik F çağrı solüsyonu ekleyin. Peleti dağıtmak için vorteksledikten sonra, 50 ml'lik konik tüpü döndürerek 2,4 ml %23, %20,5 ve %11'lik flakon solüsyonunu tüpün kenarından dikkatlice dağıtın.

FI çağrı çözeltisi santrifüj edildikten sonra tabakaların eşit dağıldığından emin olmak için, ekzokrin doku peletini geride bırakmaya dikkat ederek tüm FI çağrısını yeni bir 50 milliliter konik tüpe aktarın. Yeni tüpe 50 milliliter çizgisine kadar buz gibi soğuk HBSS ekleyin. Ardından tüpü kapatıp dört ila altı kez ters çevirin.

FI çağrısı ile HBSS'yi birlikte karıştırmak için; gevşek peletleti rahatsız etmeden, vakum tuzağını kullanarak HBSS flakon karışımının çoğunu dikkatlice aspire edin. Ardından peleti yeni bir tüpe aktarın.

Göz halkalarını, göz halkası kültüre ortamı içeren bir Petri kabına aktarmak için bir pastör pipeti kullanın; bunu yaparken ASIN doku kalıntılarını aktarmamaya dikkat edin. Petri kabını, arkadan aydınlatmalı bir diseksiyon mikroskobunun üzerine yerleştirin.

Sağlıklı eyeletler küresel yapıda olacak ve altın kahverengiden koyu kahverengiye kadar değişen bir merkeze sahip olacaktır. ASIN'e veya dokuya bağlı olan, mat ve gri görünümlü tüm eyeletler kullanılmamalı ve atılmalıdır. Ayrıca, gecelik inkübasyon sonrası koyu renkli nekrotik bir merkez geliştiren daha büyük eyeletler, düzgün çalışmadıkları için atılmalıdır.

Eğer eyelet preparatı çok miktarda debris içeriyorsa, eyeletleri iki kez taze medyuma elle seçerek aktarın; eyelet kümelenmesini sınırlamaya yardımcı olması için sindirim tamponuna DNA ekleyin. Bu adıma, eyeletleri Petri kabının ortasına doğru döndürerek başlayın. Bir P 20 pipet kullanarak eyeletleri, glikoz içeren kültür medyumunu eyeletlerden temizlemek için beş mililitre ön inkübasyon çözeltisi içeren yeni bir 15 milimetre x 60 milimetre polistiren Petri kabına aktarın.

Ardından, tüpler arasında gözlet boyutu tutarlılığını koruyarak, P 20 pipet yardımıyla en az 13 gözleti, içinde bir mililitre taze gazlanmış Krebs ringer bikarbonat tamponu bulunan ayrı mikro santrifüj tüplerine aktarın. Numuneleri 37 °C ve %5CO2'de 45 dakika inkübe ettikten sonra, santrifüj tüplerinin kapağını kapatın, hızlıca vorteksleyin ve oda sıcaklığında masaüstü bir santrifüjde 7.000 ila 7.500 Gs'ye kadar döndürün. İnsülin veya başka bir metabolit istenen bir alt uygulama ise, bir mikro santrifüj tüpüne ortamdan bir alikot toplamak için P 1000 pipet kullanın. Stimülasyon ortamı toplanmayacaksa, ortam atılabilir.

Her bir mikro santrifüj tüpündeki Krebs çözeltisinin büyük kısmını uzaklaştırmak için P 1000 pipet kullanın ve eyelet pelletinin üzerinde yaklaşık 10 ila 15 µL Krebs bırakın. Ardından, pellete en yakın olan kısmı uzaklaştırmak için P 20 pipet kullanın. Son olarak, eyelet üzerinde 10 ila 15 µL'den daha az Krebs kaldığında, eyelet pelletlerini sıvı azot içerisinde şok dondurmaya tabi tutun.

Ardından, cAMP ölçümü yapılana kadar şok dondurulmuş peletleri -80 °C'de saklayın. Tipik olarak, bir ajanın cAMP üretimi üzerindeki etkisi, insülin sekresyonu üzerindeki etkisiyle doğrudan ilişkilidir. Bu deneyde, Wildtype veya gen nakavt farelerden izole edilen adacıklar 11,1 mM glikoz ile stimüle edilmiş ve hücre içi siklik.

cAMP üretimi ölçüldü ve toplam hücresel proteine göre normalize edildi. Salgılanan insülin, standart bir insülin ELISA'sı kullanılarak ölçüldü ve aynı zamanda toplam hücresel proteine göre normalize edildi. Beklendiği üzere, siklik AMP üretimindeki değişim, glukozla uyarılmış insülin sekresyonundaki artışla doğrudan korelasyon gösterdi.

Bu videoyu izledikten sonra, sağlıklı fare göz kristallerinden kültür izole edebilmeli ve cyclic a ve p seviyelerini ölçebilmelisiniz.